張 翠，王繼勝， 張根葆， 李 曙

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室；2.人體解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

芒果苷對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用

張 翠1，王繼勝2， 張根葆1， 李 曙1

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室；2.人體解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

目的：探討芒果苷對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)理。方法： 將SD大鼠分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組及芒果苷低、中、高劑量組，采用腹腔注射STZ的方法復(fù)制糖尿病模型，生化方法檢測(cè)大鼠血糖、血肌酐、尿蛋白、血和腎臟的SOD活性及MDA含量，ELISA法檢測(cè)各組血清及腎CTGF的表達(dá)，HE染色觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：與模型組比較，芒果苷各組大鼠血糖、血肌酐、24 h尿蛋白量明顯下降；血清及腎組織SOD活性升高，MDA含量顯著降低，血清及腎臟CTGF蛋白水平與糖尿病模型組相比顯著下降。結(jié)論：芒果苷能夠延緩糖尿病大鼠腎臟損傷，其機(jī)制可能與減輕腎臟氧化應(yīng)激程度及下調(diào)腎臟CTGF蛋白的表達(dá)有關(guān)。

糖尿病腎??；氧化應(yīng)激；芒果苷；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)作為糖尿病(diabetes mellitus，DM)嚴(yán)重的并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制仍未闡明，多項(xiàng)研究證明，活性氧(reactive oxygen species,ROS)在DN發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1]，即糖尿病代謝紊亂致ROS 增加，使多種信號(hào)通路如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protain kinase,MAPK) 、核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)活化增加而導(dǎo)致DN發(fā)生發(fā)展，因此，抗氧化藥物為DN患者提供了新的防治方向。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)的下游因子,能夠介導(dǎo)TGF-β促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)積聚，在DN腎小球硬化和間質(zhì)纖維化中發(fā)揮重要作用。芒果苷是一種四羥基毗酮的碳糖苷，具有多種作用如抗炎、抑制腫瘤及抗氧化損傷等[2-4]，并能在一定程度上改善糖尿病并發(fā)癥[5]，而有關(guān)芒果苷對(duì)糖尿病腎病保護(hù)作用的報(bào)道尚少。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組大鼠腎臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)、相關(guān)生化指標(biāo)改變及腎組織CTGF 的表達(dá)情況，旨在探討芒果苷在延緩糖尿病腎病中的作用及相關(guān)機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 主要材料 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma公司；血糖檢測(cè)試劑盒購自長(zhǎng)春迪瑞實(shí)業(yè)有限公司；芒果苷(批號(hào)130718)、CTGF檢測(cè)試劑盒(ELISA)購自合肥博美生物有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD) 、丙二醛(malonaldehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒、考馬斯亮蘭檢測(cè)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自蘇州市工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司,許可證號(hào)：SCXK(蘇)2009-0001。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的制備 禁食12 h后，將溶于無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)的1%STZ溶液，經(jīng)大鼠腹腔注射(60 mg/kg)，48 h后采用利舒坦血糖儀測(cè)大鼠靜脈空腹血糖，血糖值≥13.8 mmol/L即視為造模成功。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 造模成功的大鼠隨機(jī)分為4組，即糖尿病模型組(DM組)及芒果苷低(MG-L)、中(MG-M)、高劑量(MG-H)組。DM組給予生理鹽水2 mL/d 灌胃，MG低、 中、高劑量組分別給予芒果苷12.5 mg/(kg·d)、25 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)灌胃，另隨機(jī)選擇正常大鼠作為對(duì)照組(NC組)，生理鹽水2 mL/d 灌胃，以上5組大鼠每組8只。

1.3.3 標(biāo)本收集 飼養(yǎng)8周后采集標(biāo)本，動(dòng)物空腹后，經(jīng)腹腔注射1.5%的戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈穿刺取血離心后，分裝血清備用。取腎臟稱重，計(jì)算腎臟肥大指數(shù)(腎質(zhì)量/體質(zhì)量)，一側(cè)腎臟置4%的中性甲醛溶液中固定，用于HE染色；另一側(cè)置-80℃保存，以檢測(cè)腎臟MDA含量、SOD活性及CTGF水平。

1.3.4 血糖、血肌酐、尿蛋白的檢測(cè) 氧化酶法測(cè)血糖；SOD 活性采用羥胺法測(cè)定；采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA) 法測(cè)MDA含量；堿性苦味酸法測(cè)血肌酐；考馬斯亮蘭法測(cè)尿蛋白量。

1.3.5 大鼠血清及腎臟CTGF的檢測(cè) ELISA法測(cè)大鼠血和腎臟CTGF水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè),免疫酶標(biāo)儀上讀取吸光度A 值(波長(zhǎng)450 nm),所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.3.6 形態(tài)學(xué)檢測(cè) HE染色比較各組腎組織形態(tài)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài) 模型組大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿的典型糖尿病表現(xiàn)并逐漸明顯，腎質(zhì)量體質(zhì)量比值明顯增大；芒果苷治療組糖尿病表現(xiàn)減輕，腎質(zhì)量體質(zhì)量比值較模型組明顯下降，見表1。

組別腎質(zhì)量/g體質(zhì)量/g腎質(zhì)量×1000/體質(zhì)量NC2.37±0.31378.50±33.866.26±0.70DM2.21±0.30168.75±19.72##13.18±1.94##MG-L2.27±0.26246.88±26.05**9.26±1.36**MG-M2.28±0.18261.75±31.69**8.84±1.35**MG-H2.35±0.21287.38±26.97**8.24±0.97**F0.5358.1028.76P0.7150.0000.000

##：與NC組比較，P<0.01;**：與DM組比較，P<0.01。

2.2 各組大鼠血糖、24 h尿蛋白及血肌酐的比較 如表2所示，糖尿病大鼠血糖、血肌酐、24 h尿蛋白量明顯高于正常對(duì)照組，而芒果苷治療各劑量組均明顯下降。

組別BG/(mmol/L)Scr/(μmol/L)24hUP/mgNC5.91±1.2758.76±8.936.49±1.65DM24.50±4.76##170.75±26.94##63.74±13.41##MG-L20.10±2.67*121.81±16.11**38.15±9.76**MG-M18.03±3.12**107.42±16.14**25.94±7.61**MG-H13.11±2.37**92.37±10.85**14.95±4.38**F43.3247.7541.82P0.0000.0000.000

##：與NC組比較，P<0.01;*：與DM組比較，P<0.05；**：與DM組比較，P<0.01。

2.3 各組大鼠血清SOD活性及MDA含量比較 糖尿病組大鼠血清SOD活性與正常對(duì)照組比較明顯降低，MDA含量顯著升高，而芒果苷干預(yù)組大鼠的SOD活性較糖尿病組有顯著提高，同時(shí)MDA含量明顯下降，見表3。

組別SOD/(U/mL)MDA/(nmol/mL)NC184.93±22.534.67±0.91DM115.26±16.02##6.71±1.33##MG-L139.06±17.12*5.62±0.52*MG-M150.51±17.81**5.39±0.84*MG-H165.71±22.14**5.16±0.60**F14.955.87P0.0000.001

##：與NC組比較，P<0.01;*：與DM組比較，P<0.05；**：與DM組比較，P<0.01。

2.4 各組大鼠腎臟SOD活性及MDA含量比較 模型組大鼠腎SOD活性與對(duì)照組比較明顯降低，MDA含量顯著升高，而芒果苷組大鼠腎SOD活性較模型組有顯著提高，同時(shí)MDA含量下降，見表4。

組別腎SOD/(U/mg.protein)腎MDA/(nmol/mg.protein)NC84.53±9.762.93±0.49DM44.76±7.78##4.80±0.56##MG-L58.08±8.60**3.99±0.58*MG-M65.23±7.43**3.48±0.34**MG-H68.93±8.92**3.14±0.48**F23.3726.17P0.0000.000

##：與NC組比較，P<0.01;*：與DM組比較，P<0.05；**：與DM組比較，P<0.01。

2.5 各組大鼠血清CTGF及腎臟CTGF的比較 與正常對(duì)照組比較，糖尿病大鼠血清及腎組織CTGF表達(dá)水平顯著增高；而芒果苷干預(yù)組大鼠血清及腎組織CTGF表達(dá)水平明顯下降，見表5。

2.6 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的比較 DM模型組腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，基底膜不完整，部分腎小管結(jié)構(gòu)不清。芒果苷干預(yù)組，隨給藥劑量的增加腎臟損傷有所減輕，高劑量治療組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)接近正常，如圖1。

組別血清CTGF/(ng/L)腎臟CTGF/(ng/L)NC2.07±0.4312.02±2.16DM4.57±1.08##27.20±4.09##MG-L3.60±0.59*22.34±4.03*MG-M3.28±0.61*21.32±3.46**MG-H3.01±0.32**19.95±3.15**F15.1220.38P0.0000.000

##：與NC組比較，P<0.01；*：與DM組比較，P<0.05；**：與DM組比較，P<0.01。

3 討論

DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，高血糖是其發(fā)生發(fā)展的主要決定因素，本研究結(jié)果顯示，芒果苷治療組大鼠空腹血糖與DM模型組相比明顯下降，提示芒果苷能夠降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的空腹血糖，延緩DN進(jìn)展，與以往報(bào)道一致[6-7]。

多項(xiàng)研究證明，氧化應(yīng)激在DN發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。芒果苷既能通過絡(luò)合作用抑制氧自由基的生成，又可直接清除自由基，從而表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化作用[8]。糖尿病時(shí)的高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞和小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生過多的ROS,而抗氧化的SOD、CAT等的水平下降，造成腎臟氧化損傷，已有報(bào)道，芒果苷能修復(fù)STZ誘導(dǎo)的腎臟氧化損傷[9]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到，經(jīng)芒果苷干預(yù)的大鼠血清及腎組織中抗氧化酶SOD活性明顯增高，而MDA含量相應(yīng)減少，提示芒果苷能夠提高DM大鼠腎臟的抗氧化酶活性，減輕DM狀態(tài)下腎臟的氧化應(yīng)激損傷。

圖1 各組腎組織形態(tài)比較(HE,×400)

DN特征性病理改變?yōu)槟I小球硬化及間質(zhì)纖維化，多種細(xì)胞因子參與其病變的發(fā)生發(fā)展。CTGF作為TGF-β下游的促纖維化因子，在上述兩種病理過程中起了重要作用。糖尿病時(shí)的高糖、TGF-β過表達(dá)等因素可誘導(dǎo)CTGF在多種組織表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)ECM在間質(zhì)沉積,參與DN腎臟纖維化過程[10]。此外，在沒有TGF的條件下，CTGF也可直接上調(diào)膠原、纖溶酶原激活物抑制因子及黏連蛋白在系膜細(xì)胞外的積聚[11]，說明CTGF也可不依賴于TGF-β而發(fā)揮其致纖維化作用。糖尿病大鼠腎小管CTGF分泌明顯增多，促進(jìn)腎小管間質(zhì)FN等細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多,使腎臟肥大和纖維化[12]。辛伐他汀能夠下調(diào)糖尿病腎病大鼠腎小管間質(zhì) CTGF表達(dá)，延緩腎小管間質(zhì)纖維化[13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血CTGF水平與DN嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[14]。以上研究表明，CTGF在糖尿病腎臟纖維化中起重要作用，因此抑制CTGF的表達(dá),可能延緩DN腎臟損傷。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA法檢測(cè)DM大鼠血及腎組織勻漿中CTGF蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，DM大鼠血及腎組織CTGF蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，而治療組CTGF蛋白表達(dá)明顯降低，提示芒果苷能夠抑制DM大鼠腎臟CTGF的表達(dá)，從而延緩DN的發(fā)展進(jìn)程。

本研究顯示，芒果苷能夠降低DM大鼠空腹血糖、減輕腎臟氧化應(yīng)激程度、減少腎組織CTGF表達(dá)，并能使DM大鼠腎質(zhì)量體質(zhì)量比值下降、血肌酐和24 h尿蛋白量減少，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，我們推測(cè)芒果苷對(duì)糖尿病大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用。

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Protective effects of mangiferin on the diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats

ZHANG Cui,WANG Jisheng,ZHANG Genbao,LI Shu

Department of Pathophysiology，Wannan Medical College，Wuhu 241002，China

Objective：To investigate the protective effect of mangiferin on diabetic nephropathy and the potential mechanisms in diabetic rat models induced by streptozotocin(STZ).Methods：Healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into group of normal controls,diabetic models,diabetic models treated with mangiferin in low,middle or high dose.Diabetic rats were induced by intraperitoneal injection with STZ.Biochemistry was used to determine the blood glucose，serum creatinine,urine protein,activities of superoxide dismutase(SOD) and catalase in serum and kidney as well as content of malonaldehyde(MDA) in the kidney,and ELISA was performed to assay the connective tissue growth factor(CTGF) expression in the kidney.The renal tissues were stained with HE and observed by microscopy.Results: Diabetic rats treated with mangiferin had significantly decreased levels of blood glucose,serum creatinine and 24-hour urine protein,yet markedly increased SOD activity in the serum and the kidney and reduced MAD level compared to the simple model rats.The levels of CTGF in renal cortex were dramatically decreased in rats treated with mangiferin compared with diabetic models and normal controls.Conclusion: Mangiferin may delay the kidney injury in diabetic rats.The potential mechanisms may be associated with decreased oxidative stress and down-regulated expression of CTGF protein in renal tissues of diabetic rats induced by STZ.

diabetic nephropathy；oxidative stress；mangiferin；connective tissue growth factor

1002-0217(2017)04-0314-04

安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2013B315)；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(gxyqZD2016172)

2017-03-02

張 翠(1981-)，女，講師，碩士，(電話)0553-3932476,(電子信箱)zhangcui2006@sina.com； 李 曙，男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)wylishu@wnmc.edu.cn，通信作者。

R 285.5

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.04.003