2017年第1季度7種豬傳染病實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測數(shù)據(jù)分析

圖1 樣品分布

2017年1～3月份，通過全國20個省市68個規(guī)模豬場的181份病料(肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等組織)樣品和99份(糞便或腸道組織)樣品，采用PCR和RT-PCR方法對7種病毒類疾病病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(PoRV)等進(jìn)行檢測。

通過對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析得知，CSFV陽性檢出率(1/159)0.63%，PRRSV陽性檢出率(44/170)25.88%，PCV2陽性檢出率(36/136)26.47%，PRV陽性檢出率(8/147)5.44%，PEDV陽性檢出率(48/99)48.48%，TGEV陽性檢出率(0/93)0.00%，PoRV陽性檢出率(3/88)3.41%。其中PRRSV、PCV2、PRV、PEDV、PoRV等5種病原檢出率高，仍是危害規(guī)模豬場的主要病原。CSFV、TGEV檢出率低，說明豬場控制得較好。2017年我國規(guī)模豬場要把PRRSV、PCV2、PRV、PEDV及PoRV等5種常見病毒類疾病病原作為防控重點(diǎn)，但混合感染和新毒株出現(xiàn)是目前疫病防控的難點(diǎn)，建議豬場加強(qiáng)疫病監(jiān)測，優(yōu)化防疫方案，避免防疫誤區(qū)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及分布

樣品來源于全國20個省市，樣品包括肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等組織以及腸道內(nèi)容物和糞便，通過調(diào)查了解豬場免疫背景和臨床發(fā)病情況以及剖檢典型發(fā)病豬取組織樣品，-20℃冷凍送檢。

1.2 主要試劑和儀器

PCR和RT-PCR擴(kuò)增試劑盒、飽和酚、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEP水、TRIZOL(總RNA抽提試劑，主要成分苯酚等)、DL2000 Marker、TaKaRaRNA PCRKit(AMV) Ver.3.0均購自寶生物工程(大連)有限公司。生物安全柜、分析天平、高速離心機(jī)、迷你掌上離心機(jī)、渦旋振蕩器、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、冰箱、微波爐、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank登陸的PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV、PoRV的基因序列，用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列見表1。

1.4 樣品處理及核酸提取

按檢測需求分別取肺臟、脾臟、淋巴結(jié)樣品混合，對腸內(nèi)容物和糞便混合用研磨器充分研磨，利用MEM營養(yǎng)液進(jìn)行10倍稀釋，然后利用DNA和RNA提取試劑盒進(jìn)行核酸抽提。

1.5 病毒核酸檢測

1.5.1 PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV、PoRV的擴(kuò)增 分別用BIOZOL總RNA提取試劑盒(博日公司)從病毒培養(yǎng)液提取總RNA為模板，采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件RT：50℃ 30min，94℃ 2min；PCR：(94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min)×35個循環(huán)，72℃延伸7min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5.2 PRV、PCV2的擴(kuò)增 分別用天根生物科技有限公司DNA提取試劑盒，從病毒培養(yǎng)液提取DNA為模板，采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件94℃ 2min；(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min)×35個循環(huán)，72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 用于PCR和RT-PCR反應(yīng)的引物

2 結(jié)果與分析

圖2 2017年1～3月各常見病毒檢出率統(tǒng)計(jì)

圖3 2017年1～3月PRRSV與其他病毒混合感染變化

2.1 PCR或RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1 2017年第1季度(1月份、2月份、3月份)對20個省68個規(guī)模豬場送檢181份肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等組織樣品與99份腸道內(nèi)容物、糞便等組織樣品，分別進(jìn)行了PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV、PoRV等7種病原的檢測。結(jié)果顯示，CSFV(1/159)陽性檢出率0.63%，PRRSV(44/170)陽性檢出率25.88%，PCV2(36/136)陽性檢出率26.47%，PRV(8/147)陽性檢出率5.44%，PEDV(48/99)陽性檢出率48.48%，TGEV(0/93)陽性檢出率0.00%，PoRV(3/88)陽性檢出率3.41%。7種常見感染豬的病原中PEDV、PCV2、PRRSV、PRV等4種病原檢出率明顯高于其他3種病原，其中TGEV檢出率最低(如圖2)。2.1.2 對44份檢測到PRRSV陽性樣品統(tǒng)計(jì)PRRSV單獨(dú)感染和PRRSV與PCV2、PRV、PEDV等病原混合感染情況。PRRSV與PCV2的混合感染檢出率40.91%，PRRSV單一檢出率為59.09%。未檢出與除PCV2其他病原的混合感染情況(如圖3)。

2.1.3 對36份PCV2抗原陽性樣品統(tǒng)計(jì)PCV2與PRRSV、CSFV、PRV、PEDV等病原混合感染情況，PCV2單獨(dú)感染和PCV2與PRRSV、PRV、PEDV等混合感染情況。其中PCV2單一檢出率占50.00%，PCV2與PRRSV混合感染檢出率為50.00%(如圖4)。

圖4 2017年1～3月PCV2與其他病毒混合感染變化

圖5 1季度CSFV、PRRSV、PRV、PCV2四種病毒檢出率動態(tài)變化

圖6 PEDV、TGEV、PoRV三種病毒檢出率動態(tài)變化

圖7 2017年1～3月與2016年1～3月病原陽性檢出率對比

2.1.4 2017年送檢樣品中CSFV在第1、2、3月份檢出率分別為0.00%、0.00%、1.64%，檢出率均較低。PRRSV在第1、2、3月份檢出率分別為58.00%、14.81%、10.61%，檢出率較高，1、2、3月份呈明顯下降趨勢。PRV在第1、2、3月份的檢出率分別為4.08%、4.55%、7.41%。PCV2在第1、2、3月份檢出率分別為37.84%、15.38%、26.67%，檢出率最高為1月份，其次為3月份。檢出率的動態(tài)變化如圖5。

2.1.5 2017年1季度送檢腸道內(nèi)容物和糞便中PEDV在第1、2、3月份的檢出率分別為22.86%、87.10%、39.39%，檢出率均較高，尤其2月份檢出率明顯高于1、3月份。TGEV在第1、2、3月份的檢出率均為0.00%。PoRV在第1、2、3月份的檢出率分別為6.25%、0.00%、3.57%，顯著低于PEDV(如圖6)。

2.1.6 比較2016年1～3月份與2017年1～3月份7種病原檢出率的變化顯示，2016年1～3月份CSFV檢出率0.87%，2017年1～3月份0.63%略有下降。PRRSV檢出率由2016年1～3月份的28.57%下降2017年1～3月份的25.88%。PCV2檢出率由2016年1～3月的34.82%下降至26.47%。PRV的檢出率由2016年1～3月份的13.64%下降為5.44%。PEDV檢出率由46.07%上升至48.48%。TGEV檢出率由2016年同期的4.88%下降到0.00%。PoRV檢出率由2016年同期0.00%上升到3.41%(如圖7)。

3 討論

3.1 2017年1～3月份通過對68個規(guī)模豬場的181份肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等組織樣品和99份糞便或腸道組織，采用PCR和RT-PCR方法對常見7種病毒類疾病病原檢測和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析得知，CSFV陽性檢出率(1/159)0.63%，PRRSV陽性檢出率(44/170)25.88%，PCV2陽性檢出率(36/136)26.47%，PRV陽性檢出率(8/147)5.44%，PEDV陽性檢出率(48/99)48.48%，TGEV陽性檢出率(0/93)0.00%，PoRV陽性檢出率(3/88)3.41%。其中PRRSV、PCV2、PRV、PEDV、PoRV等5種病原檢出率高，仍是危害規(guī)模豬場的主要病原。CSFV、TGEV兩種病原檢出率低，說明豬場控制得較好。

3.2 2017年1季度病原檢測數(shù)據(jù)顯示，雖然藍(lán)耳病(PRRS)和圓環(huán)病毒2型 (PCV2)病原陽性檢出率相比上年同期有所下降，但與其他幾種疾病病原檢出率相比依然較高。在病原混合感染方面，1季度只檢測到藍(lán)耳病(PRRS)和圓環(huán)病毒2型(PCV2)的混合感染，兩者相互作用可使豬場保育和生長豬呼吸道疾病加重，生長豬死淘率高。豬場要重視這兩種病毒的危害，科學(xué)地使用藍(lán)耳病弱毒活疫苗與圓環(huán)病毒2型滅活苗聯(lián)合免疫。

3.3 2017年1月份對保育豬慢性消瘦和呼吸道病嚴(yán)重病例PRRSV、PCV2檢出率高，保育豬均勻度差，死淘率高；2月份對新生仔豬暴發(fā)腹瀉病例PEDV檢出率高，造成哺乳仔豬成活率低，損失嚴(yán)重?？梢姸杭竟?jié)交替，氣溫下降和晝夜溫差大等環(huán)境因素，加上一些豬場由于春節(jié)期間管理松懈導(dǎo)致豬體抗病能力下降容易感染PRRSV、PCV2、PEDV等病原。所以1季度加強(qiáng)豬場保溫和強(qiáng)化免疫等措施是預(yù)防病毒類傳染病發(fā)生的關(guān)鍵?！?/p>