■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

豬流行性腹瀉病毒變異毒株一步法SYBR Green I熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

為了建立豬流行性腹瀉病毒變異毒株快速、敏感的檢測(cè)方法。本研究利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出豬流行性腹瀉病毒變異毒株S基因中298bp的保守序列，并克隆到pMD18-T載體中作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了PEDV的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)5.2×101拷貝，與豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典毒株、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬藍(lán)耳病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒均不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和重復(fù)性。結(jié)果表明，建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR具有特異、敏感、快速、定量、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床PEDV變異毒株的檢測(cè)。

豬流行性腹瀉病毒變異毒株；SYBR Green I；熒光定量RT-PCR

豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Di-arrhea Virus，PEDV)引起的一種豬腸道傳染性病毒病，以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征[1]。該病首次報(bào)道于英國[2]，隨后，世界各國均有相關(guān)報(bào)道[3,4]。該病主要發(fā)生在冬季，夏季也可發(fā)生。各年齡的豬均可感染發(fā)病，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的感染發(fā)病率可達(dá)100%，哺乳仔豬病死率可達(dá)50%以上，常與豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus， TGEV)、輪狀病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)等其他腸道病毒混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。PEDV屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)成員，PEDV基因組全長約28kb，為單股正鏈RNA病毒。其中其主要結(jié)構(gòu)蛋白纖突蛋白(S)對(duì)被感染宿主中和抗體的產(chǎn)生、特異性受體的結(jié)合以及細(xì)胞膜融合等方面具有重要的生物學(xué)意義[6]，S蛋白的變異將會(huì)導(dǎo)致其宿主范圍、組織細(xì)胞培養(yǎng)及毒力發(fā)生改變[7]。我國現(xiàn)階段廣泛流行的PEDV與以往的毒株相比，已經(jīng)發(fā)生了較為明顯的變異，變異毒株已成為優(yōu)勢(shì)毒株，這可能也是導(dǎo)致免疫失敗的一個(gè)重要原因[8～10]。PEDV抗原傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如病毒分離鑒定、熒光抗體檢測(cè)、ELISA等，不僅操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以檢測(cè)出微量病毒，而且無法區(qū)分PEDV變異毒株與疫苗株或經(jīng)典毒株。因此，有必要建立一種簡(jiǎn)便的PEDV變異毒株的檢測(cè)方法。本試驗(yàn)據(jù)PEDV變異毒株S基因保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，建立PEDV變異毒株SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，為快速檢測(cè)PEDV變異毒株提供了一種新的方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株與病料

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)變異毒株、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)經(jīng)典毒株、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬藍(lán)耳病毒(PRRSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、輪狀病毒(RV)由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存，臨床檢測(cè)病料為2016年1～10月采自山東省各地豬場(chǎng)臨床診斷為PEDV感染的豬的腸道、糞便等。

1.2 試劑和試劑盒

Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTPs、pMD18-T載體、DL2000 Marker、One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)等購自寶生物工程(大連)有限公司，多功能DNA純化回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司產(chǎn)品，AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.3 RT-PCR引物設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank中登錄的PEDV變異毒S基因(JQ257005)序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增PEDV S基因部分片段298bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。P1：5'-CGAAAACCAGGGTGTCAA-3'，P2：5'-CGGGATGGCTTTGTTAAATA-3'。1.4 PEDV S基因的 RT-PCR

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取PEDV的RNA，作為模板，按照反轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行cDNA的合成，PCR擴(kuò)增體系如下：反應(yīng)總體系為25μL，其中Premix Taq 12μL，cDNA 2μL，上、下游引物各0.5μL(50μmol/L)，加去離子水至25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5min；94℃ 20s、52℃ 20s、72℃ 20s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。擴(kuò)增后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 制備重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

將PCR產(chǎn)物純化回收后，連接到MD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-S，重組質(zhì)粒由寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。將重組質(zhì)粒pMD-S利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在260nm和280nm處的吸光度，計(jì)算出質(zhì)粒中的DNA濃度和純度，并進(jìn)行10倍倍比梯度稀釋，作為陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板，用于熒光定量RT-PCR的擴(kuò)增和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1.6 一步法熒光定量RT-PCR

按照One Step SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)說明配置反應(yīng)體系，體系總體積為20μL：2×One Step RT-PCR Buffer 10μL，RNase freed H2O 5.6μL，P1(10pmol/μL)和P2(10 pmol/μL)各0.4μL，Ex Taq HS(5U/ μL)0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL，模板RNA 2μL。離心數(shù)秒后，放入Light Cyeler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按以下程序進(jìn)行反應(yīng)：42℃反轉(zhuǎn)錄5min，95℃預(yù)變性10s，95℃變性5s，52℃退火10s，72℃延伸10s(此處收集熒光)，升降溫速度均設(shè)置為20℃/s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)果Ct值小于37的為陽性，Ct值在37～40之間的被認(rèn)為可疑，重復(fù)試驗(yàn)如果仍然在37～40之間則視為陰性，無Ct值的為陰性。

1.7 熒光定量PCR的擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

以10倍梯度稀釋的已知拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量RTPCR擴(kuò)增，按1.6方法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR試驗(yàn)，并利用隨機(jī)軟件進(jìn)行分析，得到動(dòng)力學(xué)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 熒光定量 PCR特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的熒光定量RT-PCR方法對(duì)PEDV變異毒株、PEDV經(jīng)典毒株、CSFV、PRV、PCV2、PRRSV、TGEV、RV進(jìn)行特異性檢測(cè)。將模板質(zhì)粒做10倍梯度稀釋，用熒光定量RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，以此測(cè)定熒光定量RT-PCR所能檢出的最低模板的拷貝數(shù)，并與普通PCR比較。選取同一批次的3個(gè)不同濃度和不同批次3個(gè)不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性，在同一批次試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)定和在不同批次試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)設(shè)NTC。

1.9 臨床樣品檢測(cè)

用建立的熒光定量RT-PCR法對(duì)從山東省各地收集的臨床疑似病料86份進(jìn)行PEDV變異毒檢測(cè)，同時(shí)用常規(guī)RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)，并比較二者檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 目的基因PCR擴(kuò)增及克隆

利用RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)表明，擴(kuò)增產(chǎn)物約為298bp，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。將擴(kuò)增的目的片段純化后，克隆于pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-S，將其測(cè)序結(jié)果與GenBank中PEDV變異毒S基因的相應(yīng)片段進(jìn)行比較，結(jié)果證實(shí)該擴(kuò)增產(chǎn)物與PEDV變異毒S基因的相應(yīng)區(qū)域的同源性為100%。

2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以預(yù)試驗(yàn)篩選的5個(gè)稀釋度的重組質(zhì)粒作模板，進(jìn)行熒光定量RTPCR擴(kuò)增，生成動(dòng)力學(xué)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，曲線1-5所對(duì)應(yīng)的重組質(zhì)粒模板濃度分別為5.2×108、5.2×107拷貝、5.2×106拷貝、5.2×105拷貝、5.2×104拷貝，曲線6是陰性對(duì)照(即NTC)，未發(fā)生擴(kuò)增，線性回歸方程為Ct＝－3.352×lgcopies＋44.80(R2＝0.9997)。

在SYBR Green I熒光定量RTPCR完成后進(jìn)行熔解曲線分析，擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度Tm為85.5～86.0℃，無非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的峰值出現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品均一穩(wěn)定。

2.3 特異性檢驗(yàn)

按建立方法對(duì)PEDV變異毒株、PEDV經(jīng)典毒株、CSFV、PRV、PCV2、PRRSV、TGEV、RV的陽性樣品進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)，只有PEDV變異毒株的樣品孔出現(xiàn)了單一的s型擴(kuò)增曲線(圖3)，表明所建立的針對(duì)PEDV的熒光定量RT-PCR方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.4 敏感性試驗(yàn)

將制備的質(zhì)粒模板10倍倍比稀釋，并分別以此為模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，得到不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板的real-time PCR擴(kuò)增曲線，曲線1-6所對(duì)應(yīng)的重組質(zhì)粒模板濃度分別為5.2×105、5.2×104、5.2×103、5.2×102、5.2×101、5.2×100拷貝，結(jié)果顯示，其靈敏度為5.2×101拷貝，與常規(guī)RT-PCR結(jié)果對(duì)比，熒光定量RT-PCR的靈敏度比常規(guī)RT-PCR高100倍(圖4)。

2.5 重復(fù)性檢驗(yàn)

為了驗(yàn)證熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性，選取3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性測(cè)定，結(jié)果樣品的Ct值及Tm值批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)CV值均小于2.0%，批間重復(fù)性試驗(yàn)CV值均小于1.0%，表明本方法的重復(fù)性好(表1)。D組陰性對(duì)照組，未檢測(cè)到熒光信號(hào)。

2.6 臨床樣品檢測(cè)

分別用建立SYBR Green I熒光定量RT-PCR和普通RT-PCR方法，對(duì)臨床收集的86份疑似PEDV樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為：SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測(cè)到39份陽性，而普通RT-PCR檢測(cè)到35份陽性。

圖1 PEDV VP60基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 熒光定量PCR動(dòng)力學(xué)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 PEDV變異毒株 S基因特異性檢驗(yàn)動(dòng)力學(xué)曲線

圖4 PEDV變異毒株熒光定量RT-PCR(A)與常規(guī)RT-PCR(B)檢測(cè)敏感性比較

表1 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR的組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

PED從2010年底開始在我國大范圍暴發(fā)流行，臨床上主要表現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率的哺乳仔豬腹瀉(病死率達(dá)80%～100%)，目前，臨床上呈現(xiàn)變異毒株和經(jīng)典毒株混合感染，但以變異毒感染為主[8]，而國、內(nèi)外商品化疫苗毒株如我國的CV777株，和韓國的KPED-9和DR13株均為經(jīng)典毒株，因此，疫苗的免疫效果不理想。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)。國內(nèi)專家、學(xué)者曾采用染料法[11]和探針法[12]的熒光定量RT-PCR檢測(cè)PEDV，但都屬于兩步法，即反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)時(shí)分開進(jìn)行，操作繁瑣，本研究采用一步法熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)PEDV變異毒，不需要單獨(dú)做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行一步完成，操作簡(jiǎn)單，避免了由于多次操作而造成的污染問題，反轉(zhuǎn)錄時(shí)間只要5min，比傳統(tǒng)的方法節(jié)省了1個(gè)多小時(shí)，能快速得到檢測(cè)結(jié)果，可檢測(cè)微量病毒，對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)限為5.2×101拷貝。得到的熔解曲線只出現(xiàn)特異的單個(gè)峰，產(chǎn)物的Tm值均一，表明沒有引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，特異性好，對(duì)PEDV有陽性擴(kuò)增信號(hào)，對(duì)PEDV經(jīng)典毒株、CSFV、PRV、PCV2、PRRSV、TGEV、RV均無特異性反應(yīng)，對(duì)臨床86份病料進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示，該法可檢測(cè)出39份陽性，而普通RT-PCR僅檢測(cè)出35份陽性，表明該SYBR Green I熒光定量方法對(duì)于PEDV的檢測(cè)比普通RT-PCR方法靈敏度高，能檢出普通RT-PCR不能檢出的病料。

本研究建立的PEDV變異毒株一步法熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速、特異、敏感，能夠?qū)Ξ?dāng)前流行的PEDV變異毒株進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，對(duì)PEDV弱毒疫苗免疫后仍暴發(fā)PEDV野毒感染的研究更有臨床意義，為進(jìn)一步開展PEDV變異毒感染的分子流行病學(xué)調(diào)查和診斷，為研發(fā)變異毒PEDV的新型分子診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。■

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