孫燾 陶周善 屠凱凱 黃正亮 周強(qiáng) 李杭 白炳力 楊雷*

1. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，浙江 溫州 325000 2. 皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(弋磯山醫(yī)院)創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241000

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療某些關(guān)節(jié)嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí)較為常見且有效的骨科手術(shù)，如髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)等損傷。然而，內(nèi)植入體穩(wěn)定性不佳仍然是個(gè)嚴(yán)重的問題，并常常因包括無菌性松動(dòng)在內(nèi)的各種原因而迫使關(guān)節(jié)置換術(shù)后翻修[1]。運(yùn)用生物活性材料涂層是鈦表面性質(zhì)改性的一種常用方式。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)涂層植入體在過去用于全髖關(guān)節(jié)形成術(shù)后臨床結(jié)果顯示，HA涂層假體對(duì)于非骨水泥假體在關(guān)節(jié)形成術(shù)中是一個(gè)有效的替代[2]。盡管HA-涂層加強(qiáng)了植入體周圍疏松骨中的骨形成，與在正常骨骼中的植入體相比，骨質(zhì)疏松骨中植入體的假體并不穩(wěn)固[3]。近年來，由于鍶(Sr)可以抑制破骨活動(dòng)并增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性提高骨形成，降低骨的重吸收[4]特性，已有研究顯示摻鍶羥磷灰石涂層對(duì)于內(nèi)植物的骨整合有積極作用[5]。研究表明甲狀旁腺激素(1-34)(parathyroid hormone，PTH)的間斷使用通過增加成骨細(xì)胞的數(shù)量及活性，減弱成骨細(xì)胞的凋亡，從而提高其合成作用，可以明顯提高內(nèi)植物的骨整合[6]。綜上所述，筆者假設(shè)PTH也可能有助于增加摻鍶內(nèi)植物部位骨組織形成，增加內(nèi)植物的骨整合。本研究的目的在于確認(rèn)間斷給予PTH增加摻鍶羥基磷灰石涂層(Sr-HA)鈦棒在骨質(zhì)疏松條件下的骨整合。

1 材料與方法

1.1 涂層種植體的制備

用商業(yè)純鈦定制40個(gè)直徑1.2 mm，長(zhǎng) 20 mm的柱狀鈦棒 (江廣磁醫(yī)療器械有限公司)。經(jīng)噴砂、酸蝕后在超聲清洗機(jī)內(nèi)分別用70%乙醇、去離子水清洗材料，自然干燥。通過電化學(xué)沉積在其表面制備HA和摻鍶羥基磷灰石(Strontium-substituted hydroxyapatite，Sr-HA)涂層，具體方法參照文獻(xiàn)[5，7]。涂層通過XRD(x—Ray Di ffraction，X射線衍射)來定量定性的分析，掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察樣品表面的特征來確保涂層和文獻(xiàn)的結(jié)果相似(具體方案省去)。本實(shí)驗(yàn)中采用鍶元素置換羥基磷灰石中摩爾分?jǐn)?shù)10%的鈣元素。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12 w齡SPF級(jí)SD雌性大鼠50只，體重225～250 g，由上海斯萊克動(dòng)物公司提供，許可證號(hào)：(SCXK(滬)2007-0005，合格證號(hào)：2007-000548429)。所有動(dòng)物在溫度為(24.0±0.5)℃，濕度為45%～50%，通風(fēng)良好的環(huán)境下飼養(yǎng)，每周稱體重1次。

1.3 動(dòng)物模型的建立及治療

50只大鼠隨機(jī)分成2組即OVX組(n=45)切除雙側(cè)卵巢以建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型和Sham組不切除雙側(cè)卵巢建立假手術(shù)模型，具體手術(shù)步驟參考以前發(fā)表的文章[8]。簡(jiǎn)單而言，麻醉成功后，于大鼠背部正中線中下1/3處作一長(zhǎng)約 2 cm 縱行切口，向兩側(cè)鈍性分離皮下軟組織，于脊柱旁開0.5 cm處鈍性分開肌肉組織，顯露卵巢脂肪包被組織，輕輕提起卵巢，于輸卵管卵巢交界處絲線結(jié)扎，完整摘除雙側(cè)卵巢，逐層縫合，關(guān)閉創(chuàng)口。正常環(huán)境下飼養(yǎng)12 w后各組取5只大鼠處死股骨行骨密度測(cè)量?jī)x檢測(cè)檢驗(yàn)骨質(zhì)疏松建立模型建立情況。隨后所有的去卵巢(OVX)大鼠隨機(jī)分成4組：Control組、Sr組、PTH組、PTH+Sr組。每只大鼠植入2枚相同的鈦棒，Control組及PTH組大鼠雙側(cè)股骨內(nèi)各植入1枚HA涂層鈦棒，Sr組及PTH+Sr組大鼠雙側(cè)股骨內(nèi)植入表面含10%鍶元素的Sr-HA涂層的種植體，具體手術(shù)步驟參考以前發(fā)表的文章[9]。鈦棒植入術(shù)后第一天開始PTH組、PTH+Sr組大鼠術(shù)后給予PTH(Forsteo；Eli Lilly，Houten，荷蘭)60 μg/kg皮下注射，每周3次直至去卵巢術(shù)后12 w。隨后處死所有大鼠，取股骨行Micro-CT、骨生物力學(xué)、硬組織組織切片檢測(cè)。

1.4 Micro-CT 評(píng)價(jià)

術(shù)后12 w，用Micro-CT(SkyScan1176，荷蘭)觀察種植體周圍骨形成情況。每組剩余的10 個(gè)標(biāo)本連同周圍骨組織取出后，掃描垂直于股骨的長(zhǎng)軸，用 Micro-CT 連續(xù)掃描。在所成圖像中圍繞種植體周圍250 μm 厚的區(qū)域設(shè)為興趣區(qū)，從股骨干骺端板約 2 mm 開始連續(xù) 80個(gè)斷層，以 205 的閾值來提取圖像信息。掃描后利用 Micro-CT 配套的軟件系統(tǒng)直接計(jì)算骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume ratio，BV/TV)=所選區(qū)域骨組織體積/所選區(qū)域總體積，骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)，即所選區(qū)域骨小梁的平均厚度，骨小梁數(shù)量(trabecular number， Tb．N)，表示所選區(qū)域骨小梁的數(shù)量多少， 骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)，即所選區(qū)域骨小梁間髓腔的平均寬度，連接密度(connectivity density，Conn.D)[7]。

1.5 生物力學(xué)測(cè)試

Micro-CT 掃描完后將樣本放在萬用材料測(cè)試系統(tǒng)上(Instron 5565，Instron，美國(guó))， 以1mm/min的恒定速度沿種植體長(zhǎng)軸將其從骨組織中推出， 并用視頻引伸計(jì)記錄整個(gè)過程。取加載的最大負(fù)荷值為最大推出強(qiáng)度，用最大推出強(qiáng)度除以種植體與骨接觸面面積為界面剪切強(qiáng)度[7]。

圖1 鈦棒植入術(shù)后12 w各組大鼠股骨內(nèi)植物Micro-CT、硬組織切片及骨生物力學(xué)結(jié)果Fig.1 Results of micro-CT, hard tissue sections, and bone biomechanical properties in rats after implantation of titanium rod for 12 weeks注：Vs. Control，*P<0.05；Vs. Sr組，#P<0.05；Vs. PTH組，&P<0.05 (采用單因素方差分析及t檢驗(yàn))

1.6 硬組織切片標(biāo)本的制備和組織學(xué)檢查

用于制作硬組織切片的標(biāo)本被置于4%的中性甲醛緩沖溶液中3d。然后洗凈甲醛溶液，梯度濃度乙醇脫水后， 不脫鈣包埋于甲基丙烯酸甲酯中， 在骨骺板上約 2 mm處切片(SP1600， Leica，德國(guó))，厚約40 μm，經(jīng) Van Gieson 染色后顯微鏡下采集圖片，將距種植體表面100 μm 的區(qū)域設(shè)為興趣區(qū)，并用Image Pro-plus 6.0分析。骨-種植體接觸率(bone-to-implant contact rate，BIC)=種植體與骨直接接觸部分的長(zhǎng)度÷種植體表面的長(zhǎng)度×100%，骨面積比率(bone area ratio，BAR)=所選區(qū)域骨面積/所選區(qū)域的總面積×100%[7]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

所有大鼠都順利通過了手術(shù)并且恢復(fù)較快，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程都處于良好的健康狀態(tài)，鈦棒植入處未見感染、切口愈合不良等并發(fā)癥。術(shù)后12 w時(shí)兩組大鼠股骨的骨密度變化骨密度測(cè)量?jī)x檢測(cè)所得，Sham組大鼠的股骨骨密度為(238.34±31.56)mg/cm2，而OVX組大鼠的股骨骨密度為(174.24±29.43)mg/cm2。相對(duì)Sham組，OVX組大鼠的骨密度下降36.78%(P<0.05)，結(jié)果表明骨質(zhì)疏松模型建立是成功的。安樂死后，植入體周圍沒有臨床顯示炎癥癥狀及不良組織反應(yīng)。這表明局部使用鍶聯(lián)合全身的使用PTH不會(huì)產(chǎn)生全身不良反應(yīng)。

2.1 Micro-CT評(píng)估

三維重建圖像清晰的顯示了對(duì)照組組與治療組鈦棒表面及周圍骨組織骨小梁微結(jié)構(gòu)的改變情況(圖1E)。Micro-CT定量分析結(jié)果如表1所示。PTH和Sr涂層的聯(lián)合使用在所有實(shí)驗(yàn)組Micro-CT檢測(cè)指標(biāo)中顯示出最佳效果。與Control組相比，PTH+Sr組BV/TV增加了2.45倍，Tb.N增加了2.94倍，Conn.D增加了2.31倍，Tb.Th增加了1.56倍，而Tb.Sp降低了1.65倍(P<0.05)。Sr組與PTH組和PTH+Sr組相比表現(xiàn)為更低微觀參數(shù)(P<0.05)。

表1 鈦棒植入股骨術(shù)后12 w時(shí)內(nèi)植物感興趣區(qū)Micro-CT定量分析結(jié)果Table 1 Quantitative analysis of micro-CT in the region of interest in 12 weeks after implantation of titanium rod into the femur

Note:*Vs. Control,P<0.05,#Vs. Sr group,P<0.05, &Vs. PTH group,P<0.05(單因素方差分析和t檢驗(yàn))

2.2 組織學(xué)評(píng)估

硬組織切片結(jié)果展示在不同手段干預(yù)下鈦棒周邊骨質(zhì)改變的情況(圖1F)。相較于OVX組，所有的治療在組織形態(tài)定量分析中都有BAR和BIC的顯著提高(P<0.05；圖1G、B、C)。12w時(shí)，Sr組、PTH組及PTH+Sr組的BAR相較于控制組分別提高了1.52倍、1.73倍及2.30倍(P<0.05)，它們的BIC接觸率分別提高了1.35倍、1.56倍及2.21倍(P<0.05)。

2.3 生物力學(xué)測(cè)試

Sr組、PTH組及PTH+Sr組的最大推力分別較HA組表現(xiàn)為1.27倍、1.36倍及1.61倍增長(zhǎng)(P<0.05)。所有有股骨植入體的組中，PTH+Sr組所觀察到的強(qiáng)度效果最大(P<0.05) (圖1 G、A)。

3 討論

此研究評(píng)估了系統(tǒng)使用PTH及摻鍶涂層對(duì)OVX大鼠股骨干骺端植入鈦棒的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PTH與摻鍶涂層在大鼠中的聯(lián)合使用中顯著提高了OVX大鼠鈦棒表面的骨形成及其穩(wěn)定性。PTH+Sr組大鼠鈦棒表面更多新骨形成提示聯(lián)合使用PTH和摻鍶涂層對(duì)于骨質(zhì)疏松患者人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體穩(wěn)定方面具有重要意義。

實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)了以前研究發(fā)現(xiàn)PTH可以促進(jìn)去卵巢大鼠內(nèi)植物的骨整合[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PTH組的BAR和BIC較HA組分別提高了1.77倍及1.53倍。類似的結(jié)果也在生物機(jī)械實(shí)驗(yàn)中得到，PTH組的最大推力是Control組的1.31倍。最近的研究表明，PTH可以誘導(dǎo)動(dòng)物成骨細(xì)胞形成，增加骨小梁的量和質(zhì)，提高骨量和強(qiáng)度[11]。此外，PTH可以直接增加骨髓中骨祖細(xì)胞復(fù)制，通過刺激骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞的增殖與分化增加成骨細(xì)胞數(shù)量，激活骨襯細(xì)胞來減緩成骨細(xì)胞的凋亡。

目前，有實(shí)驗(yàn)比較研究Sr涂層對(duì)于內(nèi)植物骨整合的影響，局部使用Sr涂層不會(huì)對(duì)骨組織及周圍軟組織有干擾作用，筆者的研究結(jié)果證實(shí)Sr涂層可以提高去卵巢大鼠內(nèi)植物的骨整合[12]。多種實(shí)驗(yàn)表明Sr可以通過阻礙破骨細(xì)胞活性減少骨吸收，刺激成骨細(xì)胞活性增加骨形成[13]。具體來說，Sr可以提高成骨細(xì)胞的復(fù)制和成骨細(xì)胞活性，包括骨基質(zhì)合成和堿性磷酸酶的產(chǎn)生，減少骨髓細(xì)胞分化時(shí)產(chǎn)生的破骨細(xì)胞標(biāo)記物，抑制破骨細(xì)胞分化，減弱破骨細(xì)胞活性，減少其他祖細(xì)胞的向破骨細(xì)胞分化。筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sr涂層可以明顯提高鈦植入體表面骨組織重建和新骨形成。本實(shí)驗(yàn)中使用PTH的劑量率(60 μg/kg，每周3次)類似于嚙齒動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中常規(guī)使用的量[14-15]，但遠(yuǎn)高于人體治療劑量(40～100 μg/d)[16-17]，因此，PTH在嚙齒類動(dòng)物中使用的劑量通常是在人體使用治療劑量的20～100倍。然而，很少有報(bào)道顯示類似人類治療劑量PTH對(duì)動(dòng)物骨密度和骨量有明顯的影響。相反，較高劑量的PTH一般認(rèn)為對(duì)骨量或骨密度及血清鈣水平有顯著的影響[18-19]。

PTH與Sr涂層的聯(lián)合使用可以明顯增加去卵巢大鼠鈦棒表面的骨形成。具體機(jī)制尚不明確，主要?dú)w因于局部骨形成的增加及Sr對(duì)于移植體穩(wěn)定性的局部功能以及PTH的綜合功能。 PTH可以刺激胰島素生長(zhǎng)因子，從而增加細(xì)胞增殖，減少凋亡[20]。結(jié)果顯示，PTH增加了骨小梁量及厚度，并最終增加骨密度與骨質(zhì)。筆者的研究結(jié)果證實(shí)PTH提高了所有髓腔中骨組織的形成和再生，而不只是植入體的表面。同時(shí)，Sr-HA的溶解在植入體骨整合的提高中發(fā)揮了重要作用。具體來說，HA溶解可以帶來涂層中的鍶離子、鈣和磷，從而增加植入體表面的這些離子濃度。這些離子都可以增加成骨細(xì)胞功能和新骨形成。Sr-HA結(jié)晶度的降低進(jìn)一步提高了溶解度，從而提高了局部鍶離子的釋放及新骨的形成[21]。因而，高溶解性的Sr-HA涂層刺激骨生長(zhǎng)進(jìn)入植入體的表面。

綜上所述，本研究證實(shí)在骨質(zhì)疏松狀態(tài)下?lián)芥J羥基磷灰石涂層結(jié)合間斷給予PTH 能有效提高內(nèi)植物周圍的骨形成及穩(wěn)定性。盡管目前為止所有實(shí)驗(yàn)局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，隨著本實(shí)驗(yàn)組研究的進(jìn)一步深入，將為臨床解決骨質(zhì)疏松骨整合問題提供一條新的思路。