李家勇 王銘 彭稱飛 蔣林彬 張順 貝朝涌*

1. 桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院四肢創(chuàng)傷骨科，廣西 桂林 541001 2. 桂林醫(yī)學院生物技術(shù)學院，廣西 桂林 541001 3. 桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541001

骨折超過預(yù)期時間沒有愈合，稱為骨折不愈合，其診斷標準是：骨折后至少9個月仍未愈合，或者連續(xù)動態(tài)觀察3個月，未見到骨折有明顯的愈合征象[1]。骨折不愈合的治療一直是骨科領(lǐng)域的熱點和難點。

P75NTR是第一個被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子受體，它能和所有的神經(jīng)營養(yǎng)因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子前體蛋白結(jié)合，調(diào)控廣泛的細胞功能，包括：細胞生長、分化、增殖、凋亡、神經(jīng)和突觸重構(gòu)。研究表明：P75NTR能促進纖維蛋白的沉積[2]、抑制血管的生成[3]，而纖維蛋白的沉積和血管生成的減少在骨折不愈合的形成中發(fā)揮重要作用[4-8]。

本研究擬對兔骨折不愈合骨組織、骨折愈合后骨組織及正常骨組織中P75NTR的表達進行測定，通過了解其在上述三組中的表達，為骨折不愈合的形成機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑：鼠抗兔P75NTR單克隆抗體ab157295(abcam公司)；通用型二抗來自桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科。

1.1.2實驗動物：純種新西蘭大白兔30只(5～6月齡)，體重2.5±0.5kg,雌雄不限，由桂林醫(yī)學院動物實驗部提供，實驗過程中對動物處置符合善待動物意見要求。將動物隨機分為A、B、C三組，A組骨折不愈合造模組，B組骨折造模組，C組不予處理為正常組。

1.1.3兔骨折模型及骨折不愈合模型的建立：新西蘭大白兔用25g/L硫賁妥鈉按30 mg/kg劑量腹腔注射麻醉。麻醉后，取俯臥位，常規(guī)消毒鋪巾，在前臂橈側(cè)沿橈骨作-2.5 cm 長切口，顯露橈骨，在距橈骨遠端2 cm處截骨(兔骨折模型僅在此處截骨)，再向近端距第一截骨線1.5 cm處做第2個截骨線，去除截除的1.5 cm骨段(包括骨膜)，徹底止血，依次縫合各層，肌注青霉素8萬單位，連注3 d，小夾板外固定，放入籠內(nèi)喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1脫鈣染色：三個月后，同時處死上述三組兔子，收集的骨折不愈合組局部組織、骨折組及正常組局部骨組織編號放置于新鮮配制的15% EDTA脫鈣液中脫鈣，脫鈣后清水沖洗去除標本上殘留的EDTA。所有組織均浸泡于95%乙醇中脫水2 h，再置于二甲苯中40 min。將脫鈣脫水的組織石蠟包埋。

1.2.2免疫組織化學染色：石蠟包埋組織塊切片烤干后經(jīng)二甲苯脫水，0.5% H2O2室溫孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，EDTA抗原修復(fù)，與1∶30稀釋的P75NTR抗體反應(yīng)，4℃過夜。PBS洗滌3次，加入通用型二抗，室溫孵育1 h，DAB顯色，經(jīng)蘇木精復(fù)染后進行常規(guī)脫水、封片、顯微鏡觀察。用IPP 6.0病理圖像分析軟件定量分析三組中P75NTR的表達情況。

1.2.3Western blotting檢測P75NTR的表達：將組織研磨離心后取上清，以SDS-PAGE凝膠行蛋白電泳，電泳完畢將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF上。轉(zhuǎn)膜后在含5% 脫脂奶粉的TBST中封閉1 h，TBST洗滌3次，與1∶2000稀釋的P75NTR抗體及β-actin抗體反應(yīng)，4℃過夜。洗膜3次，加1∶4000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光法顯色。

1.2.4結(jié)果判定：顯微鏡下肉眼觀察三組切片P75NTR表達情況，并進行比較。組織中出現(xiàn)棕黃色顆粒染色的為陽性，每組織切片隨機選取5個高倍視野(×400)，高分辨率相機拍照后將圖像輸入計算機儲存，使用Image-Pro-Plus IPP6.0醫(yī)學病理圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，計算每個視野的累積光密度值和累積陽性面積值，兩者比值為該視野平均吸光度值，將每組5個視野的平均吸光度值算出后取其均數(shù)作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 光鏡下三組組織形態(tài)差異

光鏡下顯示骨折不愈合區(qū)域存在大量纖維瘢痕組織，斷端周圍區(qū)主要是纖維性骨痂。免疫組織化學染色顯示三組骨組織組P75NTR的表達情況，見圖1。

圖1 兔骨折不愈合組、骨折組及正常組局部組織P75NTR免疫組織化學染色 200×圖中可見P75NTR主要分布在纖維組織、纖維骨痂。 A:骨折不愈合組；B:骨折組；C:正常組Fig.1 Immunohistochemistry of P75NTR in local tissues of rabbits in the nonunion, fracture and untreated groups 200×P75NTR mainly distributed in fibrous tissue and fibrous callus. A: Nonunion group; B: Fracture group; C: Untreated group

2.2 三組標本P75NTR表達的差異

骨折不愈合組P75NTR平均吸光度值為0.3287±0.0419，骨折組P75NTR平均吸光度值為0.0267±0.0187，正常組P75NTR平均吸光度值為0.0159±0.0136。使用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，方差分析表明骨折不愈合組P75NTR平均吸光度值明顯高于骨折組及正常組，差別有統(tǒng)計學意義(F=394.875,P<0.05)。骨折組與正常組差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 三組標本中P75NTR平均吸光度值注：與正常組比較，*P<0.05；與骨折組比較，△P<0.05；與骨折組比較，▽P>0.05Fig.2 Average absorbance value of P75NTR in the three groupsNote: Compared with the untreated group，*P<0.05; Compared with the fracture group，△P<0.05; Compared with the fracture group，▽P>0.05

圖3 Western blotting檢測三組中P75NTR表達注：1 骨折不愈合組；2 正常組；3 骨折組Fig.3 Expression of P75NTR in the three groups detected by Western blottingNote: 1 Nonunion group; 2 Untreated group; 3 Fracture group

2.3 Western blotting檢測三組中P75NTR蛋白水平

Western blotting檢測顯示，骨折不愈合組P75NTR表達水平顯著高于骨折組和正常組(P<0.05)，骨折組和正常組無明顯差別(P>0.05)，見圖3、表1。

表1 三組標本P75NTR/β-action的比較Table 1 Comparison of the ratio of P75NTR to β-action among the three groups

注：與正常組比較，aP<0.05；與骨折組比較，bP<0.05；與骨折組比較，cP>0.05

Note: Compared with the untreated group，aP<0.05; Compared with the fracture group，bP<0.05; Compared with the fracture group，cP>0.05

3 討論

正常情況下, 骨折后骨折周圍纖維蛋白的表達迅速升高，能促進止血，促進炎癥因子趨化，并在骨折修復(fù)的起始階段起支撐作用，隨著骨折的愈合進程，其表達水平逐漸下降，至骨折完全愈合時表達水平接近零[9]。在骨折愈合過程中，一些學者觀察到持續(xù)的纖維蛋白沉積影響骨折愈合：Cole HA等[6]在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)骨折局部的纖維蛋白持續(xù)沉積能直接刺激破骨細胞生成，導(dǎo)致嚴重的骨質(zhì)疏松，影響骨折的愈合；Yuasa M等[7]通過在纖維蛋白原和纖維蛋白酶原基因沉默的小鼠股骨骨折模型中發(fā)現(xiàn)：持續(xù)的纖維蛋白沉積抑制軟骨內(nèi)血管的生成和成骨作用，影響骨折的愈合。亦有學者[4-5]對骨折不愈合局部組織切片進行分析，發(fā)現(xiàn)骨折不愈合斷端主要是纖維樣組織，無骨組織，纖維樣組織離體培養(yǎng)后可見其中含纖維母細胞樣細胞。本實驗亦表明，骨折不愈合區(qū)域存在大量纖維瘢痕組織，斷端周圍區(qū)主要是纖維性骨痂(圖1)。

同樣，血管的生成在骨折愈合的進程中亦起到非常重要的作用：Maes C等[8]研究表明在骨折愈合過程中，血管的生成對成骨細胞基質(zhì)礦化的調(diào)節(jié)是必不可少的；軟骨內(nèi)血管的形成能促進成骨細胞分化，同時成骨細胞可以通過血管到達骨折部位，而阻斷骨折局部的血管能抑制骨化中心的形成。

綜上表明，骨折局部纖維蛋白的持續(xù)沉積和血管生成的抑制在骨折不愈合發(fā)病中起到非常重要的作用，而P75NTR能抑制纖維蛋白的降解和抑制血管的再生。研究表明P75NTR表達的升高抑制纖維蛋白的降解：P75NTR通過下調(diào)絲氨酸蛋白酶(serine endopeptidase)、組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)和上調(diào)纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1)來限制纖維蛋白降解[10]；同時P75NTR表達的升高還能抑制四肢血管[11]、肺血管[12-13]和視網(wǎng)膜色素上皮細胞血管[14]的再生。

雖然以上學者的研究能夠表明P75NTR影響骨折的愈合，但在骨折不愈合組織中是否存在P75NTR的表達至今未見報道。本實驗通過檢測P75NTR在兔骨折不愈合組、骨折組及正常組三組中的表達，發(fā)現(xiàn)P75NTR在骨折不愈合組高表達，而在骨折組及正常組中表達較低，表明P75NTR可能參與骨折不愈合的形成，可能是骨折不愈合形成的一個重要因素，有望成為骨折不愈合治療的一個新的靶點。關(guān)于P75NTR在骨折不愈合進程中的表達情況及其引起骨折不愈合形成的機制還有待于進一步研究。