陸瑤瑤，馮永杰，董 輝，楊玉榮

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VEG株弓形蟲卵囊對昆明小鼠的毒力研究

陸瑤瑤，馮永杰，董 輝，楊玉榮

目的 探究VEG株弓形蟲卵囊對中國昆明小鼠的致病性。方法 分別選擇<1個，100個～108個的VEG株弓形蟲卵囊灌胃昆明小鼠，采用MAT、H&E和IHC方法研究小鼠對弓形蟲的感染情況，并分析小鼠感染率，生存率及其大腦內(nèi)的弓形蟲包囊數(shù)量。結(jié)果 ≥102個VEG株弓形蟲卵囊可引起小鼠100%感染，最低致死劑量為102個卵囊，100%致死劑量為108個卵囊，急性期死亡時間為7 DPI～14 DPI，弓形蟲的成囊率是32.14%(9/28)，包囊數(shù)量為9～857個/只小鼠大腦，感染小鼠生存率為67.44%(29/43)，最長存活時間≥390 DPI。結(jié)論 VEG株弓形蟲卵囊對昆明小鼠的毒力中等，包囊形成率較高。

VEG蟲株；弓形蟲卵囊；昆明小鼠；包囊；致病性

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種胞內(nèi)寄生蟲，分布廣泛，它可以感染所有有核細(xì)胞的恒溫動物，包括人類、家禽、家畜等，從而引起弓形蟲病[1]。貓科動物是弓形蟲的終末宿主，弓形蟲可以在其體內(nèi)進(jìn)行無性生殖和有性生殖。幾乎所有恒溫動物都是弓形蟲的中間宿主，吞食或飲用了被弓形蟲卵囊污染的食物或水源，或者食用了未煮熟的含有弓形蟲包囊的肉品[2]，弓形蟲可侵入腸壁經(jīng)血液或淋巴液擴(kuò)散至全身各組織，若宿主免疫力正常，則蟲體繁殖受阻，形成包囊；若宿主免疫力低下，或弓形蟲毒力較強(qiáng)，數(shù)量較多，可以引起弓形蟲急性感染而死亡。VEG株弓形蟲是Ⅲ 型弓形蟲的代表蟲株，關(guān)于其對我國昆明小鼠的致病力研究，還未見報道。本試驗(yàn)采用改良凝集試驗(yàn)(Modified Agglutination Test，MAT)，常規(guī)病理學(xué)方法，蘇木素與伊紅對比染色法(Hematoxylin-Eosin staining，H&E)和免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)染色技術(shù)，研究VEG株弓形蟲對昆明小鼠的毒力，為弓形蟲卵囊入侵機(jī)制及防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 弓形蟲卵囊及主要試劑 VEG株弓形蟲卵囊、兔抗弓形蟲多克隆抗體、弓形蟲抗原受贈于美國農(nóng)業(yè)部Dubey實(shí)驗(yàn)室，小鼠Specific HRP/DAB(ABC)Detection IHC kit 購自abcam公司(貨號：ab64264)。

1.2 試驗(yàn)動物及處理 6～8周齡健康昆明小鼠55只，購于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(實(shí)驗(yàn)動物處理遵守動物倫理與福利相關(guān)規(guī)定)。小鼠按性別隨機(jī)分為11組(每組雌雄分開，10個感染組，1個對照組)，每組5只小鼠，正常采食飲水。對照組小鼠灌胃無菌生理鹽水1 mL/只，感染組小鼠分別灌胃梯度稀釋的弓形蟲卵囊：<1個/只，1個/只，10個/只，102個/只，103個/只，104個/只，105個/只，106個/只，107個/只，108個/只，每只小鼠灌胃卵囊溶液1 mL。接種后60 d(60 days post inoculation，60 DPI)，采集全部小鼠血清，小鼠乙醚麻醉后處死(保留105個/5只，106個/1只，107個/1只卵囊組存活的小鼠)。每天觀察小鼠臨床情況，記錄發(fā)病和死亡情況。對感染后死亡(非處死)和處死的小鼠組織涂片觀察記錄肺臟、腸系膜淋巴結(jié)中弓形蟲速殖子，取大腦制作組織壓片觀察記錄大腦包囊數(shù)量；10%中性福爾馬林溶液固定死亡小鼠的全部組織臟器，常規(guī)方法制作石蠟切片，H&E染色及弓形蟲抗原IHC染色。

1.3 試驗(yàn)方法 采用MAT方法檢測小鼠血清中弓形蟲IgG抗體[3]。肺臟、腸系膜淋巴結(jié)中弓形蟲速殖子檢測采用組織涂片方法，進(jìn)行顯微鏡觀察；小鼠大腦中包囊的計(jì)數(shù)采用腦組織研磨液法，進(jìn)行顯微鏡鏡檢[4]。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用軟件GraphPad Prism 5.0 software (Graphpad Software Inc.，San Diego，CA，USA)對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 VEG株弓形蟲卵囊灌胃后小鼠感染及死亡 60 DPI小鼠血清弓形蟲IgG抗體結(jié)果顯示，< 1個VEG株弓形蟲卵囊灌胃組小鼠弓形蟲感染率為0，1個和10個卵囊灌胃組小鼠的弓形蟲感染率均為80%，≥102個/只卵囊灌胃組小鼠的感染率均為100%(表1)。102個，106個，107個，108個卵囊灌胃組分別有小鼠在14 DPI；10 DPI和11 DPI；9 DPI、10 DPI和13 DPI；7 DPI、8 DPI、9 DPI和11 DPI感染后死亡(非處死)(表1)。對感染后死亡(非處死)的這14只小鼠的肺臟和腸系膜淋巴結(jié)涂片，顯微鏡鏡檢可見弓形蟲速殖子，見圖1(A、B)。

在接種后60 DPI～390 DPI，105個，106個，107個VEG株弓形蟲卵囊灌胃組分別有小鼠在212 DPI、232 DPI、264 DPI和383 DPI；227 DPI；206 DPI感染后死亡(非處死)，剩余一只小鼠存活時間超過390 DPI(表1)。試驗(yàn)小鼠生存曲線見圖2。

2.2 VEG株弓形蟲感染后小鼠大腦包囊負(fù)載量 60 DPI對處死的試驗(yàn)組小鼠，取大腦并研磨鏡檢計(jì)數(shù)，結(jié)果表明102個，104個VEG株弓形蟲卵囊組小鼠的大腦研磨液中存在弓形蟲包囊，每只小鼠大腦的包囊量是9～11個，包囊負(fù)載量見表1。

60 DPI～390 DPI小鼠進(jìn)入弓形蟲慢性感染期，105個VEG株弓形蟲卵囊組感染后死亡4只小鼠(非處死)，其中3只小鼠的大腦研磨液中檢出弓形蟲包囊，小鼠大腦的包囊量約160個；106個和107個卵囊組分別各有1只感染后死亡的小鼠(非處死)，其大腦研磨液中均檢出弓形蟲包囊，包囊量分別是722個和857個。詳細(xì)的包囊負(fù)載量見表1。大腦組織包囊形態(tài)見圖1(C-F)。VEG株弓形蟲的成囊率為32.14%(9/28)，感染VEG株弓形蟲的小鼠生存率為67.44%(29/43)，最長存活時間≥390 DPI。

3 討 論

弓形蟲的宿主種類較多，感染分布范圍廣。不同基因型蟲株的毒力有差異[5]，目前已有232個弓形蟲的基因型收錄在弓形蟲數(shù)據(jù)庫中(http://toxodb.org/toxo)。采用PCR限制性片段長度多態(tài)性分析的方法對人類和動物體內(nèi)的弓形蟲蟲株進(jìn)行基因分型，結(jié)果表明弓形蟲的遺傳具有多態(tài)性和地域差異性[6-8]。弓形蟲基因型分類及特點(diǎn)：Ⅰ型為強(qiáng)毒株，對小鼠以及免疫抑制患者有很強(qiáng)的致病性，低濃度的弓形蟲在急性期感染即可導(dǎo)致小鼠死亡；Ⅱ型和Ⅲ 型為弱毒株，致病性較弱，只有高濃度的弓形蟲才可以引起小鼠死亡，低濃度的弓形蟲侵入小鼠后易形成組織包囊[9]。

表1 灌胃VEG株弓形蟲卵囊對昆明小鼠的致病性

Tab.1 Pathogenicity of the VEG strain ofT.gondiioocysts onKunmingmice orally

No．ofoocystsNo．ofinfection/No．ofinoculationDaysofsurvivalNo．ofbraincystsofeachmouseNo．ofbraincystsAverage±Standarderror1085/5(100%)11/2，7/1，8/1，9/1?/501075/5(100%)10/2，9/1，13/1，206/1?/4，8578571065/5(100%)10/3，11/1，227/1?/4，7227221055/5(100%)212/1，232/1，264/1，383/1，≥390/1161，340，0，141，alive160．50±139．481045/5(100%)≥60/538，17，0，0，011．00±16．791035/5(100%)≥60/50，0，0，0，0，01025/5(100%)14/1，≥60/4?/1，9，30，0，09．75±14．15104/5(80%)≥60/50，0，0，0，-014/5(80%)≥60/50，0，0，0，-0<10(0%)≥60/5--對照組Controlgroup0(0%)≥60/5--

注：a表示小鼠存活天數(shù)/存活小鼠數(shù)目；“*/”表示急性感染期死亡小鼠/小鼠數(shù)目；“-”表示小鼠未感染

Note：a mouse survival days / number of surviving mice; “*/” mice in acute infection/ number of died mice; “-” mice were not infected

A小鼠肺臟中弓形蟲速殖子，肺臟涂片，未染色，7 DPI；B小鼠腸系膜淋巴結(jié)中弓形蟲速殖子，腸系膜淋巴結(jié)涂片，未染色，7 DPI；C、D、E和F小鼠大腦中弓形蟲包囊，206 DPI。C和D大腦組織壓片，未染色；E大腦組織切片，HE染色；F大腦組織切片，IHC 染色。標(biāo)尺=50 μmA: Tachyzoites of T. gondii in the lung of mouse (arrow)，lung smear，unstained，7 DPI; B: Tachyzoites of T. gondii in the mesenteric lymph nodes of mouse (arrows)，mesenteric lymph nodes smear，unstained，7 DPI; C，D，E and F: Tissue cysts of T. gondii in brain of mouse，206 DPI. C and D Brain squash，unstained; E: Section of brain tissue，HE stained; F: Section of brain tissue，IHC stained.Bar=50 μm圖1 VEG弓形蟲速殖子和包囊Fig.1 Tachyzoites and tissue cysts of VEG strain T. gondii

A:灌胃VEG株弓形蟲卵囊濃度梯度的昆明小鼠生存曲線(0 DPI～60 DPI)；B:灌胃VEG株弓形蟲卵囊濃度梯度慢性感染期的昆明小鼠生存曲線(60 DPI～390 DPI)A: The survival curve of mice after inoculation with gradient concentration of VEG strain T. gondii oocysts orally (60 DPI-60 DPI);B: The survival curve of chronically infected mice after inoculation with gradient concentration of VEG strain T. gondii oocysts orally (60 DPI-390 DPI).圖2 小鼠感染梯度濃度的VEG弓形蟲卵囊后的梯度曲線Fig.2 Survival curves of mice after inoculation with gradient concentration of VEG strain T. gondii

研究發(fā)現(xiàn)，1個I型強(qiáng)毒株CT1和GT1的卵囊即可引起Swiss和BALB/c小鼠死亡[4]，RH株弓形蟲以及TgCtxz1株弓形蟲的一個速殖子即可感染小鼠，死亡率分別是25%和83.3%[10]。弓形蟲II型和III型弱毒株感染小鼠后可在小鼠組織中形成包囊，尤其是大腦。II型弱毒株ME49和III型弱毒株VEG對Swiss小鼠口服接種組織包囊的最低感染量分別為100個包囊和10個包囊，口服100個ME49株弓形蟲的包囊，大腦包囊數(shù)量約566個(54DPI)；口服1 000個VEG株弓形蟲包囊可引起小鼠死亡，而皮下注射1個VEG株弓形蟲的包囊可引起小鼠感染，104個蟲量可導(dǎo)致小鼠死亡[11]。VEG株弓形蟲對Swiss小鼠和BALB/c小鼠的100%最低致死量為102～103個卵囊，對HLA轉(zhuǎn)基因小鼠最低致死劑量為102個卵囊，將III型的TgGoatUSA弓形蟲卵囊(103個)分別灌胃Swiss小鼠，HLA轉(zhuǎn)基因小鼠，IFN-γ基因敲除鼠和C57/Black小鼠，發(fā)現(xiàn)其在Swiss小鼠組織中形成的包囊數(shù)最高(平均457個)[4]。

在我國分離到的弓形蟲活蟲蟲株，大部分為弱毒株，66.67%的蟲株屬于ToxoDB#9[12]。為了對其他弱毒蟲株致病特點(diǎn)的研究提供參考，本研究以III型弓形蟲VEG株弓形蟲卵囊梯度濃度灌胃小鼠，研究其對昆明小鼠的毒力及致病性，結(jié)果顯示該蟲株對昆明小鼠的最低致死劑量為102個卵囊，這與已有研究的其他品系小鼠最低致死劑量基本一致。同時，本研究室對于河南首次分離到的ToxoDB#17做了致病性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ToxoDB#17卵囊對昆明小鼠的致病性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VEG株弓形蟲卵囊對昆明小鼠的致病性[13-14]。對ToxoDB#17研究表明，1個卵囊即可引起昆明小鼠感染，但卵囊濃度的高低對小鼠的死亡率以及成囊率沒有明顯相關(guān)性[14]。然而，106～107個VEG蟲株卵囊組的小鼠在急性感染期死亡率達(dá)到80%，108個卵囊組小鼠死亡率100%，且在感染急性期小鼠死亡時間是7 DPI～14 DPI。60 DPI，從小鼠大腦中發(fā)現(xiàn)包囊的最低卵囊濃度為102個卵囊，≥104個卵囊組小鼠均發(fā)現(xiàn)弓形蟲包囊，且包囊數(shù)量隨著卵囊濃度增大而增多，但與DPI無明顯相關(guān)性。在小鼠進(jìn)入慢性感染期之后到390 DPI，高濃度卵囊試驗(yàn)組(105個/只，106個/只，107個/只)的7只小鼠中感染后死亡(非處死)的6只小鼠大腦有5只發(fā)現(xiàn)組織包囊，包囊數(shù)平均約為370個，說明昆明小鼠對VEG株弓形蟲卵囊易感，并且隨著卵囊濃度的升高，小鼠死亡率以及大腦中包囊數(shù)量也增高。

綜上，VEG株弓形蟲卵囊對昆明小鼠的致病性及毒力中等，與其對Swiss小鼠和BALB/c小鼠的致病特點(diǎn)基本一致。目前國內(nèi)尚未有VEG株弓形蟲對昆明小鼠毒力特點(diǎn)的報道，且VEG株弓形蟲是一個典型的III型弓形蟲，可以為其他基因型的弱毒蟲株致病特點(diǎn)及其毒力研究提供參考，為有效防控弓形蟲病以及疫苗的篩選提供理論依據(jù)。

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Virulence of VEG strainToxoplasmagondiioocysts againstKunmingmice

LU Yao-yao，F(xiàn)ENG Yong-jie，DONG Hui，YANG Yu-rong

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

To explore the pathogenicity of VEG strainToxoplasmagondiioocysts on ChinaKunmingmice，T.gondiioocysts of < 1 and 102-108were chosen to feed the mice orally. And the modified agglutination test (MAT)，H&E and IHC were used to check the infection of mice. The infection rate，the survival rate of mice，and number of cysts in brain were analyzed. Results showed that 100% of the mice fed with ≥102oocysts were infected，the minimum lethal dose was 102oocysts and the 100% lethal dose was 108oocysts. The time of death in acute infection was 7 DPI to 14 DPI.T.gondiicysts formation rate was 32.14% (9/28)，and the number of cysts was 9 to 857 per mouse. The survival rate of infected mice was 67.44% (29/43)，and the longest survival time was more than 390 DPI. Accordingly，the virulence ofT.gondiiVEG strain is medium，and has a higher cysts formation rate.

T.gondiiVEG strain; oocysts;Kunmingmice; tissue cysts; pathogenicity

Yang Yu-rong，Email: yangyu7712@sina.com

國家自然科學(xué)基金(No.30800812)，河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計(jì)劃(No.17HASTIT038)，河南省自然科學(xué)基金(No.162300410138)通訊作者：楊玉榮，Email: yangyu7712@sina.com

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.010

R382.5

A

1002-2694(2017)07-0624-04

2016-11-10 編輯：張智芳

Supported by the National Science Foundation of China (No. 30800812)，the University of Science and Technology Innovation Talent Support Program of Henan Province (No. 17HASTIT038) and Science Foundation of Henan (No. 162300410138)