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        肺炎支原體CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的表達及鑒定

        2017-08-01 00:14:43劉寶山趙芝娜趙雨杰王桂珍
        中國人獸共患病學(xué)報 2017年7期
        關(guān)鍵詞:表位毒素支原體

        劉寶山,趙芝娜,趙雨杰,王桂珍

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        肺炎支原體CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的表達及鑒定

        劉寶山1,趙芝娜2,趙雨杰3,王桂珍3

        目的 探討肺炎支原體CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的免疫反應(yīng)活性。方法 對CARDS毒素蛋白的抗原表位進行分析,選取10個重要的表位進行拼接,反向翻譯后合成并克隆,插入pET28a表達載體構(gòu)建pET-CARDS表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入受體菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達的多表位拼接CARDS蛋白使用6×His單克隆抗體和人陽性血清進行了免疫印跡的檢測。結(jié)果 CARDS毒素蛋白的多表位拼接抗原表達載體構(gòu)建成功,誘導(dǎo)后表達大小為30KDa的重組蛋白,Western blot測定其能與6×His單克隆抗體和人陽性血清發(fā)生反應(yīng)。結(jié)論 本研究選取的CARDS毒素蛋白抗原表位具有較強的免疫活性,可為Mp感染的診斷提供新的候選抗原。

        肺炎支原體;CARDS毒素蛋白;多表位拼接抗原;表達;鑒定

        肺炎支原體(Mycoplasmapneumonia,Mp)是社區(qū)獲得性呼吸道感染的重要病原體,約占社區(qū)獲得性肺炎的10%~40%,并呈增加趨勢[1]。其不但引起呼吸系統(tǒng)炎癥,而且與哮喘的發(fā)病密切相關(guān),并可引起廣泛多系統(tǒng)肺外并發(fā)癥[2-3]。

        近年來,一種被稱為社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征(community acquired respiratory distress syndrome,CARDS)毒素的抗原在Mp感染中的作用引起人們的關(guān)注。最新研究發(fā)現(xiàn)肺炎支原體毒力因子社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(community acquired respiratory distress syndrome toxin,CARDS TX)是由MPN372基因編碼的591個氨基酸的蛋白質(zhì),主要分布于胞膜和胞質(zhì),具有二核酸腺苷核糖轉(zhuǎn)移酶活性[4],依靠膜聯(lián)蛋白A2結(jié)合真核細胞[5],參與侵犯呼吸道等病理生理過程[6-7],因而被認為是Mp的一個重要毒力因子。

        2015年司文等在使用重組CARDS毒素蛋白診斷肺炎支原體感染的血清學(xué)ELISA試驗中,發(fā)現(xiàn)其敏感性高于重組P1蛋白,可作為Mp感染診斷的新抗原[8],但比市售試劑盒的敏感性低。推測這可能是因為其分子量大(約70 kD),包被時分子結(jié)合數(shù)量少,一些抗原表位可能會被阻擋,從而導(dǎo)致敏感度下降。為了克服這個缺點,尋找更加有效的抗原位點,提高檢測的敏感性,本研究對其候選抗原表位進行了拼接表達,為探討其抗原活性打下基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 試劑 pET28a(+)表達載體由本試驗室保存;其他試劑均為國產(chǎn)。

        1.1.2 臨床標本來源 臨床肺炎支原體感染患者血清收集于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院,抗體效價大于1∶40 (富士瑞必歐株式會社生產(chǎn)的賽樂迪亞-麥可Ⅱ肺炎支原體抗體檢測試劑盒)。

        1.2 方法

        1.2.1 CARDS毒素蛋白基因的篩選 根據(jù) GenBank中CARDS毒素蛋白 (MPNE_0433)的基因序列 (CP002077.1),應(yīng)用在線分析工具 TMHMM進行分析,選取目標抗原表位進行連接,使用大腸桿菌偏好密碼子進行反向翻譯后,交生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆。

        1.2.2 CARDS重組表達載體的構(gòu)建 提取克隆重組質(zhì)粒和pET表達載體質(zhì)粒,分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切,回收CARDS拼接基因片段和線性pET28a載體,連接后轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)菌株。挑選克隆菌株進行培養(yǎng),提取質(zhì)粒進行酶切鑒定,篩選得到 pET-CARDS陽性菌株。

        1.2.3 重組CARDS毒素蛋白的誘導(dǎo)表達 pET-CARDS陽性菌株培養(yǎng)至OD600為0.5時,加入IPTG至1 μg/mL,誘導(dǎo) pET-CARDS陽性菌株表達CARDS拼接蛋白,5 h后菌液采樣進行SDS-PAGE電泳鑒定。

        1.2.4 免疫印跡鑒定 誘導(dǎo)菌和未誘導(dǎo)菌進行SDS-PAGE,然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜,分別使用6×His單克隆抗體和人肺炎支原體陽性血清作為一抗,使用HRP標記的蛋白G作為二抗進行免疫印跡,鑒定CARDS拼接蛋白的表達及免疫活性。

        2 結(jié) 果

        2.1 CARDS毒素蛋白基因的篩選 采用生物學(xué)軟件DNAMAN分析得到CARDS毒素蛋白的抗原表位(表1),選擇具有親水性的抗原表位(斜體加粗),使用linker(灰色底紋)進行連接,得到拼接蛋白序列:

        將拼接蛋白和CARDS毒素蛋白經(jīng)SMART在線分析,表明兩個蛋白均含有Pfam: Pertussis _ S1結(jié)構(gòu)域,E-Value分別為4e-31和1.1e-126,具有高度的相似性。

        然后采用大腸桿菌偏好密碼子進行反向翻譯,組成588 bp大小的基因序列:

        將序列兩端分別加上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點,送生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆。

        表1 CARDS毒素蛋白的抗原表位分析列表(斜體加粗為選取的抗原表位)

        Tab.1 Analysis of antigenic epitopes of CARDS protein (Italics bold is selected)

        No.StartpositionSequenceEndposition14PVRFVYRVDL13265LREYVPE71374RRAYLYE804102RQRQVVF1085122ALRTSFA1286138PIAAANVRSAWLVDAVPVE?PGHAHHPAGRVVE1697180NPHYQEL1868194PWLPTPGIATPVHLSIPQAAS?VAD217續(xù)表No.StartpositionSequenceEndposition9223SASLSFACPD23210243PLDKCIA24911256NLQSLPQYASSVKE26912271EDTPVYLRG27913295NNVFLVEV30214306QKSSFPQTIFFWDVYQRICLKD32715329TGAQISLSLTAFTT34216344YAGQLKVHLSVSAVNA35917369QDSAITQFRVSSEL38218400QHDLYVCPLK40919414DLEELQIIVDECTTHAQFVTM43420437ASTFFVDVQL44621450WRGYYYTPQLSG46122471GQIFYDLKTSKIFFV48523490NVFFLHN49624533LTIPSVEG54025542NFRHIRCYAD55126553QQLKVII55927579EDKILVK585

        2.2 pET-CARDS表達載體的構(gòu)建 構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒進行酶切鑒定,出現(xiàn)600 bp的條帶,與預(yù)期結(jié)果相符(圖1),表明表達載體構(gòu)建成功。

        M:DL2000 Marker;1:restriction enzyme analysis圖1 質(zhì)粒酶切Fig.1 Restriction enzyme analysis

        2.3 重組CARDS毒素蛋白的誘導(dǎo)表達 重組陽性菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后出現(xiàn)一條明顯的30 kD的蛋白條帶(圖2),與預(yù)期重組蛋白大小一致,表明拼接蛋白得到表達。

        M:Protein Marker;1:Uninduced bacteria;2:Induced bacteria圖2 蛋白的誘導(dǎo)表達Fig.2 Induced expression

        2.4 表達蛋白的免疫印跡鑒定 用6×His單克隆抗體進行免疫印跡分析,出現(xiàn)特異性的條帶(圖3A)。用人肺炎支原體陽性血清作為一抗進行免疫分析,在30 kD處也出現(xiàn)特異性的條帶(圖3B)。

        A:WB by 6 HIS monoclonal antibody;B:WB by Human positive serum M:Protein marker;1:Uninduced bacteria;2:Induced bacteria圖3 重組蛋白的免疫印跡Fig.3 Western-blot of rCARDS

        3 討 論

        Mp的CARDS 毒素蛋白由591個氨基酸構(gòu)成,其 N-末端為 ADP-核糖基化活化所必須,C-末端和完整的 CARDS毒素一樣有誘導(dǎo)哺乳動物細胞空泡化 (Vacuolization)的作用[4]。因此認為,CARDS毒素蛋白可能為Mp的毒力因子,參與Mp的增殖、接合,并與感染的持久化及呼吸道炎癥反應(yīng)有關(guān)。2011年P(guān)eters等在難治性哮喘患者的血清標本檢測中發(fā)現(xiàn),Mp陽性組、持續(xù)陽性組中 CARDS毒素和P1蛋白的IgM抗體顯著比Mp陰性組高,從而表明它們具有較好的免疫性,有希望能用來發(fā)展一種 Mp的診斷方法[9]。2013年Novella等檢測了相關(guān)肺炎患者支氣管灌洗液中的Mp CARDS毒素的核酸、蛋白及血清中的抗體,結(jié)果顯示,CARDS毒素DNA、蛋白及抗體的檢出率均高于P1蛋白,約40%的被檢者CARDS毒素分析陽性[10]。

        Kannan等在Mp感染的實驗動物模型中,用重組CARDS毒素蛋白和P1黏附蛋白檢測感染小鼠血清中的抗體,兩種重組蛋白抗原檢測的抗體效價無明顯差異[2]。2015年司文等重組表達了CARDS毒素蛋白,對肺炎支原體感染血清的ELISA試驗,發(fā)現(xiàn)其敏感性高于重組P1蛋白,但檢測的敏感性仍低于商品試劑[8]。

        為提高CARDS毒素蛋白作為包被抗原的敏感性,本研究將其候選抗原表位進行了拼接,表達后可以和肺炎患者的陽性血清發(fā)生反應(yīng),這提示其具有較好的反應(yīng)原性,可純化后進行包被,比較敏感性的高低。

        至于拼接蛋白的反應(yīng)原性是某個抗原表位的作用,還是某些抗原表位的共同作用,以及哪個抗原表位起主導(dǎo)作用,尚需要進行進一步的研究。

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        Expression and identification of recombinant chimeric CARDS ofMycoplasmapneumoniae

        LIU Bao-shan1,ZHAO Zhi-na2,ZHAO Yu-jie3,WANG Gui-zhen3

        (1.ShenyangAgricultureUniversity,Shenyang110866,China;2.ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China;3.ChinaMedicalUniversity,Shenyang110013,China)

        We expressed multi-epitope chimeric protein of CARDS toxin protein ofMycoplasmapneumonia(Mp) in prokaryotic cells,and purified and investigated its immunoreactivity. A recombinant multi-epitope chimeric gene including ten critical epitopes was connected by linker and cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+),and transformed intoE.coliBL21(DE3) cells for expression under induction of IPTG. The antigenicity of expressed recombinant protein was identified with 6×His monoclonal antibody and human positive serum by Western blot. The recombinant expression vector pET-CARDS was constructed and the about 30 kDa recombinant chimeric protein expressed in BL21(DE3) successfully. Western blot analysis showed that it can react respectively with 6×His monoclonal antibodies and human positive serum. This study showed that the chimeric CARDS protein has an obvious immunoreactivity and a potential to be a new antigen for the diagnosis of Mp infection.

        Mycoplasmapneumonia; CARDS toxin; chimeric; expression; identification

        Wang Gui-zhen,Email: gzw004@126.com

        遼寧省社會科學(xué)發(fā)展基金(No.20122225019)項目資助

        王桂珍,Email:gzw004@126.com

        1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),沈陽 110866; 2.沈陽藥科大學(xué),沈陽 110016; 3.中國醫(yī)科大學(xué),沈陽 110013

        10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.003

        R375

        A

        1002-2694(2017)07-0588-04

        2016-06-29 編輯:張智芳

        Supported by the Department of Science and Technology of Liaoning Province (No. 20122225019)

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