江建華 倪金龍 吳爽 王德正

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聚合水稻溫敏核不育基因和反溫敏核不育基因創(chuàng)制永久核 不育系

江建華 倪金龍 吳爽 王德正*

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/國(guó)家水稻改良中心合肥分中心/安徽省水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230031；*通訊聯(lián)系人，E-mail：wdzhengqin@163.com)

【目的】制種安全是影響兩系雜交稻持續(xù)健康發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。本研究旨在探索解決兩系雜交水稻的制種安全隱患途徑?！痉椒ā恳?6個(gè)（光）溫敏核不育系與4個(gè)反溫敏核不育系配組并對(duì)F1育性進(jìn)行觀察，選擇矮紫S（溫敏核不育系）和矮雁s（反溫敏核不育系）為構(gòu)建永久核不育系的供源親本。通過(guò)回交將矮紫S和矮雁s的育性基因?qū)氲綐蛄河H本天豐B中，分別育成天豐B的近等基因系天豐S和天豐s?！窘Y(jié)果】天豐S和天豐s雜交獲得的天豐Ss即為永久核不育系。對(duì)天豐Ss的育性、可恢性等特性的研究表明，天豐Ss在自然長(zhǎng)日高溫和短日低溫下均表現(xiàn)不育；天豐Ss及其3個(gè)親本與5個(gè)恢復(fù)系雜交的F1組合結(jié)實(shí)率無(wú)明顯差異。【結(jié)論】永久核不育系的創(chuàng)制有望從根本上解決兩系雜交水稻的制種安全問(wèn)題。

水稻；溫敏核不育；反溫敏核不育; 永久核不育系

兩系法雜種優(yōu)勢(shì)的利用不受恢保關(guān)系限制，配組自由，與三系法相比能更廣泛地利用水稻種質(zhì)資源中存在的雜種優(yōu)勢(shì)[1-2]。近40年來(lái)，隨著研究的深入和種子生產(chǎn)技術(shù)的完善，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多抗組合不斷育成并得到大面積推廣，為我國(guó)的糧食安全做出了重要貢獻(xiàn)[3]。雖然目前兩系雜交水稻育種技術(shù)亦趨于成熟[4-5]。但是，頻繁發(fā)生的兩系雜交稻大面積制種失敗事件，已成為影響國(guó)家糧食安全和社會(huì)穩(wěn)定的隱患[6-7]。如何有效解決兩系雜交稻制種安全問(wèn)題已成為擺在我國(guó)水稻育種家及研究者面前的重要課題。為此，研究者提出了諸多解決方案，主要可以概括為以下三點(diǎn)：一是降低水稻兩用核不育系不育起點(diǎn)溫度以及延長(zhǎng)其耐低溫時(shí)間[7]；二是注重兩系制種基地和時(shí)段的選擇[8]；三是嚴(yán)格控制水稻兩用核不育系不育起點(diǎn)溫度的漂變[9]。以上方案能在一定程度上降低制種風(fēng)險(xiǎn)，然而并不能從根本上解決問(wèn)題。

目前報(bào)道的水稻兩用核不育系主要可以分為光溫敏（長(zhǎng)日高溫不育型）、溫敏（高溫不育型）、反光溫敏（短日低溫不育型）和反溫敏（低溫不育型）4種類型[6-7,10]。但當(dāng)前生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的均為溫敏或光溫互作類型，對(duì)于反（光）溫敏核不育系的研究很少。自1991年李訓(xùn)貞等[11]對(duì)反溫敏核不育系N-10s和N-13s的育性鑒定以來(lái)，目前僅有幾篇關(guān)于反溫敏核不育系研究的報(bào)道，且主要集中于反溫敏核不育系本身對(duì)溫、光反應(yīng)特性的研究[12-13]，尚未見(jiàn)反（光）溫敏核不育系育種利用的報(bào)道。梁滿中等[14]以反溫敏核不育系go543S與光溫敏核不育系農(nóng)墾58S、7001S、培矮64S和長(zhǎng)選3S配制雜交F1，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)組合的F1在自然長(zhǎng)日高溫、短日低溫和不同人工光、溫處理?xiàng)l件下花粉均表現(xiàn)不育，自交結(jié)實(shí)率為0，并未出現(xiàn)像go543S或農(nóng)墾58S那樣的育性轉(zhuǎn)換現(xiàn)象。本課題組多年來(lái)一直從事兩系雜交水稻的育種研究工作[15-16]，受梁滿中等[14]反溫敏核不育系與光溫敏核不育系雜交F1不育的啟發(fā)，本研究利用橋梁親本構(gòu)建了溫敏核不育和反溫敏核不育的近等基因系，通過(guò)對(duì)近等基因系雜交F1的育性、可恢性、產(chǎn)量競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)及繁殖特性進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為解決兩系雜交水稻的制種安全問(wèn)題提供些許參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料包括20個(gè)不育系，其中秈型溫敏核不育系9個(gè)，粳型光溫敏核不育系7個(gè)，秈型反溫敏核不育系3個(gè)以及粳型反溫敏核不育系1個(gè)；恢復(fù)系5個(gè)和橋梁親本1個(gè)。詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 永久核不育系供源親本的篩選

2008年夏在安徽廬江基地、2009年春在海南陵水基地利用9個(gè)秈型溫敏核不育系與3個(gè)秈型反溫敏核不育系以及7個(gè)粳型光溫敏核不育系和1個(gè)粳型反溫敏核不育系進(jìn)行正反交兩兩配組，共配制了68個(gè)組合。2009年夏將配制成功的59個(gè)F1組合及其親本種植于廬江基地，5月8日播種，6月7日移栽。各材料種植3行，每行9株，株行距16.7 cm×26.7 cm。以各組合中50%的植株幼穗中部露出劍葉葉鞘時(shí)記為該組合的抽穗期；于抽穗20 d后調(diào)查各F1組合中間5株的總有效穗數(shù)、總粒數(shù)和總實(shí)粒數(shù)，計(jì)算單穗總粒數(shù)、單穗實(shí)粒數(shù)以及結(jié)實(shí)率；對(duì)于不結(jié)實(shí)的雜交組合割茬再生，并調(diào)查再生植株抽穗15 d后的單穗總粒數(shù)、單穗實(shí)粒數(shù)和結(jié)實(shí)率，方法同上。

1.2.2 永久核不育系直接親本的選育

以優(yōu)質(zhì)、多抗、綜合性狀優(yōu)良的骨干親本三系保持系天豐B為橋梁親本，分別利用篩選到的供源親本矮紫S和矮雁s與其雜交、自交以及回交，直至獲得除育性外，其余性狀與天豐B基本一致的溫敏核不育系（天豐S）和反溫敏核不育系（天豐s），選育過(guò)程如圖1。

1.2.3 永久核不育系育性調(diào)查

2015年4月30日起將永久核不育系天豐Ss、直接親本天豐S、天豐s以及供源親本矮紫S分8期播種于廬江基地，每10 d一期，25 d后移栽。自始穗期開(kāi)始，每隔2~4 d各材料分別取5穗，每穗取上、中、下3個(gè)部位已成熟但尚未開(kāi)花的花藥1個(gè)，用1%的碘-碘化鉀溶液染色，鏡檢3個(gè)視野中的花粉染色情況，統(tǒng)計(jì)不同播期各材料的花粉敗育率，直至抽穗結(jié)束；同時(shí)每次鏡檢時(shí)各材料均選5個(gè)已抽穗但尚未開(kāi)花的穗套自交袋并標(biāo)注日期，成熟后考查單穗總粒數(shù)和實(shí)粒數(shù)，計(jì)算自交結(jié)實(shí)率。

1.2.4 永久核不育系的可恢性、產(chǎn)量競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)及繁殖特性調(diào)查

可恢性和產(chǎn)量競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的測(cè)定：2016年春在海南陵水以永久核不育系及其3個(gè)親本為母本與5個(gè)秈稻恢復(fù)系按×模式配制20個(gè)雜交組合；2016年正季將上述所配組合及其親本種植于安徽廬江基地，5月10日播種，6月10日移栽。單本種植，各材料均種植3行，每行9株，株行距16.7 cm×26.7 cm。3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，常規(guī)栽培管理。成熟時(shí)，各小區(qū)取第2行中間5株調(diào)查單株有穗數(shù)、總粒數(shù)和實(shí)粒數(shù)，曬干脫粒揚(yáng)凈后稱重，計(jì)算單株總粒數(shù)、單株實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量；從各重復(fù)中隨機(jī)取出飽滿稻谷1000粒稱重，3次重復(fù)的均值即為該材料（組合）的千粒重。

繁殖特性調(diào)查：2016年7月10日將天豐S和天豐s播種于廬江基地，7月29日移栽，株行距13.3 cm×13.3 cm，父母本間距26.7 cm，天豐S與天豐s行數(shù)比為10∶2，栽插面積0.09 hm2，父母本開(kāi)花期噴施赤霉素調(diào)節(jié)株高，并輔以人工趕粉，成熟時(shí)收種，曬干揚(yáng)凈稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 永久核不育系供源親本的篩選

7個(gè)粳型光溫敏核不育系與1個(gè)粳型反溫敏核不育系成對(duì)正反交配制了14個(gè)F1組合，同一組合正反交抽穗期基本一致。其中，粳518S/粳5278s F1正反交組合8月2日抽穗，粳519S/粳5278s F1正反交組合抽穗期分別為8月9日和11日，其余10個(gè)粳型正反交組合的抽穗期介于8月24－28日。

由表2可知，14個(gè)粳型F1正反交組合的結(jié)實(shí)率為68.99%~88.26%，表現(xiàn)正?？捎?。說(shuō)明反溫敏核不育系粳5278s可以恢復(fù)本研究所用的7個(gè)粳型核不育系的育性，反之亦然。

秈型溫敏核不育系2301S、廣茉S、廣占63S和新二S與3個(gè)秈型反溫敏核不育系所配24個(gè)正反交組合的抽穗期介于8月11－23日；24個(gè)正反交組合結(jié)實(shí)率為65.71%~86.52%，表現(xiàn)正常結(jié)實(shí)(表2)。說(shuō)明上述4個(gè)溫敏核不育系可以恢復(fù)這3個(gè)秈型反溫敏核不育系的育性，這3個(gè)秈型反溫敏核不育系也可以恢復(fù)以上4個(gè)秈型溫敏核不育系的育性。

表1 試驗(yàn)材料

圖1 利用天豐B為橋梁親本選育正反溫敏核不育近等基因系天豐S和天豐s

Fig. 1. Breeding procedures of near iso-genic lines Tianfeng S with thermos-sensitive genic male and Tianfeng s with reverse thermos-sensitive genic male by using bridge parent of Tianfeng B.

1892S、P88S、矮占43S、矮紫S和培矮64S與3個(gè)秈型反溫敏核不育系所配21個(gè)正反交組合的抽穗期介于8月21－28日，所有21個(gè)正反交組合的自交結(jié)實(shí)率均低于1.24%，表現(xiàn)不育（表2）。將上述21個(gè)組合的F1植株割茬再生，再生植株抽穗期為9月25日至10月5日，各組合再生植株抽穗15 d后的低溫自交結(jié)實(shí)率均為0，表現(xiàn)徹底不育。其中，P88S/雁農(nóng)s、矮紫S/雁農(nóng)s和矮紫S/矮雁s 3個(gè)正反交組合不同時(shí)期均徹底敗育，是創(chuàng)制永久核不育系供源親本的理想材料。結(jié)合表2不同組合每穗總粒數(shù)來(lái)看，矮紫S/矮雁s正反交組合的每穗總粒數(shù)多于P88S/雁農(nóng)s和矮紫S/雁農(nóng)s組合，且矮紫S和矮雁s均是本課題組自行選育、含有新型矮稈基因的2個(gè)核不育材料?；诖?，本研究將矮紫S和矮雁s作為創(chuàng)制永久核不育系的供源親本。

2.2 永久核不育系的育性觀察

利用供源親本矮紫S和矮雁s分別與橋梁親本雜交并不斷回交，獲得除育性外其余性狀與天豐B一致的2個(gè)近等基因系天豐S（溫敏核不育系）和天豐s（反溫敏核不育系）。2015年春將天豐S和天豐s種植于海南陵水基地并雜交，獲得天豐S與天豐s的F1（天豐Ss），天豐Ss即為創(chuàng)制的永久核不育系。2015年夏將天豐Ss及其3個(gè)親本（矮紫S、天豐S和天豐s）種植于安徽廬江基地以觀察其育性。由表3可知，4個(gè)不育系花粉敗育率與套袋自交結(jié)實(shí)率結(jié)果一致。3種類型的不育系在不同溫度條件下，育性表現(xiàn)不同。溫敏核不育系矮紫S和天豐S長(zhǎng)日高溫表現(xiàn)不育，其中供源親本矮紫S不育期從8月1日持續(xù)至9月9日，花粉敗育率達(dá)99.94%，套袋自交結(jié)實(shí)率不超過(guò)0.38%；而利用矮紫S選育的溫敏核不育系天豐S的不育期更長(zhǎng)，從7月27日一直持續(xù)至9月12日，花粉敗育率高于99.61%，套袋自交結(jié)實(shí)率小于0.36%?？梢?jiàn)，創(chuàng)制永久核不育系的直接親本天豐S比供源親本矮紫S的不育性更好。

反溫敏核不育系天豐s在8月1日至9月9日間花粉敗育率為0.33%~78.56%，套袋自交結(jié)實(shí)率在6.78%~86.54%，說(shuō)明天豐s長(zhǎng)日高溫下表現(xiàn)可育。

永久核不育系天豐Ss從始穗期（7月25日）至調(diào)查結(jié)束（9月19日），其花粉敗育率均達(dá)到99.51%以上，套袋自交結(jié)實(shí)率更是低于0.20%，說(shuō)明永久核不育系天豐Ss無(wú)論是長(zhǎng)日高溫還是短日低溫下均表現(xiàn)不育。

2.3 永久核不育系天豐Ss的可恢性及產(chǎn)量競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的測(cè)定

永久核不育系天豐Ss及其3個(gè)親本與揚(yáng)稻6號(hào)等5個(gè)秈稻恢復(fù)系測(cè)配，成熟期調(diào)查所配組合的結(jié)實(shí)率及產(chǎn)量相關(guān)性狀。由表4可知，20個(gè)組合的結(jié)實(shí)率為69.8%~86.7%，其中利用永久核不育系天豐Ss所配5個(gè)組合的結(jié)實(shí)率更是高達(dá)82.6%，說(shuō)明天豐Ss的育性可恢復(fù)。從另外4個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀來(lái)看，除千粒重外，利用永久核不育系的3個(gè)親本所配15個(gè)組合的單株有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)和單株產(chǎn)量中分別有14個(gè)、10個(gè)和12個(gè)，小于利用天豐Ss所配相應(yīng)組合。由上可知，本研究創(chuàng)制的永久核不育系天豐Ss的育性是可恢的，且其所配組合具有一定的產(chǎn)量競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

2.4 永久核不育系天豐Ss的繁殖特性

溫敏核不育系天豐S和反溫敏核不育系天豐s是創(chuàng)制永久核不育系天豐Ss的直接親本。天豐S和天豐s在相同溫度條件下，育性表現(xiàn)相反。因此，永久核不育系天豐Ss的繁殖較當(dāng)前生產(chǎn)上應(yīng)用的溫敏核不育系如矮紫S等更加容易。如既能以天豐S為母本、天豐s為父本進(jìn)行高溫夏繁繁殖天豐Ss，也能以天豐s為母本、天豐S為父本進(jìn)行低溫秋繁或海南冬繁繁殖天豐Ss。2016年夏在安徽廬江基地以天豐S為母本，天豐s為父本制種0.09 hm2，收獲天豐Ss種子97.5 kg，平均1083 kg/hm2。產(chǎn)量較低可能與抽穗揚(yáng)花期遇到長(zhǎng)時(shí)間異常高溫導(dǎo)致父本天豐s花粉活力不足、異交結(jié)實(shí)率較低有關(guān)。

表2 水稻溫敏核不育系與反溫敏核不育系正反交F1每穗粒數(shù)和結(jié)實(shí)率的調(diào)查

溫敏核不育系(♀)×反溫敏核不育系(♂)為正交，反之為反交。

Forward hybridization, thermo-sensitive genic male sterile line (female) × reverse thermo-sensitive genic male sterile line (male), on the contrary, reverse hybridization. SNP, No. of spikelets per panicle; FGP, No. of filled grains per panicle; SSR, Seed-setting rate.

表3 永久核不育系天豐Ss及其3個(gè)親本自然條件下的育性表現(xiàn)

3 討論

本研究利用7個(gè)粳型溫敏核不育系與1個(gè)粳型反溫敏核不育系以及9個(gè)秈型溫敏核不育系與3個(gè)秈型反溫敏核不育系雜交配制了59個(gè)正反交F1組合。其中，所有14個(gè)粳型F1正反交組合以及2301S等4個(gè)秈型溫敏核不育系與3個(gè)秈型反溫敏核不育系所配的24個(gè)F1正反交組合的結(jié)實(shí)率為65.71%~88.26%，表現(xiàn)正常可育，說(shuō)明上述所用的（光）溫敏核不育系中的不育基因與反溫敏核不育系中的不育基因聚合可以相互恢復(fù)育性。而1892S等另外5個(gè)秈型溫敏核不育系與矮雁s等3個(gè)秈型反溫敏核不育系所配21個(gè)正反交組合的自交結(jié)實(shí)率不超過(guò)1.24%，且這些組合的再生植株自交結(jié)實(shí)率為0，表現(xiàn)不育，這與梁滿中等[14]研究結(jié)果一致。通過(guò)系譜分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)秈型溫敏核不育系中，除2301S和新二S的育性基因（可能）來(lái)源于安農(nóng)S-1外，其余7個(gè)溫敏核不育系的育性基因均來(lái)源于農(nóng)墾58S。說(shuō)明安農(nóng)S-1的育性基因與雁農(nóng)s的育性基因可以相互恢復(fù)育性；但來(lái)源于農(nóng)墾58S的育性基因與來(lái)自雁農(nóng)s的育性基因聚合卻出現(xiàn)可育與不育兩種類型，如廣茉S和廣占63S與雁農(nóng)s等配組子代是可育的，而1892S、矮紫S、矮占43S、P88S和培矮64S與雁農(nóng)s等配組則出現(xiàn)永久不育的現(xiàn)象。說(shuō)明農(nóng)墾58S可能含有2個(gè)以上的育性基因，從而導(dǎo)致其衍生后代含有不同的育性基因，即廣茉S、廣占63S與1892S等分別含有農(nóng)墾58S中不同的育性基因。這需要我們進(jìn)一步從分子層面上對(duì)溫敏和反溫敏核不育系的育性遺傳機(jī)理及兩者之間的作用方式進(jìn)行遺傳解析。

表4 永久核不育系天豐Ss及其3個(gè)親本與5個(gè)秈稻恢復(fù)系配組F1產(chǎn)量相關(guān)性狀的表現(xiàn)

本研究將溫敏核不育系矮紫S和反溫敏核不育系矮雁s中的育性基因?qū)氲綐蛄河H本天豐B中，育成分別只含有矮紫S和矮雁s育性基因而其他性狀均與天豐B一致的近等基因系天豐S和天豐s。天豐S與天豐s雜交子代天豐Ss無(wú)論是長(zhǎng)日高溫還是短日低溫均表現(xiàn)不育，且天豐Ss與秈稻恢復(fù)系所配組合結(jié)實(shí)率正常并表現(xiàn)出一定的產(chǎn)量競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。因此，生產(chǎn)上利用永久核不育系天豐Ss進(jìn)行兩系雜交稻制種時(shí)將不會(huì)出現(xiàn)由于溫度的異常變化而導(dǎo)致的“打擺子”現(xiàn)象，為解決當(dāng)前兩系雜交稻制種安全問(wèn)題提供了一條新的思路。但是，本研究大部分內(nèi)容均是通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行的理論上的研究，生產(chǎn)上無(wú)論是永久核不育系天豐Ss的繁殖還是利用天豐Ss進(jìn)行制種之前，不僅要明確創(chuàng)制永久核不育系的2個(gè)直接親本（天豐S和天豐s）的育性轉(zhuǎn)換臨界溫度以及天豐S、天豐s和天豐Ss的特征特性，特別是與制種產(chǎn)量緊密相關(guān)的開(kāi)花習(xí)性，同時(shí)還要進(jìn)行不同生態(tài)環(huán)境中的小規(guī)模制種試驗(yàn)，為永久核不育系生產(chǎn)上大規(guī)模的應(yīng)用與推廣奠定基礎(chǔ)。

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Development of Permanent Genic Male Sterile Line by Pyramiding Thermo-sensitive Genic Male Sterile Genes and Reverse Temperature Induced Genic Male Sterile Genes in Rice (L.)

JIANG Jianhua, NI Jinlong, WU Shuang, WANG Dezheng*

(Institute of Rice ResearchAnhui Academy of Agricultural SciencesHefei Sub-center of China National Rice Improvement CenterAnhui Key Laboratory of Rice Genetics and BreedingHefei 230031China*Corresponding authorE-mailwdzhengqin@163.com)

【Objective】The security problem of seed production has seriously hampered the steadily and sustainable development of two-line hybrid rice. 【Method】Aizi S (thermos-sensitive genic male sterile, TSGMS) and Aiyan s (reverse temperature sensitive genic male sterile line, RTSGMS) were screened as the original parents to develop permanent genic sterile line (PGSL) according to the F1fertility of crosses among 16 (light-) TSGMS and 4 RTSGMS.The fertility genes were introduced into the near isogenic lines Tianfeng S and Tianfengs by backcrossing Aizi S and Aiyan s with the bridge parent Tianfeng B, respectively.Then, Tianfeng Ss, the PGSL, was observed from the cross between Tianfeng S and Tianfeng s. The fertility, restoration, competitive advantage of yield-related traits and reproductive characteristics of Tianfeng Ss were investigated. 【Result】Tianfeng Ss was completely sterile undernatural long day with high temperature and short day with low temperature.And no obvious difference was noted among the F1crosses from Tianfeng Ss and its three parents and five restorers in spikelet fertility percentage. 【Conclusion】The results showed that the newly developed PGSL might solve the security problem of seed production in two-line hybrid rice fundamentally.

rice; thermo-sensitive genic male; reverse thermo-sensitive genic male; permanent genic sterile line

10.16819/j.1001-7216.2017.7017

Q786; S511.0351

A

1001-7216(2017)04-0371-08

2017-02-14;

安徽省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(1501031096)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2016YFD0101105)。

修改稿收到日期：2017-03-30。