趙晨星 俞葉微 許益鵬 俞曉平

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褐飛虱兩個基因的克隆、多克隆抗體制備及 表達定位

趙晨星 俞葉微 許益鵬 俞曉平*

(中國計量大學生命科學學院浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，杭州310018；*通訊聯(lián)系人, E-mail: yxp@cjlu.edu.cn)

【目的】研究的兩個基因和在褐飛虱中的生物學功能?！痉椒ā客ㄟ^聚合酶鏈式反應擴增褐飛虱的兩個基因，并對其生物信息學進行分析。通過熒光定量PCR技術(qPCR)檢測了這兩個基因在褐飛虱不同組織和不同發(fā)育階段中的相對表達量。構(gòu)建原核表達載體，在表達菌株Rosetta中誘導重組目的蛋白的表達。通過Ni柱親和層析純化目的蛋白，并將純化得到的蛋白免疫新西蘭大白兔，得到多克隆抗體，并用ELISA檢測抗體效價，Western blotting檢測抗體特異性。利用上述抗體，通過免疫熒光實驗觀察目的蛋白在褐飛虱卵巢中的表達和定位?！窘Y(jié)果】克隆并鑒定了兩個基因，分別命名為和(GenBank登錄號分別為KY082900、KY082901)。系統(tǒng)進化樹表明，和在半翅目昆蟲中較為保守。蛋白結(jié)構(gòu)預測和基因時空表達分析說明，和在褐飛虱中可能有著不同的功能。ELISA和Western blotting結(jié)果表明，制備的NlDNM1L-1和NlDNM1L-2多克隆抗體效價高、特異性好。免疫熒光實驗結(jié)果顯示，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飛虱卵巢濾泡細胞中普遍表達，可能與褐飛虱卵巢發(fā)育和成熟有關，它們也可能與類酵母共生菌入侵褐飛虱卵巢有關?！窘Y(jié)論】獲得了和基因序列，了解了其基本的生物信息，并闡明了其時空表達特征；成功制備其多克隆抗體，并初步了解了NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飛虱卵巢中的表達和定位。這些結(jié)果為深入研究NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飛虱中的功能奠定了基礎。

褐飛虱；；基因克??；表達模式；原核表達；多克隆抗體；表達定位

褐飛虱(St?l)屬于半翅目飛虱科(Hemiptera：Delphacidae)，屬遠距離遷飛性害蟲，給亞洲國家的水稻生產(chǎn)造成極大威脅，嚴重時可造成水稻絕產(chǎn)[1-3]。褐飛虱通過刺吸式口器吸取水稻汁液為害水稻，并可傳播水稻鋸齒葉矮縮病和水稻草狀矮縮病等病毒病[4,5]。長期以來主要通過噴灑化學農(nóng)藥和種植抗性水稻品種對褐飛虱進行防治，導致褐飛虱對很多農(nóng)藥和抗性水稻品種產(chǎn)生抗性，這對有效控制褐飛虱危害是一個巨大挑戰(zhàn)[6-8]。

遷飛性昆蟲的遷飛與卵巢發(fā)育密不可分，所以研究昆蟲生殖發(fā)育是研究害蟲發(fā)生規(guī)律及預測預報的重要方向[9,10]。昆蟲卵巢的發(fā)育依賴于卵黃蛋白原等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和沉積。有研究表明卵黃蛋白原通過胞吞作用進入卵母細胞，以卵黃素的方式進行沉積，在這過程中涉及ACTIN、CLATHRIN、DYNAMIN等蛋白[11,12]。發(fā)動蛋白DYNAMIN在網(wǎng)格蛋白CLATHRIN介導的內(nèi)吞作用中發(fā)揮重要作用[13,14]。在內(nèi)吞作用過程中，DYNAMIN在交叉蛋白INTERSECTIN的作用下被召集到膜上，吞蛋白ENDOPHILIN和雙載蛋白AMPHIPHYSIN使內(nèi)吞小泡的頸部收縮，促進DYNAMIN圍繞頸部聚合形成多聚體。在GTP酶水解GTP產(chǎn)生的能量的作用下，DYNAMIN多聚體發(fā)生構(gòu)象改變，使得內(nèi)吞小泡的頸部進一步收縮，從而使內(nèi)吞小泡與質(zhì)膜分離，DYNAMIN在這個過程中發(fā)揮“剪刀”的作用[15-17]。研究表明，DYNAMIN對于哺乳動物腦中突觸的傳遞發(fā)揮重要作用，神經(jīng)元對DYNAMIN 1缺失很敏感并會引起突觸內(nèi)吞作用不正常運作，有多種神經(jīng)性疾病與DYNAMIN有關[18-20]。DYNAMIN的作用不僅限于內(nèi)吞作用，還參與多種細胞活動，包括細胞分裂、細胞膜的重排、細胞骨架的調(diào)節(jié)、微管動態(tài)變化、細胞凋亡等[21,22]。

為了解褐飛虱基因的功能，本研究克隆了褐飛虱的兩個基因和，制備了多克隆抗體并應用免疫熒光來研究其在褐飛虱卵巢中的表達和定位，以期為深入研究該基因在褐飛虱中的生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

試驗褐飛虱為本實驗室(浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室)在水稻品種TN1上長期飼養(yǎng)的種群，室內(nèi)飼養(yǎng)溫度(27±1)℃，相對濕度80%，光照周期為14 h光照/10 h黑暗。

1.2 褐飛虱總RNA提取和cDNA第1鏈的合成

取5頭褐飛虱羽化后3d的成蟲，用RNA 提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)提取褐飛虱總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和蛋白核酸定量分析儀(Thermo)檢驗RNA的完整性和濃度，用于cDNA第1鏈的合成。

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa公司)將褐飛虱總 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

表1 基因克隆、原核表達引物堿基序列

下劃線表示酶切位點。

Underline represents restriction enzyme site.

1.3 基因克隆與序列分析

根據(jù)褐飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到基因的相關序列。利用Primer Premier 5.0設計引物(表1)，由上海生工生物技術有限公司合成。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用Axygen公司生產(chǎn)的DNA凝膠回收試劑盒(AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit)進行PCR產(chǎn)物的回收，回收產(chǎn)物連于pMD-19T質(zhì)粒載體(TaKaRa公司)，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞JM109(本實驗室保存)中，隨機挑取10個克隆斑，用表1中基因克隆引物進行PCR篩選陽性克隆，送交上海睿迪生物有限公司進行測序。

利用Clustal X進行多重序列比較后，用MEGA6的鄰接法(Neighbor-Joining)制作進化樹，自展(bootstrap)值為1000。通過PROSITE網(wǎng)站(http://prosite.expasy.org/)預測蛋白結(jié)構(gòu)域，通過Lasergene Protean軟件預測蛋白二級結(jié)構(gòu)，Phyre2在線網(wǎng)站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/)模擬蛋白質(zhì)三級構(gòu)象。

1.4 基因的時空表達分析

采用熒光定量PCR(qPCR)技術分析目的基因的時空表達。反應體系共25 μL，其中12.5 μL熒光定量PCR檢測試劑(SYBR Green Premix Ex酶，TaKaRa)，2 μL模板，上下游引物各1 μL(表1)。將1~5齡若蟲和羽化后1~5 d雌成蟲作為不同發(fā)育時期樣品，將雌成蟲卵巢、腸道、脂肪體以及其他組織作為不同組織樣品，分別提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2－△△Ct法計算基因的相對表達量，內(nèi)參基因選用褐飛虱，所有樣品設置3個重復?；赥ukey檢驗，并使用SPSS 18.0進行單因素方差分析。

1.5 原核表達載體的構(gòu)建

根據(jù)得到的序列，設計分別含有HⅠ、dⅢ和RⅠ、dⅢ(TaKaRa公司)酶切位點的特異性引物(表1)，用于構(gòu)建陽性克隆質(zhì)粒，通過PCR和雙酶切鑒定后，送交上海睿迪生物有限公司測序。

采用生工生物工程有限公司生產(chǎn)的SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取測序驗證正確的克隆質(zhì)粒，對提取的質(zhì)粒進行雙酶切，回收基因片段，與同樣經(jīng)過雙酶切的表達載體pET-28a(本實驗室保存)連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸桿菌JM-109感受態(tài)細胞中，PCR篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒進行酶切分析。選取鑒定結(jié)果為陽性的重組質(zhì)粒送交公司測序確認。

1.6 重組蛋白質(zhì)的誘導表達

將pET-28a重組表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta (本實驗室保存)中，通過青島高科園海博生物技術有限公司HB-PET自誘導培養(yǎng)基進行誘導表達。蛋白質(zhì)表達情況采用碧云天生物技術公司生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒進行蛋白電泳分析。離心收集上述誘導的大腸桿菌菌液，經(jīng)超聲破碎(超聲功率為70 W，時間10 min，工作5 s，間隔15 s)，分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色后分析蛋白的表達。

1.7 重組蛋白的純化

由于采用pET-28a作為表達載體，而所插入的基因片段不包含信號肽編碼序列，所以可以利用表達載體pET-28a所帶的6×His標簽純化重組蛋白。用8 mol/L尿素變性溶解包涵體，采用純化樹脂(Ni-NTA His·Bind Resin，上海七海復泰生物技術有限公司)親和層析純化重組蛋白。收集各部分洗脫液，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析各部分洗脫液。純化后的蛋白用超濾管(Amicon?ProMerck, Millipore公司)超濾濃縮，得到的蛋白液經(jīng)過蛋白濃度檢測后，干燥成粉末狀，－70℃下密封保存。

1.8 重組蛋白的多抗血清制備

用PBS溶解上述融合蛋白的蛋白粉，皮下注射新西蘭大白兔4次，首次劑量為500 μg。注射白兔所用的弗氏佐劑購自Sigma公司，第一次免疫前與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化，第2~4次使用不完全弗氏佐劑。第一次免疫后每兩周加強免疫一次，期間可取少量血清檢測效價，直到效價符合實驗要求后，于兔頸動脈大量取血，采用離心的方法分離血清，分裝后－70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 抗體效價檢測

采用間接ELISA方法進行抗體效價檢測。將純化蛋白用包被稀釋液稀釋到1 g/L，依次經(jīng)過包被、封閉、不同稀釋比例的兔抗血清一抗孵育、HRP-羊抗兔IgG二抗孵育，最后加TMB底物顯色液，37℃避光放置5 min，加入終止液，20 min內(nèi)用酶標儀測定450值。HRP-羊抗兔IgG和TMB底物顯色液購自Solarbio科技有限公司。

1.10 Western blotting檢測目的基因在褐飛虱體內(nèi)的表達

取3頭褐飛虱羽化后3 d的雌成蟲，加入100 μL組織細胞快速裂解液(RIPA)和1 μL蛋白酶抑制劑(PMSF)，放入快速研磨振蕩器中研磨，在4℃、5000下離心10 min，吸取上清液即是褐飛虱總蛋白。取上清液SDS-PAGE凝膠電泳后，通過濕式轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(NC)上，然后將膜放入封閉液(5%脫脂奶粉)中室溫封閉2 h，經(jīng)TBST洗滌后再加入1∶500稀釋的目的蛋白抗血清溶液，4℃下孵育過夜，用TBST洗去未結(jié)合的一抗，加入1∶500稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG，室溫孵育8 h，用TBST洗滌，最后加入DMB顯色液避光顯色。組織細胞快速裂解液(RIPA)、蛋白酶抑制劑(PMSF)、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG和DMB顯色液購自Solarbio科技有限公司。

1.11 免疫熒光雜交

免疫熒光實驗中用到的免疫染色洗滌液、固定液、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液以及抗熒光淬滅封片液購自碧云天生物技術公司，免疫熒光二抗(Dylight 488, Goat anti Rabbit IgG)購自Abbkine公司。收集雌成蟲，在解剖鏡下、PBS溶液中解剖獲得卵巢，經(jīng)免疫染色洗滌液洗滌后，加免疫染色固定液于濕盒中，4℃下過夜，洗滌后再加免疫染色封閉液室溫封閉2 h，然后依次加入稀釋500倍一抗4℃下過夜，稀釋500倍的二抗室溫避光2 h。用DAPI染料標記細胞核、DiI染料標記卵巢樣品中的脂類物質(zhì)，在Leica(SP8)共聚焦顯微鏡下根據(jù)細胞核和細胞膜的位置判斷目的蛋白的亞細胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 NlDNM1L-1和NlDNM1L-2克隆和序列分析

本研究克隆得到了褐飛虱的兩個基因，分別命名為和(GenBank登錄號分別為KY082900、KY082901)。的開放閱讀框為2073 bp，編碼690個氨基酸，預測分子量為77.55 kD，理論等電點為7.12；的開放閱讀框為2148 bp，編碼715個氨基酸，預測分子量為80.35 kD，理論等電點為6.72(圖1)。二者編碼蛋白的同源性為66%，差異主要體現(xiàn)在近C端(圖1)。

圖1 NlDNM1L-1和NlDNM1L-2氨基酸序列比對

Fig. 1. Amino acid sequence alignments of NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2

圖2 NlDNM1L-1(A)和NlDNM1L-2(B)蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

Fig. 2. Tertiary structure of NlDNM1L-1(A) and NlDNM1L-2(B) protein.

圖3 NlDNM1L-1和NlDNM1L-2氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析

Fig. 3. Phylogenetic analysis of NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2by the neighbor-joining method.

使用Phyre2在線網(wǎng)站對NlDNM1L-1和NlDNM1L-2蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)合PROSITE預測的結(jié)構(gòu)域以及Lasergene Protean軟件預測的二級結(jié)構(gòu)，推測NlDNM1L-1和NlDNM1L-2都有GTPase結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域(MD)、GTPase效應結(jié)構(gòu)域(GED)和普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域(PH) (圖2)。預測的NlDNM1L-1和NlDNM1L-2三級結(jié)構(gòu)較為類似，但PH結(jié)構(gòu)域有所不同。在PH結(jié)構(gòu)域中，NlDNM1L-1只有3個-折疊，而NlDNM1L-2有7個-折疊。

通過NCBI下載與和基因同源的其他半翅目昆蟲的dynamin-1-like氨基酸序列以及雙翅目、鱗翅目、鞘翅目、膜翅目和哺乳動物、爬行動物等的dynamin-1-like氨基酸序列，用MEGA6的鄰接法（Neighbor-Joining）制作進化樹。如圖3顯示，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2與豌豆長管蚜、點蜂緣蝽、柑桔木虱系統(tǒng)發(fā)育關系較近，說明NlDNM1L-1、NlDNM1L-2在半翅目中較保守。

圖中不同小寫字母表示差異達5%顯著水平。

Fig. 4. Expression ofandin differenttissues(A, B) and at different developmental stages(C, D)

A－克隆載體的構(gòu)建。其中，M為DNA標記；泳道1為pMD-19T-NlDNM1L-1重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；泳道2為pMD-19T-NlDNM1L-2重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。箭頭所指為酶切釋放的基因片段。B－原核表達載體的構(gòu)建。其中，M為DNA標記；泳道1為pET-28a-NlDNM1L-1重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；泳道2為pET-28a-NlDNM1L-2重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。箭頭所指為酶切釋放的基因片段。

Fig. 5. Construction of cloning vector(A) and prokaryotic expression vector(B and C).

2.2 NlDNM1L-1和NlDNM1L-2的時空表達分析

熒光定量PCR結(jié)果顯示，和在褐飛虱不同組織中表達量不同，其中卵巢中表達量最高，脂肪體、腸道的表達量次之(圖4-A、B)。和在褐飛虱各個發(fā)育階段均有表達，在若蟲和成蟲體內(nèi)表達量雖有上下波動，但總體變化不大；而的表達模式不同，在成蟲體內(nèi)的表達量顯著高于若蟲，羽化后2 d表達量達到高峰，并在之后維持在高水平(圖4-C、D)。

2.3 重組蛋白質(zhì)的誘導表達與重組表達蛋白純化

經(jīng)酶切鑒定和測序驗證，成功構(gòu)建和的重組原核表達載體，pET-28a- NlDNM1L-1和pET-28a-NlDNM1L-2(圖5)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta中，經(jīng)37℃誘導8 h后表達產(chǎn)物通過SDS-PAGE電泳分析，pET-28a- NlDNM1L-1和pET-28a-NlDNM1L-2誘導產(chǎn)物分別為80 kD和85 kD大小的特異性蛋白條帶，而預期融合表達的NlDNM1L-1和NlDNM1L-2大小應為80 kD和83 kD，這說明目的蛋白被成功誘導表達。經(jīng)超聲破碎發(fā)現(xiàn)，表達的蛋白以包涵體的形式存在，上清液中只有少量可溶性蛋白的表達(圖6-A)。

A圖中，M為蛋白標記；泳道1為空的Rosetta菌株；泳道2為pET-28a/Rosetta；泳道3，4和5分別為pET-28a-NlDNM1L-1/ Rosetta誘導后的表達產(chǎn)物，裂解后的上清液和裂解后的沉淀；泳道6，7和8分別為pET-28a-NlDNM1L-2/Rosetta誘導后的表達產(chǎn)物，裂解后的上清液和裂解后的沉淀。箭頭指表達的NlDNM1L-1和NlDNM1L-2。B和C圖分別為NlDNM1L-1、NlDNM1L-2蛋白的純化。M為蛋白標記；泳道1為經(jīng)PBS洗滌后的pET-28a-NlDNM1L-1/Rosetta (pET-28a-NlDNM1L-2/Rosetta)裂解后的沉淀；泳道2~6為50、80、100、120、150 mmol/L咪唑洗脫下的蛋白；泳道7為純化后的蛋白經(jīng)超濾所得產(chǎn)物。箭頭分別指NlDNM1L-1、NlDNM1L-2蛋白。

Fig. 6. Expression analysis(A) and purification(B and C) of expressed NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 inRosetta by SDS-PAGE.

M－蛋白標記；泳道1－褐飛虱總蛋白中的內(nèi)源NlDNM1L-1的檢測；泳道2－褐飛虱總蛋白中的內(nèi)源NlDNM1L-2的檢測。箭頭所指用制備的NlDNM1L-1、NlDNM1L-2多克隆抗體檢測到的NlDNM1L-1、NlDNM1L-2蛋白條帶。

Fig. 7. Western blotting analysis of polycolonal antibodies.

融合有6×His的NlDNM1L-1、NlDNM1L-2重組蛋白的包涵體經(jīng)過PBS反復洗滌后，用8 mol/L尿素變性溶解，在Ni-NTA柱親和層析過程中采用10~200 mmol/L咪唑的梯度洗脫，結(jié)果顯示在50 mmol/L咪唑洗脫下開始出現(xiàn)單一的蛋白。洗脫收集的蛋白經(jīng)超濾濃縮后，SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組蛋白的純度達90%以上(圖6-B、C)。

2.4 抗血清的制備及Western blotting檢測

血清抗體的效價ELISA檢測表明，NlDNM1L-1、NlDNM1L-2抗血清效價可達1∶100 000。為檢測所得抗體的特異性，提取褐飛虱總蛋白為抗原，NlDNM1L-1、NlDNM1L-2抗血清(1∶500)為一抗抗體，進行Western blotting檢測。結(jié)果表明，NlDNM1L-1、NlDNM1L-2抗血清分別能在80 kD和85 kD左右雜交得到一條特異性的條帶(圖7)，與預期蛋白80 kD和83 kD一致，說明所制備的抗體特異性良好，可以與內(nèi)源性的NlDNM1L-1、NlDNM1L-2結(jié)合。

2.5 NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飛虱卵巢中的表達和定位

NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飛虱卵巢中的免疫熒光實驗表明(圖8)，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在卵巢管中普遍存在，主要存在于濾泡細胞的細胞質(zhì)中，在細胞核內(nèi)則少量分布，在胞外分布很少(圖8-B、E、H、K)。與紅色信號的脂類物質(zhì)定位相比，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2與之定位較為一致(圖8)。同時，也可以發(fā)現(xiàn)，正在侵入卵巢的類酵母共生菌(yeast-like symbiont, YLS)周圍也有綠色信號(圖8-E、K)，說明NlDNM1L-1和NlDNM1L-2與YLS共定位。

DAPI染料在紫外激光下顯示藍色，DiI染料在552nm激光下顯示紅色，免疫熒光二抗在488 nm激光下顯示綠色。Pe、TO、PO、Tr、Oo、FC、EP和YLS分別代表卵巢柄、倒一卵母細胞、倒二卵母細胞、滋養(yǎng)區(qū)、卵母細胞、濾泡細胞、上皮栓和類酵母共生菌。

DAPI shows blue under UV laser. DiI shows red under 552nm laser. Fluorescent secondary antibody shows green under 488 nm laser. Pe, TO, PO, Tr, Oo, FC, EP and YLS represent petiole of ovariole, terminal oocyte, penultimate oocyte, tropharium of ovariole, oocyte, follicle cell, epithelial plug and yeast-like symbiont, respectively.

圖8 免疫熒光檢測NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飛虱卵巢中的表達

Fig. 8. Expression analysis of NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 inovary by immunofluorescence.

3 討論

Dynamin是細胞骨架蛋白的成員，與胞吞胞吐作用有關。經(jīng)典的Dynamin蛋白GTP酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合和水解GTP，參與能量代謝；PRD結(jié)構(gòu)域即富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域，與胞吞作用中另外三種蛋白交叉蛋白、吞蛋白(Endophilin)和雙載蛋白(Amphiphysin)的SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合；MD、GED結(jié)構(gòu)域，參與自身聚合與GTP酶活性的調(diào)節(jié)；還有一個位于MD和GED之間的可變區(qū)域，在dynamin 1中它是PH結(jié)構(gòu)域，能結(jié)合磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸，刺激GTP酶活性,促進囊泡的形成[17,23]。本研究中NlDNM1L-1 、NlDNM1L-2是Dynamin-1-like蛋白的亞型，它們沒有PRD結(jié)構(gòu)域，二級結(jié)構(gòu)大致相同，預測的三級結(jié)構(gòu)中基本結(jié)構(gòu)類似，在PH結(jié)構(gòu)域中有較大的差異，二者可能在囊泡的錨定和剪切、脂類物質(zhì)的傳導方面功能有所不同[17,24]。這兩個基因在褐飛虱不同發(fā)育時期的表達模式分析表明，在褐飛虱各發(fā)育時期表達相對穩(wěn)定，而在褐飛虱成蟲期起著更為重要的作用。這些結(jié)果說明，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2可能在褐飛虱中發(fā)揮不同的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，和在褐飛虱成蟲卵巢中大量表達，而免疫熒光定量結(jié)果顯示，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2與卵巢中的脂類物質(zhì)定位一致，這說明，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飛虱卵巢的發(fā)育和成熟中可能起著重要作用。有研究指出，dynamin在果蠅卵巢上皮細胞管腺增生過程中是必需的，參與管道關閉、細胞嵌入、頂端擴張等過程[22]，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2是否通過上述過程調(diào)控卵巢吸收脂類物質(zhì)需進一步研究。前人研究顯示，動力樣蛋白(dynamin-like protein)和動力相關蛋白(dynamin related protein)大部分定位在胞質(zhì)、線粒體、高爾基體等亞細胞結(jié)構(gòu)中[25,26]，本研究結(jié)果與之一致。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2也與正在入侵褐飛虱卵巢的類酵母共生菌(YLS)共定位。有研究表明，褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌進入卵母細胞的過程受ACTIN調(diào)控，ACTIN參與了類酵母共生菌進入卵母細胞的大部分過程[27,28]，那么同樣作為細胞骨架蛋白的Dynamin，也可能參與褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的入卵過程。

抗體是研究蛋白質(zhì)功能的重要工具，為深入研究NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飛虱中的功能，本研究制備了NlDNM1L-1和NlDNM1L-2多克隆抗體。在制備過程中，目的蛋白主要以包涵體的形式存在于大腸桿菌細胞裂解液的沉淀中，并沒有大量出現(xiàn)在上清液中，這種現(xiàn)象有很多原因，比如誘導時間、pH、蛋白的折疊機制等[29]，我們改變條件發(fā)現(xiàn)目的蛋白仍存在于包涵體中，所以先使用尿素溶解包涵體再純化蛋白。我們發(fā)現(xiàn)與使用LB培養(yǎng)基加入IPTG誘導相比，使用新型的HB-PET自誘導培養(yǎng)基得到相對更多蛋白。本研究中，目的蛋白與6×His融合表達，相對于GST融合表達來說，在純化條件選擇時，無需顧及蛋白質(zhì)變性與否，對于包涵體中蛋白的純化較為容易。通過調(diào)整洗脫Ni柱的咪唑濃度，本研究成功獲得了純度較高的融合蛋白，為成功獲得多克隆抗體奠定了基礎。

綜上所述，本研究成功克隆了褐飛虱的兩個基因，并進行生物信息學分析，通過利用成功制備得到的多克隆抗體，我們研究了褐飛虱NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飛虱卵巢的表達和定位，為今后深入研究這兩個蛋白在褐飛虱卵巢發(fā)育和生殖中的功能奠定了分子基礎。

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Gene Cloning, Polyclonal Antibody Preparation and Expression Localization of TwoGenes from(Hemiptera: Delphacidae)

ZHAO Chenxing, YU Yewei, XU Yipeng, YU Xiaoping*

(Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine, College of Life Sciences, China Jiliang University, Hangzhou 310018, China;*Corresponding author, E-mail: yxp@cjlu.edu.cn)

【Objective】To study the biological function of twogenes,andin,【Method】twogenes were cloned fromby polymerase chain reaction (PCR), and their bioinformatics analysis was conducted.Using fluorescence quantitative real-time PCR technology, the relative expression levels ofandin different tissues and at different developmental stages ofwere detected.The expression vectors of the two genes were constructed and recombinant proteins were expressed inRosetta. The expressed recombinant proteins were purified by Ni-NTA agarose gel affinity system and then injected into New Zealand white rabbit to generate polyclonal antibodies. The titer of the antibodies was monitored by ELISA, and the immune specificity was determined by Western blotting hybridization. Using above antibodies, the localization of target proteins in ovary was detected by immunofluorescence. 【Result】The twogenes were cloned, and their GenBank accession numbers were KY082900 and KY082901, respectively. The phylogenetic tree showed that NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 were conserved in Hemipterans. The results of protein structure prediction and space-time expression pattern analysis indicated that NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 might play different roles in. The ELISA and Western blotting results showed that the polyclonal antibodies had high titer and good specificity. Immunofluorescence showed that NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 were widely distributed in the follicle cells ofovary, indicating that they may be related to the development and maturity ofovary. NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 may also be associated with the invasion of the yeast-likesymbiontstoovary. 【Conclusion】The DNA sequences, bioinformatics and expression pattern ofandwere clarified. Andthepolyclonal antibodiesof NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 were obtained and their localizations in the ovary have preliminarily been understood. These results lay a foundation for further biological function investigation of NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 in

;; gene cloning; expression pattern; prokaryotic expression; polyclonal antibody; localization

10.16819/j.1001-7216.2017.6165

Q755; S435.112+.3

A

1001-7216（2017）04-0345-10

2016-12-12;

國家自然科學基金資助項目(31501632)；浙江省自然科學基金資助項目(LQ14C140006)；國家973計劃資助項目(2012CB114105)。

修改稿收到日期：2017-03-22。