周 辰, 高 珊,2, 魏 軍, 畢 群

(1. 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 北京 100871；2. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 山東 濟(jì)南 250062)

生理實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開(kāi)展大鼠腦片制備及觀察實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐

周 辰1, 高 珊1,2, 魏 軍1, 畢 群1

(1. 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 北京 100871；2. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 山東 濟(jì)南 250062)

急性腦片是神經(jīng)生物學(xué)研究中的重要材料,開(kāi)展急性腦片制備的實(shí)驗(yàn),有助于接觸科學(xué)前沿、增加學(xué)習(xí)興趣、提高教學(xué)質(zhì)量。北京大學(xué)生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課程組從2013年開(kāi)始,嘗試在選做實(shí)驗(yàn)部分開(kāi)展大鼠急性腦片制備與觀察的內(nèi)容,至今已有112人完成了實(shí)驗(yàn),取得了比較好的反饋。積累的教學(xué)經(jīng)驗(yàn)為進(jìn)一步開(kāi)展與腦片相關(guān)的擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)提供了較好的基礎(chǔ),并且也為教學(xué)改革提供了思路和方向。

生理實(shí)驗(yàn)； 急性腦片； 振動(dòng)切片

生理學(xué)實(shí)驗(yàn)是重要的基礎(chǔ)課程之一,北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的教學(xué)計(jì)劃中,生理學(xué)實(shí)驗(yàn)屬于主干基礎(chǔ)課,并與生理學(xué)理論課綁定,因此是必修課程。生理學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要特點(diǎn)是經(jīng)典實(shí)驗(yàn)比較多,主要的教學(xué)意義在于對(duì)理論課教學(xué)的輔助作用,同時(shí)鍛煉學(xué)生的動(dòng)手能力、合作能力、邏輯思維能力以及報(bào)告寫(xiě)作能力等。然而經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在當(dāng)前的科學(xué)研究中缺少實(shí)際應(yīng)用,并且實(shí)驗(yàn)方法單一,不容易調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性,不利于課程教學(xué)目的的實(shí)現(xiàn)。當(dāng)前科學(xué)研究,特別是神經(jīng)生物學(xué)研究中經(jīng)常進(jìn)行一些與生理學(xué)相關(guān)性較高的功能性實(shí)驗(yàn)。開(kāi)展類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)教學(xué),能夠提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣,并且對(duì)科學(xué)前沿有一定的認(rèn)識(shí),獲得更好的教學(xué)效果。但這些實(shí)驗(yàn),如雙光子在體成像通常需要使用大型儀器,不具備本科生教學(xué)的條件。此外有些實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜,例如膜片鉗記錄等,需要較長(zhǎng)時(shí)間的練習(xí),難以在一兩次課程中掌握。這些都限制了在生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課上開(kāi)展科研中常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)的內(nèi)容。

離體腦片是神經(jīng)生物學(xué)中常用的材料,特別是在電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)中,離體腦片可以保持內(nèi)部突觸聯(lián)系和神經(jīng)回路,是非常重要的研究樣本。在儀器方面,主要設(shè)備是振動(dòng)切片機(jī),國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品價(jià)格相對(duì)較低。制備完成后的觀察需使用正置顯微鏡及紅外CCD,由于通過(guò)電腦屏幕顯示圖像,因此可以允許較多的學(xué)生進(jìn)行觀察。在操作方面,腦片制備步驟明確,難度適中,對(duì)初學(xué)者要求有細(xì)心、耐心和較好的合作,既可以鍛煉培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃性、細(xì)致性、合作意識(shí)及實(shí)際動(dòng)手能力,在實(shí)驗(yàn)結(jié)果上又有很大可能在腦片中觀察到存活的神經(jīng)元,收到有效的教學(xué)結(jié)果,對(duì)學(xué)生產(chǎn)生正向激勵(lì)作用。因此，離體腦片制備及觀察實(shí)驗(yàn)在本科生教學(xué)中開(kāi)展,提供了一個(gè)能夠了解科研常用方法的內(nèi)容。

1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

使用出生后14天的SD大鼠乳鼠進(jìn)行腦片制備。解剖液配方：NaCl,64 mM；NaHCO3,25 mM；CaCl2,0.5 mM；MgSO4,3.3 mM；KCl,2.5 mM；Na2HPO4,1.25 mM；葡萄糖,10 mM；蔗糖,120 mM。人工腦脊液(aCSF)配方：NaCl,125 mM；NaHCO3,25 mM；CaCl2,2 mM；MgSO4,1 mM；KCl,3 mM；Na2HPO4,1.25 mM；葡萄糖,10 mM。麻醉劑：烏來(lái)糖(氨基甲酸乙酯),20%(質(zhì)量體積百分比)。

2 實(shí)驗(yàn)儀器

振動(dòng)切片機(jī)KD-400型(浙江金華科爾諾電子科技有限公司)；正置顯微鏡BX51WI(奧林巴斯(中國(guó))有限公司)；紅外CCD IR-1000(美國(guó)DAGE-MTI公司)；正置顯微鏡X-Y移動(dòng)平臺(tái)BX-51-XY(上海思巖實(shí)業(yè)有限公司)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

由于腦片制備所需的溶液需提前配制,并用氧氣飽和1 h以上,因此由教師在課前準(zhǔn)備。按照200 mL/人的數(shù)量配制解剖液,按照100 mL/人的數(shù)量配制aCSF,提前將部分解剖液凍成冰塊。切片所需刀片為雙面剃須刀片,分為2部分后用100%乙醇浸泡去除油脂。上課前1 h將解剖液放入4 ℃的水浴或冰中預(yù)冷,aCSF放置在室溫下,2種溶液均通入95%氧氣和/5%二氧化碳混合氣進(jìn)行飽和。

3.2 取腦

在手術(shù)前準(zhǔn)備2個(gè)10 cm直徑的塑料皿,分別倒入預(yù)冷的充氧解剖液,并放入解剖液制成冰塊維持溫度。從乙醇中取出刀片固定在刀片架上,刀片與水平面成15～20°角。振動(dòng)切片機(jī)腦片槽中加入預(yù)冷的

充氧解剖液,放入解剖液制成的冰塊并通入氧氣/二氧化碳混合氣。取出生后14 d的SD大鼠乳鼠,腹腔注射0.5 mL麻醉劑,以能夠快速麻醉為準(zhǔn)。小心剪去頭皮,暴露顱骨,用剪刀快速剪下頭部,放入塑料皿中的預(yù)冷解剖液內(nèi),沿矢狀縫剪開(kāi)并剝離頭骨,使用不銹鋼勺挖出完整大腦,放入另一個(gè)塑料皿的預(yù)冷解剖液中。

3.3 切片

取出的大腦背側(cè)向上放置,用刀片垂直切去小腦和前腦,并放在刀片上離開(kāi)液體,用濾紙小心吸干周?chē)?在切片臺(tái)上滴加502膠水,前腦切斷面向下固定在切片臺(tái)上?？焖俅蹈赡z水,粘牢后將切片臺(tái)固定在切片槽中,保證大腦浸入預(yù)冷的充氧解剖液。

啟動(dòng)振動(dòng)切片機(jī),以較低的前進(jìn)速度和較高的振動(dòng)速度進(jìn)行切片,厚度300～400 μm。每個(gè)切片完成后可用毛筆將其與全腦分離,并用粗口塑料吸管吸出切下的腦片放入充氧的室溫aCSF中孵育1 h以上。

3.4 觀察

腦片孵育完成后,用吸管轉(zhuǎn)移到灌流槽中,放置在正置顯微鏡下觀察,通過(guò)紅外CCD成像,顯示腦內(nèi)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元形態(tài)。

4 結(jié)果

在教師示范后,學(xué)生自行完成大鼠腦片制備,在高倍鏡下可以觀察到腦內(nèi)神經(jīng)元。由于紅外成像的分辨率較差,因此神經(jīng)元與周?chē)尘暗膮^(qū)分比較模糊。在海馬區(qū)可見(jiàn)密集排列的錐體細(xì)胞(見(jiàn)圖1),其他區(qū)域也可觀察到神經(jīng)元數(shù)量較多的區(qū)域(見(jiàn)圖2),在這些區(qū)域中能夠觀察到的神經(jīng)元多為類(lèi)似三角形的不規(guī)則形狀。同樣也能夠看到已經(jīng)死亡的神經(jīng)細(xì)胞(見(jiàn)圖3),其表現(xiàn)為膨脹變圓,在活性較差的腦片中此類(lèi)細(xì)胞數(shù)量較多。

圖1 海馬細(xì)胞層

圖2 皮層區(qū)域的神經(jīng)元

圖3 皮層區(qū)域的死細(xì)胞

除神經(jīng)細(xì)胞外,腦中的膠質(zhì)細(xì)胞,例如星形膠質(zhì)細(xì)胞等不能清楚地看到。但在某些位置可以看到細(xì)長(zhǎng)的管狀結(jié)構(gòu),其中還有兩面凹的圓餅狀細(xì)胞,提示該結(jié)構(gòu)可能是腦內(nèi)的微血管(見(jiàn)圖4)。

圖4 疑似的微血管結(jié)構(gòu)

5 教學(xué)經(jīng)驗(yàn)

腦片實(shí)驗(yàn)所需準(zhǔn)備的物品較多而零散,充氧需要提前至少1 h進(jìn)行,制作解剖液冰塊需要提前1 d。由于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的學(xué)生較多,因此切片機(jī)、孵育腦片的容器數(shù)量也較多,每組切片浴槽液、孵育液等要分別充氧飽和。這些都要求教師在課前進(jìn)行細(xì)致的準(zhǔn)備,擺放條理整齊,才能保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

由于神經(jīng)元對(duì)于缺氧缺血非常敏感,取腦后到將切下的腦片放入孵育液的時(shí)間間隔越短越好,因此腦片實(shí)驗(yàn)需要操作者對(duì)整個(gè)流程有全局的掌握和充分的準(zhǔn)備,同時(shí)對(duì)熟練度有較高要求。教師在課前發(fā)放講義,在示教過(guò)程中介紹詳細(xì)的操作步驟和注意事項(xiàng),指出腦組織操作的時(shí)間特殊性,強(qiáng)調(diào)要對(duì)全程操作的步驟心中有數(shù)方可實(shí)施,同組實(shí)驗(yàn)者要做好配合,切忌匆忙上手,做一步考慮一步。

學(xué)生在實(shí)驗(yàn)課上是初次操作,很難做到快速、準(zhǔn)確地完成,因此學(xué)生制備的腦片活性可能并不理想。對(duì)此應(yīng)向?qū)W生明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹饕橇私庵苽溥^(guò)程并實(shí)際動(dòng)手嘗試,避免學(xué)生由于無(wú)法在課上制備活性較好的腦片而產(chǎn)生挫敗感。此外,腦片制備的難度適中,在實(shí)際教學(xué)中,絕大多數(shù)學(xué)生的腦片中都能夠找到存活的神經(jīng)元,可以進(jìn)行后續(xù)的觀察,獲得所需的結(jié)果。

學(xué)生操作過(guò)程中除了不熟練導(dǎo)致速度較慢以外,最大的失敗因素是切片時(shí)腦固定不牢,切片厚度不穩(wěn)定,甚至造成腦切塊與腦片臺(tái)脫離,而無(wú)法進(jìn)行切片。國(guó)產(chǎn)切片機(jī)KD-400型配備的腦片臺(tái)為不銹鋼材質(zhì),與腦切塊的黏合性很差,因此在實(shí)際使用中另行設(shè)計(jì)制作了塑料材質(zhì)的腦片臺(tái),固定和切片成功率得到了提高。但塑料材質(zhì)的問(wèn)題是如不及時(shí)清理殘余的502膠水,后期將很難刮除,最終造成腦片臺(tái)無(wú)法使用。為此,目前教學(xué)條件下實(shí)驗(yàn)前要求學(xué)生切片結(jié)束及時(shí)清理,避免長(zhǎng)期積存無(wú)法清理,影響使用。后續(xù)將參考其他切片機(jī)尋找更合適的材料制作腦片臺(tái)。

6 后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

腦片制備是神經(jīng)生物學(xué)的基本技術(shù),在此基礎(chǔ)上可以開(kāi)展多種實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)處理可以在切片前對(duì)活體動(dòng)物操作,或者在切片后對(duì)離體腦片施加。例如對(duì)動(dòng)物進(jìn)行缺血處理后,制備腦片觀察其中神經(jīng)元的死亡情況[1]；也可以在動(dòng)物發(fā)生驚厥[2]或經(jīng)低氧預(yù)處理[3]后研究其電生理學(xué)等性質(zhì)的變化。利用離體腦片可以建立多種損傷模型,例如氧糖剝奪模擬的缺血模型[4]。建立這類(lèi)模型后進(jìn)一步研究神經(jīng)元電生理學(xué)特性[5]或者蛋白質(zhì)修飾[6]等方面的現(xiàn)象。腦片也可以進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng),從而研究各種藥物和處理的慢性作[7-8]。

腦片的主要用途是進(jìn)行電生理學(xué)記錄及光學(xué)成像等。厚度在300～400 μm范圍內(nèi)的腦片是進(jìn)行電生理學(xué)記錄的重要材料[9],特別是在突觸可塑性的研究中[10],能夠充分發(fā)揮腦片保持了完整神經(jīng)聯(lián)系的優(yōu)點(diǎn),這在一些藥理學(xué)研究中也有著重要的應(yīng)用[11]。振動(dòng)切片機(jī)也可以制備較薄的腦片,厚度在100 μm左右,這種厚度的腦片可以進(jìn)行尼式染色等標(biāo)記進(jìn)行光學(xué)觀察,用于神經(jīng)元存活及形態(tài)等方面的研究。使用熒光染料及熒光顯微鏡等設(shè)備,根據(jù)染料的不同,可以觀察并記錄腦片內(nèi)的神經(jīng)元、樹(shù)突脊等形態(tài)和鈣信號(hào)等現(xiàn)象[12-13]。

雖然在腦片上可以完成的科學(xué)實(shí)驗(yàn)種類(lèi)很多,但是通常都需要大型設(shè)備,例如膜片鉗系統(tǒng)、熒光顯微鏡或雙光子顯微鏡等。另外膜片鉗記錄等實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜,比較難以在本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開(kāi)展?？梢钥紤]在腦片制備實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步選修一些高級(jí)實(shí)驗(yàn),例如電生理學(xué)記錄或熒光成像觀察等,豐富教學(xué)體系。

7 結(jié)語(yǔ)

基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)工作除了通過(guò)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)提高學(xué)生對(duì)理論知識(shí)的理解,還需要與時(shí)俱進(jìn),跟上科學(xué)前沿的發(fā)展。在科研工作飛速發(fā)展的背景下,生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與科研方法的距離越來(lái)越遠(yuǎn),對(duì)于教學(xué)工作也造成了很大的困擾。為了提高教學(xué)質(zhì)量和學(xué)習(xí)興趣,必須不斷改革實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,這樣才能在本科教育中繼續(xù)發(fā)揮作用。離體腦片制備及觀察實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展,是一個(gè)有益的嘗試,并且也取得了較好的反饋,因此將繼續(xù)進(jìn)行探索,增加參加實(shí)驗(yàn)的人數(shù)并擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

致謝:感謝柴真教授在講授生理學(xué)理論課的同時(shí)指導(dǎo)我們開(kāi)展教學(xué)和實(shí)驗(yàn)改革,對(duì)生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課的建設(shè)和發(fā)展提供了重要的支持。

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Practice on preparation of rat brain slices and its observation experiment in physiological experimental teaching

Zhou Chen1, Gao Shan1,2, Wei Jun1, Bi Qun1

(1. National Experimental Teaching Demonstration Center for Biology,School of Life Science,Peking University, Beijing 100871,China; 2. Institute of Basic Medicine,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062,China)

Acute brain slices are important materials in the neuroscience studies. The experiment of the preparation of the acute brain slices is helpful to contact the scientific frontier,increase the interest in learning and improve the teaching quality. From 2013,the Physiological Experiment course group at Peking University tried to select the experimental part to carry out the preparation and observation of rat brain slices. So far,112 students have completed the experiment,and the good feedback is achieved. The accumulated teaching experience provides a good basis for the further development of brain slice related experiments,and also provides the idea and direction for the teaching reform.

physiological experiment; acute brain slice; vibration slicing

10.16791/j.cnki.sjg.2017.07.045

2017-01-10

國(guó)家自然科學(xué)基金基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金項(xiàng)目(J1310033)

周辰(1975—),男,江蘇無(wú)錫,博士,工程師,研究方向?yàn)樯窠?jīng)生物學(xué)和電生理學(xué).

E-mail：zezhou@sina.com

G642.0; Q4-33

A

1002-4956(2017)07-0174-04