李 璇，單 杰，馮志彪*，劉春紅，李冬梅（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

酶法水解乳清分離蛋白制備納米纖維

李 璇，單 杰，馮志彪*，劉春紅，李冬梅
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

采用天冬氨酸內(nèi)切酶（Asp endoproteinase，AspN）在37 ℃誘導(dǎo)乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）制備蛋白質(zhì)納米纖維（protein nanofibrils，PNFs），考察WPI不同水解時(shí)間對(duì)產(chǎn)物PNFs形貌的影響。利用透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡、小分子蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、硫磺素T熒光、紅外光譜以及激光散射法對(duì)PNFs及形成過程進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，該方法制備的產(chǎn)物PNFs呈乳白色，AspN水解得到的5 kD左右的多肽為構(gòu)筑單元，β-折疊為PNFs穩(wěn)定存在的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，PNFs平均粒徑隨水解時(shí)間延長(zhǎng)而增大。酶法制備PNFs解決了酸法中的褐變問題，有望拓展其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

乳清分離蛋白；天冬氨酸內(nèi)切酶；蛋白質(zhì)納米纖維；多肽

蛋白質(zhì)在一定條件下可自發(fā)或觸發(fā)地自組裝成具有特定形狀的有序性結(jié)構(gòu)，例如，研究發(fā)現(xiàn)人類淀粉樣纖維疾病與其體內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)[1-3]。不僅少數(shù)的病原性蛋白能夠構(gòu)建蛋白質(zhì)納米纖維（protein nanofibrills，PNFs），食源性蛋白在特定條件下亦可自組裝成納米纖維[4-8]。在食品科學(xué)領(lǐng)域，因PNFs具有良好的流變性，主要用作增稠劑[9]和凝膠填充物[10]，降低凝膠成本[11]；另一方面，PNFs可以作為保鮮的涂膜劑[12]，還能夠有效穩(wěn)定油水/汽水界面[13]。

構(gòu)建PNFs主要分為酸解高溫誘導(dǎo)和酶解誘導(dǎo)兩種方法。酸解高溫誘導(dǎo)是食源性蛋白構(gòu)建纖維的主要方法[14-16]，其中乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）能夠在pH 2.0、353 K條件下自組裝形成纖維狀聚集[17]。通過蛋白質(zhì)自組裝制備的納米纖維可作為增稠劑和膠凝劑用于食品工業(yè)，但酸解高溫誘導(dǎo)得到的乳清分離蛋白納米纖維呈現(xiàn)褐色凝膠狀，極大地限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。針對(duì)以上問題，研究者嘗試采用酶解誘導(dǎo)構(gòu)建蛋白質(zhì)納米纖維來減輕褐變。早在1973年，Linke等[18]報(bào)道Bence Jones蛋白胃酶水解后在體外可以構(gòu)建出類似于人類淀粉樣纖維的結(jié)構(gòu)，并指出不同酶處理得到的淀粉樣結(jié)構(gòu)在形態(tài)上有所差異。Gao Yuzhe等[19]利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶A以及蛋白酶M熱處理改性乳清濃縮蛋白后發(fā)現(xiàn)了不同程度聚集的纖維體。Akkermans等[20]研究天冬氨酸蛋白酶酶解β-乳球蛋白后溫育誘導(dǎo)可以得到長(zhǎng)的纖維狀聚集物。但β-乳球蛋白的價(jià)格昂貴，缺乏實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

天冬氨酸內(nèi)切酶（Asp endoproteinase，AspN）是一種能夠限制性切割天冬氨酸殘基和谷氨酸殘基N端肽鍵的鋅金屬內(nèi)切酶[21]。本研究以工業(yè)生產(chǎn)干酪以及干酪素的廉價(jià)副產(chǎn)品WPI為原料，采用AspN水解并在接近于常溫條件誘導(dǎo)制備PNFs。以透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察不同水解時(shí)間終產(chǎn)物PNFs的形貌，對(duì)WPI水解液和WPI-PNFs用原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）分析納米纖維的表面微現(xiàn)結(jié)構(gòu)及剖面，利用小分子蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（tricine-sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）對(duì)水解物進(jìn)行分子質(zhì)量分析，以硫磺素T熒光和紅外光譜對(duì)PNFs形成過程二級(jí)結(jié)構(gòu)β-折疊進(jìn)行定量考察，激光納米粒徑技術(shù)對(duì)PNFs粒徑分布進(jìn)行表征。酶法誘導(dǎo)構(gòu)建的PNFs呈現(xiàn)乳白色，相比于酸解高溫誘導(dǎo)的PNFs，條件溫和易于制備，而且解決了褐變問題，有望拓展在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.5%） 美國Hilmar公司；AspN（EC. 3.4.24.76） 美國NEB公司；超低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 美國Thermo Scientific公司；溴化鉀（光譜純）、硫磺素T 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力加熱攪拌器 杭州儀表電機(jī)廠；Z36HK冷凍離心機(jī) 德國Hermle公司；SHB-36型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司；FE-20型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋天津歐諾儀器儀表有限公司；H-7650型TEM 日本日立公司；ICON3100型掃描探針顯微鏡 德國Bruker公司；凝膠成像分析系統(tǒng) 上海山富科學(xué)儀器有限公司；FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津株式會(huì)社；PE LS-55熒光分光光度計(jì) 美國PE公司；90Plus/BI-MAS激光納米粒徑分析儀 美國Brookhaven公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI納米纖維的制備

將WPI溶解于50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.0，含2 mmol/L醋酸鋅）中配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蛋白溶液。室溫條件下磁力攪拌30 min使蛋白質(zhì)充分溶解。9 000 r/min、4 ℃離心15 min后上層清液用尺寸Ф100 mm，孔徑0.45 μm的混合纖維素酯微孔濾膜真空抽濾去除不溶性蛋白。AspN按0.83 U/mg蛋白質(zhì)加入到上述蛋白溶液中，于37 ℃進(jìn)行反應(yīng)一定時(shí)間后，加入體積分?jǐn)?shù)18%鹽酸調(diào)節(jié)至pH 2.0終止酶解反應(yīng)。

酶解反應(yīng)后的WPI水解液在30 ℃條件下繼續(xù)攪拌24 h后，取出置于4 ℃冰箱中冷藏備用，以不加酶的WPI溶液作為空白對(duì)照。

1.3.2 TEM觀察

通過TEM觀察WPI納米纖維的微觀形貌，采用Bolder等[22]的方法并加以改進(jìn)。取待測(cè)樣品100 μL，加入2 mL pH 2.0的鹽酸溶液，混勻后經(jīng)100 kD的超濾離心管（離心管先用pH 2.0的鹽酸溶液沖洗）3 000 r/min離心15 min，去除濾液后再將2 mL pH 2.0鹽酸溶液加入到截留物中，再次3 000 r/min離心15 min，截留物用2 mL pH 2.0的鹽酸溶液注滿，重復(fù)3 次，最后將1 mL pH 2.0的鹽酸溶液加入到截留物中，翻轉(zhuǎn)倒置，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的塑料管中，樣品最終稀釋倍數(shù)接近于10 倍。取適量的樣品滴加到專用銅網(wǎng)的碳膜上，靜置吸附15 min，用濾紙于邊緣緩慢移走多余液體之后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%醋酸鈾進(jìn)行負(fù)染色約8 min，于TEM進(jìn)行纖維形貌的觀察，并捕捉拍照得到WPI納米纖維的形貌圖。

1.3.3 AFM掃描

AFM掃描通過ICON3100型掃描探針顯微鏡進(jìn)行。本工作中AFM的測(cè)量條件如下：采用輕敲模式（Tapping Mode）成像，將新鮮干凈的載玻片浸入到樣品中，取出后于常溫條件進(jìn)行干燥。將樣品的載玻片用雙面膠小心地粘貼到金屬片，放置于顯微鏡載物臺(tái)上，掃描探針為商用氮化硅針尖，力的常數(shù)為3.2 N/m，微懸臂常數(shù)為180 μm，觀察蛋白質(zhì)的微觀形態(tài)特征。

1.3.4 硫磺素T熒光定量分析

將7.9 mg硫磺素T溶于8 mL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0，含150 mmol/L NaCl）制得硫磺素T儲(chǔ)備液。完全溶解后，過濾除去不溶性的雜質(zhì)，儲(chǔ)備液在4 ℃的冰箱中避光保存。硫磺素T儲(chǔ)備液稀釋50 倍得到工作液，取48 μL樣品加入4 mL工作液，混合均勻反應(yīng)約1 min后進(jìn)行熒光分析[23]。檢測(cè)條件：激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為460 nm，掃發(fā)射光譜，掃描范圍為470～600 nm，激發(fā)光狹縫10 nm，發(fā)射光狹縫10 nm，掃描速率200 nm/min。每個(gè)樣品熒光值重復(fù)測(cè)定3 次，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程注意避光。

1.3.5 紅外光譜分析

真空冷凍干燥WPI納米纖維樣品與干燥KBr按1∶200充分研磨混勻，用溴化鉀壓片模具壓片后掃描中紅外圖譜，樣品室N2吹掃，檢測(cè)器DTGS。參數(shù)設(shè)置：掃描次數(shù)64，分辨率4 cm－1，掃描范圍4 000～400 cm－1。圖譜分析處理采用Liu Chunhong等[24]的方法。

1.3.6 Tricine-SDS-PAGE分析

參照Sch?gger等[25]的方法，略有改動(dòng)。分離膠（質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.5%）、間隙膠（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%）、濃縮膠（質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%）按體積比為4.0∶1.0∶1.5進(jìn)行。配制10 mg/mL水解物樣品，取100 μL溶液于1.0 mL離心管中與Tricine-SDS-PAGE緩沖溶液1∶1混合均勻，點(diǎn)樣前將樣品在沸水浴中煮沸5 min，使蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合變性[26]，點(diǎn)樣量為10 μL。凝膠電泳于恒壓模式下進(jìn)行，濃縮膠和間隙膠為60 V恒壓，到達(dá)分離膠后，電壓調(diào)至120 V。電泳結(jié)束后，將膠片放入乙醇和戊二醛水溶液（體積分?jǐn)?shù)30%乙醇、0.5%戊二醛）中固定30 min，取出放入染色液中（含0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250、50%甲醇、10%乙酸）染色1 h后用脫色液（甲醇-冰乙酸-水體積比2∶2∶9）脫色，更換脫色液直至條帶清晰、背景色完全褪去為止。采用凝膠成像系統(tǒng)中的LabWorks 4.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.3.7 水合半徑分析

將樣品稀釋至濃度為0.1%加入到比色皿中，PNFs水合半徑的變化采用90Plus/BI-MAS激光納米粒徑分析儀進(jìn)行測(cè)定。參數(shù)設(shè)置如下：顆粒折光率為1.347；分散劑：水；常溫25 ℃測(cè)量。每個(gè)樣品測(cè)量3 次，結(jié)果取平均值。1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

將所有數(shù)據(jù)用SAS 9.3統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性差異界值預(yù)設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法與酸法制備的PNFs對(duì)比

圖1 AspN法（a）與酸法（b）構(gòu)建的PNFs顏色對(duì)比Fig. 1 Comparison of whey isolateprotein nanofibrils prepared with AspN (a) or acid (b)

如圖1所示，酶法誘導(dǎo)WPI制備出的納米纖維呈現(xiàn)乳白色，明顯改善了酸法高溫誘導(dǎo)制備納米纖維中的褐變問題。

2.2 PNFs形貌分析

采用AspN對(duì)分離分離蛋白進(jìn)行不同時(shí)間的水解后，調(diào)節(jié)pH值至2.0培育24 h，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行TEM觀察，所得結(jié)果如圖2所示。

圖2 WPI溶液在不同水解時(shí)間條件下培養(yǎng)24 h后TEM圖Fig. 2 Morphology of whey protein isolate solution incubated for 24 h after different hydrolysis times

從圖2可以看出，在2～24 h電子顯微鏡圖中均能觀察到纖維的存在，且呈不均勻分布，長(zhǎng)短不一地共存于溶液中，WPI水解24 h后培養(yǎng)的纖維形貌最佳。隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)，WPI的水解度增大，顆粒性蛋白質(zhì)斑塊明顯減少，聚集體逐漸展開形成短小的纖維，進(jìn)而相互纏繞呈團(tuán)簇狀。這說明WPI經(jīng)AspN水解24 h后，得到的水解物經(jīng)過培育能夠形成高度有序的納米纖維結(jié)構(gòu)。

AFM圖片可以用來分析納米纖維的表面微現(xiàn)結(jié)構(gòu)，并且能給出三維成像。分別在輕敲模式下觀察WPI未水解溶液（0 h）和加酶水解24 h后的微觀結(jié)構(gòu)。

圖3 輕敲模式的掃描探針AFM圖Fig. 3 Scanning probe AFM images in the tapping mode

如圖3所示，0 h時(shí)蛋白還未進(jìn)行水解，以顆粒狀聚集在一起；24 h后經(jīng)過水解及培養(yǎng)過程，形成不均勻分布的細(xì)長(zhǎng)纖維，其中還可以看出一些未形成纖維的單體，纖維的長(zhǎng)度長(zhǎng)短不一。同樣證實(shí)了PNFs形成過程中水解的重要性，間接證明PNFs的構(gòu)筑單元為多肽。Oboroceanu等[27]利用AFM研究80 ℃體積下β-乳球蛋白加熱85 min后，形成的纖維伸直長(zhǎng)度大于10 μm。

圖4 剖面線圖Fig. 4 Profile chart

圖4 分別為WPI水解液和WPI-PNFs的剖面線圖。未水解溶液樣品顆粒具有不同大小，高度為3～8 nm左右；水解后PNFs高度可以達(dá)到9～15 nm，可能是由于WPI纖維的疊加引起纖維堆積。

2.3 水解物的分子質(zhì)量

通過Tricine-SDS-PAGE技術(shù)分析WPI及其水解物的分子質(zhì)量分布，結(jié)果見圖5?？梢钥闯觯琖PI的分子質(zhì)量主要在10～20 kD之間，其中在14～20 kD的條帶顏色最深且最寬，說明在此分子質(zhì)量范圍內(nèi)的蛋白含量最高，推測(cè)是β-乳球蛋白；其次14 kD左右的條帶顏色較深，推測(cè)是WPI中含量的α-乳白蛋白；其他條帶分子質(zhì)量高于30 kD的蛋白可能是牛血清白蛋白等蛋白質(zhì)。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，分子質(zhì)量14 kD以下出現(xiàn)新條帶，分子質(zhì)量為5 kD左右的多肽變多，且條帶的顏色逐漸變深。水解24 h時(shí)，大多數(shù)蛋白被水解后分子質(zhì)量降低，僅有少量蛋白未被水解。結(jié)合TEM圖證實(shí)，形成纖維聚集物的結(jié)構(gòu)單元是肽而不是蛋白分子[28]。

圖5 不同水解時(shí)間WPI水解物的分子質(zhì)量Fig. 5 Tricine-SDS-PAGE profiles of whey protein hydrolysates at different hydrolysis times

2.4 纖維生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析

硫磺素T是一種外源熒光染料，屬陽離子苯并噻唑，與淀粉樣纖維結(jié)合后可極大提高纖維物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，從而判斷纖維的聚集情況，因此經(jīng)常用來檢測(cè)淀粉樣纖維變化并以此判斷淀粉樣纖維的成熟情況[19]。利用AspN對(duì)WPI水解0、1、2、3、4、6、8、10 h及24 h，然后在30 ℃、pH 2.0條件下培育24 h，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行硫磺素T熒光分析。

圖6 水解不同時(shí)間硫磺素T熒光強(qiáng)度增加的纖維生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)Fig. 6 Kinetics of fibrils formation as observed by increase in ThT fluorescence intensity with hydrolysis time

從圖6可以看出，0～1 h之間熒光強(qiáng)度變化與1～4 h相比較小，推測(cè)可能是纖維形成的“遲滯期”；隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，在1～10 h之間熒光強(qiáng)度迅速增大，推測(cè)此階段為纖維的快速“生長(zhǎng)期”；水解10 h后，熒光強(qiáng)度增大的幅度趨于平穩(wěn)，新的纖維生成量減少，纖維的含量逐漸進(jìn)入“穩(wěn)定階段”。這表明纖維化聚集的過程在初始階段變化較快，這可能與蛋白質(zhì)分子的亞基解離和水解速度有關(guān)[29]。

2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化

對(duì)WPI pH 8.0條件下水解24 h的凍干樣以及對(duì)水解物在最佳條件下培育24 h的樣品進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，紅外光譜原始譜圖如圖7所示。

圖7 不同樣品傅里葉變換紅外光譜原始譜圖Fig. 7 Original FTIR spectra of different samples

對(duì)原始圖譜進(jìn)行求導(dǎo)、去卷積、曲線擬合如圖8所示，對(duì)各子峰進(jìn)行指認(rèn)和計(jì)算后，得到對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量見表1。

圖8 紅外光譜的酰胺類Ⅰ帶曲線擬合的比較Fig. 8 Comparison of infrared spectra of the amide Ⅰ band with curvr fitting

表1 不同樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 1 The contents of secondary structures in different samples %

由表1可以看出，在蛋白質(zhì)水解過程中β-折疊相對(duì)含量降低而β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量升高，原因可能是水解過程蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)展開，次級(jí)鍵破壞，肽鍵發(fā)生斷裂后，β-轉(zhuǎn)角更能夠穩(wěn)定存在于水解液中；多肽自組裝形成PNFs的過程中，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量明顯下降，而β-折疊相對(duì)含量顯著增加到53.67%，可能是由于呈堿性的水解液中，β-轉(zhuǎn)角的第1個(gè)氨基酸殘基的羰基與第4個(gè)氨基酸殘基的亞氨基之間氫鍵穩(wěn)定存在，而酸性環(huán)境使其180°回折處的氫鍵遭到破壞，在同一條肽鏈或者相鄰肽鏈的羰基與酰胺基之間形成氫鍵存在于β-折疊中，β-折疊的氫鍵能夠促進(jìn)肽鏈延展并聚集形成納米纖維[30]。Oboroceanu等[27]研究β-乳球蛋白熱誘導(dǎo)聚集時(shí)，也證實(shí)了在纖維化過程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋含量與β-折疊含量成反比關(guān)系。這間接說明β-折疊是構(gòu)成WPI納米纖維的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.6 粒徑分析

動(dòng)態(tài)光散射法是一種可以對(duì)蛋白質(zhì)聚集程度做定性分析的方法，是從整體角度表征溶液中蛋白質(zhì)粒徑及平均分布等信息。利用AspN水解WPI，測(cè)定不同水解時(shí)間（0、1、2、3、4、6、8、10、24 h）的纖維聚集物的水合半徑，結(jié)果見圖9。

圖9 不同水解時(shí)間形成PNFs的粒徑分布圖Fig. 9 Size distribution of PNFs obtained at different hydrolysis times

圖10 平均粒徑-水解時(shí)間的關(guān)系Fig. 10 Average hydrodynamic radius vs. hydrolysis time

圖10 為隨水解時(shí)間PNFs的水合半徑的分布圖。綜合圖9、10結(jié)果表明，PNFs的平均粒徑分布主要在80～2 500 nm之間，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，平均粒徑增加，水合半徑的分布范圍也逐漸變寬。這一結(jié)果與TEM圖比較接近，與Kroesnijboer等[31]的研究結(jié)果一致。平均粒徑的增加沒有經(jīng)歷類似“S”型滯后生長(zhǎng)的趨勢(shì)，推測(cè)原因可能是隨著酶水解時(shí)間的延長(zhǎng)，形成的多肽分子質(zhì)量逐漸降低，自組裝形成納米纖維需要小分子質(zhì)量的多肽相互纏繞交聯(lián)，而相對(duì)大分子質(zhì)量的多肽或者蛋白不是納米纖維的構(gòu)筑單元。

3 結(jié) 論

以WPI為原料，采用AspN水解后于酸性條件下培育能夠制備出PNFs。酶法制備的PNFs于TEM下呈現(xiàn)有序的團(tuán)簇狀。利用Tricine-SDS-PAGE、硫磺素T熒光、紅外光譜以及激光納米粒徑技術(shù)對(duì)PNFs形成過程進(jìn)行表征，結(jié)果顯示PNFs的構(gòu)筑單元為多肽，平均粒徑與水解時(shí)間成正比，且在形成過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)β-折疊相對(duì)含量增加。

本研究所選的原料蛋白為WPI，較β-Lg廉價(jià)易得，構(gòu)建PNFs的條件溫和易控制，得到的溶液呈現(xiàn)乳白色的渾濁狀，無褐變現(xiàn)象。因此，此法制備的PNFs可望作為功能性食品添加物用于食品工業(yè)，具有較好的應(yīng)用前景。

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Preparation of Nanofibrils by Enzymatic Hydrolysis of Whey Protein Isolate

LI Xuan, SHAN Jie, FENG Zhibiao*, LIU Chunhong, LI Dongmei
(College of Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In the present study, Asp endoproteinase (AspN) was used to induce whey protein isolate (WPI) for preparing protein nanofibrils (PNFs) at 37 ℃. Transmission electron microscopy (TEM), atomic force microscope (AFM), tricine-SDS-PAGE, thioflavin T fluorescence spectroscopy, infrared spectroscopy and laser scattering were used for the characterization of PNFs and its formation process. The results showed that the PNFs was milky white in color, and peptides with a molecular weight of 5 kD were the building blocks for PNFs. The major secondary structure in PNFs was β-fold, which played a role in its stability, and the average particle size of PNFs was positively proportional to hydrolysis time. The enzymatic preparation of PNFs, overcoming the problem of browning, is expected to expand its application in food industry.

whey protein isolate (WPI); Asp endoproteinase (AspN); protein nanofibrils (PNFs); peptides

10.7506/spkx1002-6630-201713020

Q518.4

A

1002-6630（2017）13-0118-07

李璇, 單杰, 馮志彪, 等. 酶法水解乳清分離蛋白制備納米纖維[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(13): 118-124. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201713020. http://www.spkx.net.cn

LI Xuan, SHAN Jie, FENG Zhibiao, et al. Preparation of nanofibrils by enzymatic hydrolysis of whey protein isolate[J]. Food Science, 2017, 38(13): 118-124. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201713020. http://www.spkx.net.cn

2016-05-24

黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目（12531007）；黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（QC2010029）

李璇（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用化學(xué)。E-mail：1539182217@qq.com

*通信作者：馮志彪（1967—），男，教授，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用化學(xué)。E-mail：fengzhibiao@neau.edu.cn