李文武，趙維維，張素歌，肖向勤，曾文淵，賈 欣#，姚寒春#

1)河南省食品藥品評價中心 鄭州 450018 2)鄭州大學藥學院藥物分析教研室 鄭州 450001

熒光碳量子點催化魯米諾發(fā)光體系測定2-甲氧基雌二醇*

李文武1)，趙維維2)，張素歌2)，肖向勤2)，曾文淵2)，賈 欣2)#，姚寒春2)#

1)河南省食品藥品評價中心 鄭州 450018 2)鄭州大學藥學院藥物分析教研室 鄭州 450001

#通信作者，賈欣，女，1975年8月生，碩士，講師，研究方向：藥物分析與藥物治療學，E-mail：jiaxin@zzu.edu.cn；姚寒春，女，1979年1月生，博士，副教授，研究方向：納米熒光探針在藥物分析中的應(yīng)用，E-mail：yhch@zzu.edu.cn

碳量子點；魯米諾；化學發(fā)光；2-甲氧基雌二醇

目的：基于熒光碳量子點(CQDs)的催化特性，建立CQDs -魯米諾化學發(fā)光新體系用于2-甲氧基雌二醇(2-ME)的含量測定。方法：利用微波熱解法合成熒光CQDs，采用透射電鏡及光譜技術(shù)對其進行表征。將CQDs應(yīng)用于魯米諾發(fā)光體系中，考察不同濃度試劑對發(fā)光強度的影響，在最優(yōu)條件下，對凍干粉劑及血漿樣品中的2-ME含量進行測定。結(jié)果：CQDs溶液可以增強魯米諾-鐵氰化鉀體系的發(fā)光信號，因2-ME對這一體系的發(fā)光有抑制作用，且該作用與2-ME的濃度呈正比關(guān)系，因此建立了檢出限為5.4×10-10g/mL，RSD為1.8%(n=11)的2-ME含量測定的新方法。結(jié)論：該方法靈敏度高、簡單快速，適用于藥物制劑及生物樣品中2-ME的含量測定。

碳量子點(carbon quantum dots，CQDs)是粒徑在10 nm左右的外形類似球形的碳納米材料，具有優(yōu)良的光學性能、良好的生物相容性、低毒性及制備成本低[1]等特殊優(yōu)勢，在化學發(fā)光領(lǐng)域被用作金屬量子點的理想替代品。鐵氰化鉀能直接氧化CQDs，產(chǎn)生較強的化學發(fā)光，一些金屬離子和生物分子對發(fā)光有抑制作用，據(jù)此建立了測定Cr(Ⅵ)和腎上腺素的化學發(fā)光分析法[2]。將CQDs作為催化劑應(yīng)用于魯米諾-過氧化氫發(fā)光體系，鈍化后的CQDs對該發(fā)光體系的催化過程是一個典型的1O2誘導發(fā)光機制[3]。有學者[4]發(fā)現(xiàn)CQDs在無外加氧化劑下也可以催化魯米諾化學發(fā)光，認為CQDs具有的電子供體、受體的性質(zhì)是其催化特性的來源，且通過改變CQDs的表面基團可以調(diào)控其催化性能。

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradio，2-ME)是內(nèi)源性雌激素17β-雌二醇非極性的代謝產(chǎn)物[5]。研究[6-10]表明：2-ME對多種腫瘤細胞的增殖有抑制作用，可以通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子(如缺氧誘導因子)來調(diào)節(jié)血管生成、抑制微管蛋白聚合而導致細胞死亡，并證實它對惡性肉瘤、乳腺癌、胃癌、肺癌、多發(fā)性骨髓瘤和前列腺癌等多種腫瘤有治療作用。HPLC[11-13]、GC[14]、放射免疫法[15]及化學發(fā)光法[16-17]均可用于測定2-ME。Zhang等[17]基于納米銀對魯米諾-鐵氰化鉀化學發(fā)光體系的催化特性，利用2-ME對體系的抑制作用進行含量測定。作者利用CQDs對魯米諾-鐵氰化鉀體系的催化特性，基于2-ME對該體系強烈的抑制作用，建立了一種2-ME含量測定的新方法，并分析了其發(fā)光機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 850W Glanz 微波爐(珠海格力電器股份有限公司)，Nano-ZS90 激光納米粒度分析儀(英國馬爾文公司)，IFFM-E型流動注射化學發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限公司)，DZF-6021型真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，UV-2550型紫外分光光度計(日本島津科學儀器公司)，RF-5301型熒光分光光度計(日本島津科學儀器公司)。檸檬酸(宜興協(xié)聯(lián)生物化學有限公司)，二甘醇(天津市風船化學試劑科技有限公司)，PEI2500(上海攻碧克新材料科技有限公司)，2-ME凍干粉劑(鄭州大學藥學院自制，純度≥99%)，魯米諾(北京索萊寶科技有限公司)，鐵氰化鉀(天津盛奧化學試劑有限公司)，濃硫酸(H2SO4，體積分數(shù)95.0%～98.0%)購于北京康普匯維科技有限公司。實驗用水為超純水，實驗試劑均為分析純。

1.2 實驗方法 按照圖1所示連接各流路，啟動儀器，首先用超純水將整個流路沖洗10 min至信號穩(wěn)定。再通過各自的流路將鐵氰化鉀溶液、魯米諾溶液、CQDs溶液及空白樣品(超純水)經(jīng)蠕動泵帶入分析系統(tǒng)，得到發(fā)光信號。待信號穩(wěn)定后，記錄發(fā)光強度I0。用2-ME樣品溶液替換超純水注入流路，得到發(fā)光強度Is。采用光電倍增管(工作電壓為900 V)對系統(tǒng)的發(fā)光信號進行收集與檢測。以相對化學發(fā)光強度ΔI(ΔI=I0-Is)與濃度的關(guān)系對2-ME進行定量分析。

a：魯米諾溶液；b：樣品溶液；c：鐵氰化鉀溶液；d：CQDs溶液；P：蠕動泵 (P1為主泵；P2為副泵)；V：進樣閥；F：流通池；W：廢液；D：檢測器；PC：計算機處理系統(tǒng)。圖1 流動注射化學發(fā)光分析流路圖

1.3 CQDs的制備及表征

1.3.1 CQDs的制備 CQDs采用微波熱解法制備[17]：將0.2 g PEI2500、1.0 g 檸檬酸和3 mL二甘醇置于100 mL燒杯中，混勻，然后將此混合物放入功率為850 W的微波爐中，在200 ℃下加熱3 min，反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黑色固-液混合物。將混合物加水并進行超聲溶解，離心15 min(4 000 r/min)，將上清液置于超純水中透析48 h(MWCO=3 500的透析膜)，以除去多余的PEI2500和二甘醇，即得淺棕色CQDs水溶液。

1.3.2 CQDs的表征 在紫外燈下(λ=365 mm)觀察CQDs水溶液的發(fā)光情況，在200～600 nm波長范圍內(nèi)對CQDs水溶液進行紫外全波長掃描。用RF-5310型熒光分光光度計對其進行熒光光譜的表征。在300～480 nm范圍內(nèi)分別用不同的激發(fā)波長激發(fā)CQDs水溶液，考察CQDs發(fā)射波長的變化。采用高分辨透射電鏡對其進行形態(tài)表征，采用激光納米粒度分析儀考察CQDs的粒徑分布。

1.4 實驗條件優(yōu)化 魯米諾的發(fā)光需要在堿性條件下進行。該實驗用NaOH調(diào)節(jié)魯米諾溶液的pH，考察了NaOH在0.03～0.40 mol/L范圍內(nèi)對相對化學發(fā)光強度的影響。此外，該實驗考察了魯米諾濃度在8.0×10-8～3.0×10-6mol/L范圍內(nèi)、鐵氰化鉀濃度在5.0×10-6～3.0×10-4mol/L范圍內(nèi)對相對化學發(fā)光強度的影響。在該體系中，CQDs對魯米諾-鐵氰化鉀體系具有很強的發(fā)光增敏作用。該實驗考察了CQDs用量對相對化學發(fā)光強度的影響。

1.5 方法學考察

1.5.1 分析特性 作者配制了一系列不同濃度的2-ME標準溶液，在選定的實驗條件下，采用發(fā)光分析儀對其濃度進行測定。以2-ME濃度C為橫坐標，相對發(fā)光強度ΔI為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程。按照IUPAC的計算規(guī)定(3σ)，根據(jù)數(shù)據(jù)計算檢出限。對1.0×10-7g/mL的2-ME進行11次平行測定，考察其精密度。該實驗還考察了金屬離子、藥用輔料及可能存在的干擾成分對2-ME標準溶液(1.0×10-7g/mL)測定的影響。

1.5.2 樣品制備 稱取適量不同批次的2-ME凍干粉末，先使用甲醇通過超聲溶解，再用0.22 μm的微孔濾膜過濾，取適量濾液定容于100 mL容量瓶中作為儲備液，于4 ℃保存。人血漿來自河南省紅十字血液中心。各取3份100 μL血漿，分別加入高、中、低3個不同濃度的2-ME標準溶液，然后加入600 μL甲醇以去除蛋白，渦旋3 min使其混合均勻，12 000 r/min離心15 min，收集上清液備用。另取一份不加2-ME的血漿按同樣方法處理作為空白對照溶液。

1.6 反應(yīng)機制探討 用紫外分光光度計和熒光分光光度計(關(guān)閉光源)對CQDs、2-ME、魯米諾-鐵氰化鉀、魯米諾-鐵氰化鉀-CQDs及魯米諾-鐵氰化鉀-CQDs-2-ME的紫外吸收光譜和發(fā)射光譜進行掃描。通過峰位置和強度的變化，結(jié)合文獻報道，判斷發(fā)光體，推測可能的反應(yīng)機制。

2 結(jié)果

2.1 CQDs的表征 CQDs水溶液在紫外燈照射下(λ=365 nm)呈現(xiàn)明亮的藍色熒光，紫外全波長掃描顯示CQDs在230及290 nm處各有一個特征吸收峰(圖2)。激發(fā)波長在300～480 nm范圍內(nèi)，隨著激發(fā)波長的增加，發(fā)射波長也逐漸增大，CQDs的發(fā)射峰強度在激發(fā)波長為340 nm時最大(λem=400 nm)(圖3)。高分辨透射電鏡表征見圖4，CQDs的外觀呈粒徑在4～7 nm的球形且大小分布均勻；單個CQDs表面具有間距在0.7 nm左右晶格條紋，CQDs的粒徑主要分布在6 nm左右。

右上圖為CQDs水溶液和紫外燈照射下的熒光圖2 CQDs的紫外掃描圖譜

圖3 不同激發(fā)波長下CQDs的發(fā)射光譜圖

圖4 CQDs高分辨透射電鏡圖(A,B)及粒徑分布(C)

2.2 實驗條件 如圖5A所示，當NaOH濃度增加至0.2 mol/L時ΔI達最大，因此實驗選擇的NaOH濃度為0.2 mol/L。根據(jù)圖5B所示，ΔI的變化與魯米諾濃度呈正相關(guān)，綜合考慮信噪比、峰穩(wěn)定性和試劑消耗，選用2.0×10-6mol/L的魯米諾溶液。隨著鐵氰化鉀濃度的增加ΔI逐漸增大，當鐵氰化鉀濃度為5.0×10-5mol/L時，ΔI達到最大(圖5C)，之后ΔI逐漸降低，所以鐵氰化鉀最佳濃度為5.0×10-5mol/L。如圖5D所示，當所用CQDs溶液稀釋6.0×104倍時，ΔI達到最大，而后ΔI逐漸降低，因此CQDs的最佳稀釋倍數(shù)為6.0×104倍。

圖5 NaOH、魯米諾、鐵氰化鉀和CQDs稀釋度對發(fā)光強度的影響

2.3 方法學考查結(jié)果 ΔI與C在(2.0×10-9～5.0×10-7) g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為ΔI=39.183C+51.397，r=0.999 1，檢出限為5.4×10-10g/mL。以2-ME標準溶液為例，11次平行測定的RSD為1.8%。相對誤差不大于5%的情況下，干擾實驗結(jié)果見表1，可以看出一些常見離子和藥物添加劑對2-ME的測定基本沒有影響。

表1 干擾實驗結(jié)果

2.4 樣品含量測定 依據(jù)上述實驗步驟對凍干粉劑儲備液中和人血漿中2-ME的含量進行測定，加標回收率測定結(jié)果見表2