程 康，馬珊珊#，程 田，邢 衢，黃團(tuán)結(jié)，石振慶，張 濤，劉雯雯，許 玲，關(guān)方霞#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

曲古霉素A預(yù)處理的hUC-MSCs移植對小鼠腦損傷的神經(jīng)修復(fù)作用*

程 康1)，馬珊珊1)#，程 田2)，邢 衢1)，黃團(tuán)結(jié)1)，石振慶1)，張 濤1)，劉雯雯1)，許 玲1)，關(guān)方霞1)#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

#通信作者：關(guān)方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)，E-mail：guangfangxia@126.com；馬珊珊，女，1984年5月生，博士，副教授，研究方向：干細(xì)胞與神經(jīng)功能修復(fù)，E-mail：mashanshan84@163.com

曲古霉素A；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；移植；腦損傷；神經(jīng)修復(fù)

目的：探討30 nmol/L曲古霉素A(TSA)預(yù)處理的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)移植對腦損傷(TBI)小鼠的神經(jīng)修復(fù)和促進(jìn)作用。方法：利用顱腦打擊器和立體定位儀制作中度腦損傷小鼠模型，并將造模成功的27只小鼠隨機(jī)分為Veh組、MSCs組和TSA+ MSCs組；術(shù)后3天，PI染色評估各組小鼠腦損傷周圍的細(xì)胞壞死情況，術(shù)后第1、2、3、7、14、21和28天，采用神經(jīng)功能缺損程度評分(NDS評分)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)評估小鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)感覺和抑郁情況；術(shù)后第28天采用qRT-PCR檢測組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)和神經(jīng)元特異性相關(guān)基因(DCX、MAP2)的表達(dá)。結(jié)果：與Veh組相比，MSCs組和TSA+MSCs組小鼠腦損傷周圍的壞死細(xì)胞數(shù)明顯減少，其中TSA+MSCs組降低更為明顯(P<0.001)。術(shù)后第1天，各組小鼠的NDS評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；從術(shù)后第3天開始，TSA+MSCs組小鼠NDS評分低于MSCs組和Veh組(P<0.001)；術(shù)后第28天，與其他兩組相比，TSA+MSCs組小鼠蔗糖偏嗜度增強(qiáng)、HDAC1表達(dá)量降低，MAP2、DCX的表達(dá)量增加(P<0.001)。結(jié)論：TSA預(yù)處理能夠有效促進(jìn)hUC-MSCs移植對TBI小鼠的神經(jīng)修復(fù)。

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是由外力作用于頭部造成的嚴(yán)重創(chuàng)傷[1]。目前在臨床上對TBI帶來的神經(jīng)功能的破壞缺乏有效的治療手段。課題組前期研究[2-3]表明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)移植和能產(chǎn)生MSCs的沃頓膠雖然對TBI有一定的治療效果，但干細(xì)胞定向分化效率低,致使干細(xì)胞移植對TBI的治療不足。乙酰化修飾是研究較為廣泛的一類表觀遺傳學(xué)干預(yù)手段，乙酰化水平主要由組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)和乙?；?histone acetyltransferase，HAT)共同調(diào)控[4]。 組蛋白的乙?；接绊懲挥|活性和神經(jīng)元的功能，多種神經(jīng)相關(guān)疾病的發(fā)生都伴隨HDAC水平的下降。 而使用 HDAC 抑制劑(HDACi)能夠上調(diào)HDAC的水平,明顯緩解疾病的癥狀。研究[5]發(fā)現(xiàn)HDACi在脊髓損傷模型中可以介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生。曲古霉素A(trichostatin A，TSA)是HDAC的抑制劑，研究[6]發(fā)現(xiàn)TSA下調(diào)HDAC的表達(dá)后，神經(jīng)元分化效率增加,并且在腦損傷后病灶區(qū)的乙酰化水平顯著降低[7]。但是，TSA預(yù)處理的hUC-MSCs移植對TBI小鼠的神經(jīng)修復(fù)作用尚未見報(bào)道，為此，作者進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料 hUC-MSCs為課題組前期凍存，DMEM/F12培養(yǎng)基購自寶信生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gemini公司，TSA、PI購自美國Sigma公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，NeuN抗體購自CST公司，熒光二抗CY3購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)采用清潔級(jí)的雄性C57BL/6野生型小鼠，體重20～22g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，在22 ℃恒溫、相對濕度為60%的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.3 TBI模型建立和側(cè)腦室移植 用體積分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛對小鼠進(jìn)行麻醉，采用自由落體腦皮質(zhì)損傷模型，在小鼠顱腦右側(cè)前囟后1.5 mm、中線旁側(cè)1.5 mm處，將直徑3 mm的環(huán)形鉆開一個(gè)骨窗，確保腦膜完好，利用立體定位儀，將直徑2.5 mm的20 g撞針正對骨窗，從20 cm高度處釋放撞針，撞擊后迅速提起撞針，使用牙科鉆在小鼠顱腦左側(cè)前囟后0.5 mm、旁開0.9 mm處開一個(gè)直徑為1.0 mm的小孔，深3.1 mm，將處理液通過立體定位儀進(jìn)行側(cè)腦室注射，損傷部位用骨蠟覆蓋，縫合。

1.4 hUC-MSCs的預(yù)處理及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 TSA 預(yù)處理hUC-MSCs：選取長勢良好的P3代hUC-MSCs ，待細(xì)胞密度達(dá)到50%，在含有體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中加入終濃度為30 nmol/L的TSA，培養(yǎng)48 h后，倒掉培養(yǎng)基，并用PBS清洗3次，胰酶消化收集細(xì)胞。采用隨機(jī)數(shù)字表法將27只造模成功的C57BL/6野生型小鼠分為生理鹽水組(Veh組)，hUC-MSCs移植組(MSCs組)、TSA預(yù)處理MSCs組(TSA+MSCs組)，每組9只，分別向3組小鼠側(cè)腦室注射等劑量的生理鹽水、5×104個(gè)MSCs和TSA預(yù)處理的5×104個(gè)hUC-MSCs。

1.5 各組小鼠大腦損傷部位細(xì)胞壞死情況檢測 采用PI染色。各組取3只處理后3 d的小鼠，將PI用生理鹽水稀釋，以0.4 mg/kg劑量腹腔注射。注射后1 h處死，灌注，取腦，冰凍切片，片厚20 μm，用DAPI染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。200倍視野下，每只小鼠于腦損傷部位選取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)PI陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 各組小鼠神經(jīng)功能缺損程度(NDS)評分 分別在腦外傷后第1、3、7、14、21和28天檢測小鼠的神經(jīng)功能缺損狀況[8]。

1.7 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 腦外傷21 d后，配制10 g/L蔗糖水，裝入小鼠喂水器中。每組取3只小鼠，每個(gè)籠子里放1只小鼠、兩個(gè)喂水器，小鼠適應(yīng)糖水味道3 d后，將其中一個(gè)喂水器中的糖水用純水代替，分別進(jìn)行稱重記錄；腦外傷28 d后，再次稱重記錄，兩次的差值即為小鼠糖水消耗量和純水消耗量，計(jì)算小鼠蔗糖偏嗜度。蔗糖偏嗜度=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

1.8 各組小鼠腦組織中HDAC1和神經(jīng)元特異性相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 腦損傷后28 d，每組小鼠各取3只，使用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛麻醉后處死，取出腦組織，收集腦損傷側(cè)周圍的組織，根據(jù)文獻(xiàn)[9]描述進(jìn)行RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。引物序列和大小見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)融解曲線和擴(kuò)增曲線，采用比較CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 PCR引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析比較各組小鼠腦損傷部位PI陽性細(xì)胞數(shù)目、小鼠蔗糖偏嗜度、腦組織中HDACI和神經(jīng)元特異性相關(guān)基因表達(dá)的差異，應(yīng)用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差比較各組小鼠NDS評分的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腦損傷部位細(xì)胞壞死檢測結(jié)果 PI染色結(jié)果見圖1。TSA+MSCs組壞死細(xì)胞數(shù)目(104.00±5.72)少于MSCs組(139.00±7.48)和Veh組(171.67±10.66)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.977，P<0.001)；MSCs組壞死細(xì)胞數(shù)目少于Veh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組小鼠NDS評分的比較 見表2。

A：Veh組；B：MSC移植組；C：TSA+MSC移植組。圖1 各組小鼠腦損傷部位細(xì)胞壞死情況(PI,×200)

表2 術(shù)后各組小鼠NDS評分比較

F組間=227.334，P<0.001；F組內(nèi)=133.629，P<0.001；F交互=5.828,P<0.001。*：與Veh組相比，P<0.05；#：與MSCs相比，P<0.05。

2.3 各組小鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果 TSA+ MSCs組蔗糖偏嗜度[(61.30±5.08)%]明顯高于Veh組[(49.81±1.46)%]和MSCs組[(51.50±2.45)%](F=16.955，P<0.001)。

2.4 各組小鼠HDAC1和神經(jīng)元特異性相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 見表3。結(jié)果顯示，與Veh組相比，MSCs組和TSA+ MSCs組的HDAC1的表達(dá)量降低，其中TSA+MSCs組中降低更顯著。TSA+MSCs組MAP2和DCX mRNA相對表達(dá)量高于Veh組和MSCs組。

表3 各組小鼠HDAC1和神經(jīng)元特異性相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

*:與Veh組相比，P<0.05；#：與MSCs組相比，P<0.05。

3 討論

在工業(yè)和交通運(yùn)輸業(yè)發(fā)展的今天，腦外傷已成為一種傷殘率極高的常見中樞神經(jīng)類損傷性疾病[10]。腦損傷常常會(huì)伴隨神經(jīng)功能的障礙，為了系統(tǒng)評價(jià)干細(xì)胞移植對TBI的改善作用，作者采用NDS評分評價(jià)各組小鼠的運(yùn)動(dòng)感覺功能，用糖水偏好實(shí)驗(yàn)測定小鼠的憂郁情況。結(jié)果顯示，術(shù)后第1天3組的得分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TSA+MSCs組從術(shù)后第3天開始，得分小于其他2組，與Veh組相比，MSCs組從術(shù)后第7天開始，得分明顯降低。這與之前MSCs移植對TBI有一定的療效的研究一致[11]。蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與MSCs組和Veh組相比，TSA+ MSCs組可以顯著增加蔗糖偏嗜度，而MSCs組和Veh組未見明顯差異。上述結(jié)果說明TSA+ MSCs組較于MSCs單獨(dú)移植，能夠更好地改善TBI小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，降低小鼠抑郁程度。

腦外傷神經(jīng)功能缺失主要與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)，PI可以透過受損的細(xì)胞膜對細(xì)胞核染色，但是不能穿過活細(xì)胞膜。因此作者在術(shù)后第3天，通過PI染色顯示大腦損傷周圍的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，TSA+MSCs組和MSCs組細(xì)胞壞死數(shù)明顯少于Veh組，而且TSA+MSCs組細(xì)胞壞死數(shù)目更少。說明TSA+MSCs組可以減少大腦損傷周圍神經(jīng)細(xì)胞的壞死。

HDAC1是HDAC家族的關(guān)鍵成員，qRT-PCR結(jié)果顯示，相較于其他組，TSA+MSCs組損傷部位HDAC1的表達(dá)量最少。該結(jié)果說明TSA預(yù)處理可以有效抑制HDAC的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控?fù)p傷部位乙?；?，在神經(jīng)修復(fù)中發(fā)揮作用。

腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵是神經(jīng)細(xì)胞的再生。多能干細(xì)胞要先分化為神經(jīng)干細(xì)胞，繼續(xù)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，繼而分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞[12]。作者的研究結(jié)果顯示，術(shù)后第28天，TSA+MSCs組中神經(jīng)元前體細(xì)胞和成熟神經(jīng)元的特異性標(biāo)記基因DCX和MAP2的表達(dá)量明顯高于另外兩組。該結(jié)果說明，TSA+MSCs組可以更好地促進(jìn)損傷部位神經(jīng)細(xì)胞的再生。

綜上所述，TSA預(yù)處理通過降低損傷部位HDAC1的表達(dá)，增加乙?；潭?，減少神經(jīng)細(xì)胞壞死，促進(jìn)神經(jīng)再生，可顯著提高h(yuǎn)UC-MSCs移植對腦損傷的神經(jīng)修復(fù)效果。

[1]BOND AM,MING GL,SONG H.Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis:five decades later[J].Cell Stem Cell,2015,17(4):385

[2]CHENG T,YANG B,LI D,et al.Wharton’s Jelly transplantation improves neurologic function in a rat model of traumatic brain injury[J].Cell Mol Neurobiol,2015,35(5):641

[3]張文進(jìn).人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對大鼠腦損傷區(qū)微循環(huán)的影響[D].鄭州:鄭州大學(xué),2014.

[4]呂建祎.SirT7在RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞神經(jīng)分化過程中的功能研究[D].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2010.

[5]CHU T,ZHOU H,LU L,et al.Valproic acid-mediated neuroprotection and neurogenesis after spinal cord injury: from mechanism to clinical potential[J].Regen Med,2015,10(2):193

[6]LIU HL,WU H,WANG YX,et al.Inhibition of class Ⅱ histone deacetylase blocks proliferation and promotes neuronal differentiation of the embryonic rat neural progenitor cells[J].Acta Neurobiol Exp (Wars),2012,72(4):365

[7]YANG XJ, SETO E. HATs and HDACS: from structure,function and regulation to novel strategies for therapy and prevention[J].Oncogene,2007,26(37):5310

[8]GLUSHAKOV AV,ROBBINS SW,BRACY CL,et al.Prostaglandin F2α FP receptor antagonist improves outcomes after experimental traumatic brain injury[J].J Neuroinflammation,2013,10:132

[9]孟楠,馬珊珊,王欣欣,等.氯化鋰聯(lián)合hUC-MSCs移植對阿爾茨海默鼠的治療作用[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,51(2):157

[10]勵(lì)建安.腦外傷康復(fù)的現(xiàn)狀與未來發(fā)展趨勢[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2011,26(12):1095

[11]GUAN J,ZHU Z,ZHAO RC,et al.Transplantation of human mesenchymal stem cells loaded on collagen scaffolds for the treatment of traumatic brain injury in rats[J].Biomaterials,2013,34(24):5937

[12]武菲,張秋玲.神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化研究中的常用標(biāo)記物[J].中華行為醫(yī)學(xué)和腦科學(xué)雜志,2013,22(3):283

(2016-09-19收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

hUC-MSCs transplantation improves nerve repairment with TSA pretreatment in a mice model of traumatic brain injury

CHENGKang1),MAShanshan1),CHENGTian2),XINGQu1),HUANGTuanjie1),SHIZhenqing1),ZHANGTao1),LIUWenwen1),XULing1),GUANFangxia1)

1)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

trichostatin A;hUC-MSCs;transplantation;traumatic brain injury;nerve repairmen

Aim: To investigate the neuroprotective effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) transplantation with 30 nmol/L trichostatin A(TSA) pretreatment in a mice model of traumatic brain injury(TBI) .Methods: TBI models were produced by using the head hit, and the 27 mice were randomly allocated into vehicle group, MSCs transplantation group and TSA combined with MSCs transplantation group. After 3 days, PI staining was used to analyze the neuron cell necrosis around the injured site. NDS system and Sucrose preference test were used to evaluate sensory function of mouse nerve and the depression of mice on the 1st,2nd,3rd,7th,14th,21st,and 28th day. The relative expression levels of HDAC1, DCX and MAP2 were detected by qRT-PCR.Results: On the 3rd day after operation, compared with Veh group, the number of necrosis cells in MSCs transplantation group and TSA+MSCs transplantation group were significantly reduced, especially the latter group(P<0.001).There was no significant difference in NDS score among the 3 groups in the 1st day. On 3rd day after operation, the NDS score of TSA+MSCs transplantation group was significantly lower than those of MSCs transplantation group and Veh group(P<0.001). On the 28th day after operation, compared with the other 2 groups, the degree of sucrose preference in the 28 day after surgery was increased, HDAC1 expression was reduced, and the expressions of DCX and MAP2 in TSA+MSCs transplantation were enhanced(P<0.001).Conclusion: TSA pretreatment could effectively improve the nerve repairment of hUC-MSCs transplantation in TBI mice.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.003

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 U1404313，81471306和81601078；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì) 15IRTSTHN022；河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃 154200510008；河南省國際人才合作項(xiàng)目 2016GH03，2016GH15

R742