閆 婷，黃 輝，馮得敏，巴 月，程學(xué)敏，崔留欣#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病案科 鄭州 450052

IRE1通路在染氟雄性大鼠生殖損傷中的作用*

閆 婷1)，黃 輝1)，馮得敏2)，巴 月1)，程學(xué)敏1)，崔留欣1)#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病案科 鄭州 450052

#通信作者，男，1955年5月生，本科，教授，研究方向：環(huán)境毒理學(xué)，E-mail:clx@zzu.edu.cn

氟；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；IRE1通路；生殖系統(tǒng)；大鼠

目的：探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1通路在染氟雄性大鼠生殖系統(tǒng)中的作用。方法：60只4周齡SD雄性大鼠隨機分為4組，包括對照組、NaF組、NAC組和NaF+NAC組，每組15只，采用等體積經(jīng)口灌胃方式處理，每周灌胃6 d停灌1 d，連續(xù)灌胃7周。然后測定睪丸臟器系數(shù)，酶聯(lián)免疫法測定血清中睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)含量，TUNEL法檢測睪丸細胞凋亡情況，qRT-PCR法檢測大鼠睪丸組織中IRE1及JNK mRNA的相對表達量，Western blot法檢測大鼠睪丸組織中IRE1、p-IRE1、JNK和p-JNK蛋白的相對表達量。結(jié)果：與對照組相比，NaF組體重及睪丸質(zhì)量減輕，血清T含量降低，血清FSH、LH含量升高，大鼠睪丸細胞凋亡指數(shù)升高，大鼠睪丸組織中IRE1及JNK mRNA表達水平均升高，p-IRE1及p-JNK蛋白表達水平均升高(P均<0.05)。與NaF組比較，NaF+NAC組大鼠睪丸細胞凋亡指數(shù)降低，大鼠睪丸組織中IRE1及JNK mRNA表達水平均下降，p-JNK蛋白表達水平下降(P均<0.05)。結(jié)論：氟暴露可以誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1通路介導(dǎo)的JNK凋亡信號通路；NAC抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，對氟致雄性大鼠生殖損傷起到了一定的拮抗作用。

長期攝入過量氟會導(dǎo)致慢性全身性中毒改變，除可引起骨骼系統(tǒng)的明顯損害外，對非骨相系統(tǒng)也有嚴重影響，如對生殖系統(tǒng)的損傷作用[1]。目前研究[2]發(fā)現(xiàn)氟斑牙和氟骨癥的發(fā)生可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)有關(guān)，那么氟致生殖損傷是否與ERS有關(guān)值得進一步研究。未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)本身作為一種適應(yīng)性的反應(yīng)機制，對機體具有保護作用，但是如果ERS持續(xù)時間過長，UPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則會激活ERS特異性的促凋亡因子的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡。UPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由3種主要的跨膜蛋白起始：雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶、肌醇需求激酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)以及活化轉(zhuǎn)錄因子6介導(dǎo)不同的凋亡信號通路。IRE1α結(jié)合其下游的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2激活A(yù)SK1-JNK信號通路，JNK通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員分子的活性等機制促使細胞凋亡[3]。但是IRE1介導(dǎo)的通路是否參與了氟誘導(dǎo)生殖系統(tǒng)細胞凋亡過程，尚不明確。該研究通過建立氟染毒大鼠模型，并以N-乙酰半胱氨酸(NAC)作為干預(yù)劑，探討IRE1介導(dǎo)的JNK凋亡通路是否參與了氟染毒大鼠睪丸細胞的凋亡過程。

1 材料與方法

1.1 材料 選定SPF級4周齡雄性SD大鼠60只，體重100～150 g[由河南省實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證編號為 SCXK(豫)2010-0002]，普通飼料購自河南省實驗動物中心。血清睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)酶聯(lián)免疫法測定試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司。TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，qRT-PCR法檢測IRE1及JNK mRNA的表達采用MX3000P RT-PCR 儀，DNA引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。兔抗鼠 IRE1 抗體購自美國Abcam公司，兔抗鼠JNK抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，GAPDH 抗體購自南京諾唯贊生物科技有限公司，二抗均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗分組 將大鼠按體重采用隨機數(shù)字表法分為對照組、NaF組、NAC組、NaF+NAC組4組，每組15只。在屏障動物房檢疫1周后，對照組給予10 mL/kg生理鹽水；NaF組按25 mg/(kg·d)給予NaF溶液；NAC組給予150 mg/(kg·d) NAC；NaF+NAC組則先給予150 mg/(kg·d)NAC，0.5 h后以25 mg/(kg·d)NaF進行灌胃處理。每周連續(xù)灌胃6 d后，停灌1 d，共灌胃7周。然后進行以下檢測。

1.3 檢測指標

1.3.1 動物體重、睪丸質(zhì)量的測定及睪丸臟器系數(shù)的計算 染毒 7 周結(jié)束后，測量各組大鼠體重，麻醉并處死后，立即取睪丸稱重，計算其臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器濕重(g)/體重(g)×100%。

1.3.2 血清T、FSH、LH水平的測定 染毒結(jié)束后，麻醉抽取腹主動脈血，離心分離得血清，采用酶聯(lián)免疫法測定血清T、FSH、LH的含量。

1.3.3 睪丸細胞凋亡指數(shù)的TUNEL法檢測 按照TUNEL 細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書進行操作，光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片，凋亡細胞呈棕色，正常細胞呈藍紫色。每例標本選取 5個400倍視野，觀察細胞凋亡情況，每例標本總計數(shù)不少于500個細胞，并計算凋亡細胞占細胞總數(shù)的百分比，即凋亡指數(shù)。

1.3.4 大鼠睪丸組織中IRE1及JNK mRNA表達水平的qRT-PCR法檢測 采用Trizol提取總RNA，酶標儀測RNA 濃度及純度。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，PCR引物序列見表1。反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，模板DNA 2 μL，無RNase水6.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)；融解曲線分析過程：95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt相對定量法計算目的基因的相對表達量。

表1 PCR引物

1.3.5 大鼠睪丸組織中IRE1、p-IRE1及JNK、p-JNK蛋白表達水平的Western blot法檢測 稱取0.1 g睪丸組織于處理過的勻漿器中，加入1 mL RIPA細胞裂解液在冰中勻漿，處理后繼續(xù)在冰上孵育20 min使細胞充分裂解，以14 000×g、4 ℃離心10 min后轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，用BCA法測定蛋白濃度。取約50 μg蛋白經(jīng)電泳分離后，290 mA恒流轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，于37 ℃恒溫封閉2 h，用TBST洗滌30 min后，滴加一抗4 ℃過夜，再次洗滌30 min，37 ℃二抗恒溫孵育30 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。采用Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光成像儀采集圖像，并用ImageQuant TL軟件對圖像進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。不同組間大鼠體重、睪丸質(zhì)量、睪丸臟器系數(shù)，血清T、FSH、TH水平，睪丸細胞凋亡指數(shù)，睪丸組織IRE1、JNK mRNA相對表達量和IRE1、JNK、p-IRE1、p-JNK蛋白相對表達量的比較均采用2×2析因設(shè)計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠體重、睪丸質(zhì)量及其臟器系數(shù)的比較結(jié)果見表2。

2.2 4組大鼠睪丸組織細胞凋亡檢測結(jié)果 見圖1、表3。與對照組比較，NaF組大鼠睪丸組織中可見大量棕褐色和棕黃色凋亡細胞，NaF+NAC組大鼠睪丸組織中凋亡細胞相對減少。

表2 4組大鼠體重、睪丸質(zhì)量及其臟器系數(shù)的比較

A:對照組；B:NAC組；C:NaF組；D:NaF+NAC組；箭頭示凋亡細胞。圖1 4組大鼠睪丸細胞凋亡情況的檢測(TUNEL,×400)

表3 4組大鼠睪丸細胞凋亡指數(shù)測定結(jié)果 %

FNAC=75.303，F(xiàn)NaF=468.690，F(xiàn)交互=78.090，P均<0.001。

2.3 4組大鼠血清T、FSH、LH水平的比較 結(jié)果見表4。

表4 4組大鼠血清T、FSH、LH水平的比較

2.4 ERS對細胞凋亡相關(guān)因子mRNA和蛋白表達的影響 4組大鼠睪丸組織中IRE1和JNK mRNA的表達，以及IRE1、JNK、p-IRE1、p-JNK蛋白表達的比較見圖2、表5。

圖2 4組大鼠IRE1、p-IRE1、JNK和p-JNK Western blot檢測結(jié)果

3 討論

近20 a的研究[4]發(fā)現(xiàn)，氟對雄性生殖系統(tǒng)有嚴重危害，氟暴露能降低精子質(zhì)量和數(shù)量、T等激素水平以及相關(guān)酶的活力。氟化物通過影響動物血清下丘腦-垂體-睪丸軸多種生殖激素水平，而表現(xiàn)出生殖內(nèi)分泌干擾作用。該研究結(jié)果顯示氟暴露組血清中T含量明顯降低，F(xiàn)SH和LH含量升高，這與孫發(fā)等[5]研究結(jié)果相一致，說明氟可以破壞睪丸間質(zhì)細胞的結(jié)構(gòu)和功能，造成T合成和分泌障礙。有人群流行病學(xué)調(diào)查研究[6]顯示，調(diào)查區(qū)水中氟濃度為3.89 mg/L，超過我國規(guī)定的飲用水氟含量(1.5 mg/L)，調(diào)查區(qū)人群血清中T含量明顯低于對照組，LH含量明顯高于對照組，且氟對男性生殖激素的影響大于女性。馬曉英等[7]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)氟暴露可以破壞睪丸組織結(jié)構(gòu)，使間質(zhì)細胞分泌T受到影響，染氟組大鼠血清中GnRH、FSH和E2含量明顯高于對照組，染氟組血清中T含量低于對照組且高氟組低于低氟組，說明氟可以干擾下丘腦-垂體-睪丸軸調(diào)節(jié)生殖激素水平的能力，損傷睪丸間質(zhì)細胞導(dǎo)致血清T水平降低，負反饋調(diào)節(jié)機制發(fā)揮作用，調(diào)控下丘腦和垂體分泌激素功能致使FSH、LH水平升高。

ERS參與了許多病理過程，例如糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、腫瘤及細胞凋亡等。在ERS中，存在3條可以導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生的信號通路：Caspase級聯(lián)反應(yīng)信號通路、CHOP信號通路以及JNK信號通路[8]。該研究結(jié)果顯示，對照組大鼠睪丸組織無或偶見睪丸細胞凋亡，NaF組大鼠睪丸組織切片中可見大量棕褐色和棕黃凋亡細胞，睪丸細胞凋亡指數(shù)明顯升高，且大鼠睪丸細胞中IRE1及JNK mRNA表達水平明顯升高，說明氟可以通過ERS促進睪丸細胞的凋亡。楊陽等[9]發(fā)現(xiàn),氟染毒可以通過ERS反應(yīng)引起睪丸支持細胞的凋亡，細胞凋亡指數(shù)明顯升高。JI等[10]發(fā)現(xiàn)鎘染毒可以使大鼠睪丸細胞中GRP78及p-JNK蛋白表達升高，促進ERS介導(dǎo)的細胞凋亡，造成大鼠生殖損傷。FU等[11]發(fā)現(xiàn)NaF能夠破壞正常細胞的3個胚芽層和成骨細胞的分化從而干預(yù)人體早期的胚胎發(fā)育，而且高劑量的NaF通過JNK依賴途徑引起細胞凋亡。在ERS狀態(tài)下，含IRE1α基因的重組腺病毒感染可促進ATDC5軟骨干細胞的凋亡[12-13]。

NAC是還原型谷胱甘肽的前體，由于其分子內(nèi)含有活性巰基，可有效對抗機體內(nèi)的氧化損傷作用。NAC不僅是抗氧化劑，還有抑制ERS的作用。楊陽等[9]通過細胞實驗證明，NAC可有效抑制氟染毒對睪丸支持細胞的ERS損傷。有研究[10]顯示，NAC可以通過抑制鎘染毒引起的睪丸細胞ERS有效抑制細胞凋亡，從而起到保護睪丸的作用。該實驗結(jié)果顯示，NAC干預(yù)可明顯下調(diào)IRE1和JNK mRNA表達水平，細胞凋亡指數(shù)和p-JNK蛋白表達水平與氟暴露組相比顯著下降，說明NAC可以拮抗ERS反應(yīng)，抑制細胞凋亡發(fā)生，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，氟染毒可參與ERS、IRE1介導(dǎo)的JNK凋亡信號通路促進睪丸細胞的凋亡，繼而引起氟對生殖系統(tǒng)的損傷作用，NAC可抑制ERS，從而抑制細胞凋亡，對氟染毒大鼠生殖損傷起到了一定的拮抗作用。

[1]李薛燕,黃文麗.氟中毒致機體損傷及其機制[J].國外醫(yī)學(xué)(醫(yī)學(xué)地理分冊),2015,36(3):186

[2]馬林,張穎,張凱強,等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡的機制及其在氟斑牙形成中的作用[J].中國實用口腔科雜志,2013,6(6):379

[3]ZENG T,PENG L,CHAO H,et al.IRE1α-TRAF2-ASK1 complex-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to CXC195-induced apoptosis in human bladder carcinoma T24 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,460(3):530

[4]FENG D,HUANG H,YANG Y,et al.Ameliorative effects of N-acetylcysteine on fluoride-induced oxidative stress and DNA damage in male rats′ testis[J].Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen,2015,792:35

[5]孫發(fā),李崇斌,肖躍海,等.燃煤型氟中毒對雄性大鼠生殖內(nèi)分泌激素的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2011,31(10):1077

[6]郝鵬飛,馬曉英,程學(xué)敏,等.氟對暴露人群下丘腦-垂體-性腺軸激素水平的影響[J].衛(wèi)生研究,2010,39(1):53

[7]馬曉英,程學(xué)敏,李富冉,等.氟對雄性大鼠下丘腦-垂體-性腺軸內(nèi)分泌干擾作用的實驗研究[J].衛(wèi)生研究,2008,37(6):733

[8]李敏,林俊.細胞凋亡途徑及其機制[J].國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2014，41(2):103

[9]楊陽,黃輝,袁偉,等.氟對原代培養(yǎng)大鼠睪丸支持細胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響[J].衛(wèi)生研究,2013,42(6):1004

[10]JI YL,WANG H,ZHANG C,et al.N-acetylcysteine protects against cadmium-induced germ cell apoptosis by inhibiting endoplasmic reticulum stress in testes[J].Asian J Androl,2013,15(2):290

[11]FU X,XIE FN,DONG P,et al.High-dose fluoride impairs the properties of human embryonic stem cells via JNK signaling[J].PLoS One,2016,11(2):e0148819

[12]李祥柱,張鵬,韓曉鳳,等.IRE1α重組腺病毒載體對ATDC5軟骨干細胞增殖及凋亡的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2013,38(8):639

[13]DENG H,KUANG P,CUI H,et al.Sodium fluoride(NaF) induces the splenic apoptosis via endoplasmic reticulum(ER) stress pathwayinvivoandinvitro[J].Aging(Albany NY),2016,8(12):3552

(2016-10-10收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Role of IRE1 pathway in fluoride-exposed male rat reproductive system injury

YANTing1),HUANGHui1),FENGDemin2),BAYue1),CHENGXuemin1),CUILiuxin1)

1)DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofMedicalRecord,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

fluorine;endoplasmic reticulum stress;IRE1 pathway;reproductive system;rat

Aim: To research the role of IRE1 endoplasmic reticulum stress pathway in the fluoride-exposed male rat reproductive system injury. Methods: A total of sixty healthy male SD rats(4 weeks old) were divided into 4 groups randomly，including control group, NAC group, NaF group and NaF+NAC group. Each group had 15 rats. The rats were administered for 7 weeks，during which the rats were continuously treated by gavage for 6 days per week. Weight coefficient of testises was assayed. Testosterone(T), follicle stimulating hormone(FSH) and luteinizing hormone(LH) were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. TUNEL method was used to detect testis cell apoptosis. IRE1 and JNK mRNA expression levels were detected by qRT-PCR. IRE1, p-IRE1, JNK and p-JNK protein expression levels were assayed by Western blot. Results: Compared with control group, in NaF group body weight and testicular weight were decreased, serum T level was decreased, serum FSH and LH levels were elevated, testicular apoptosis index was increased, the expression levels of IRE1 and JNK mRNA were increased, and protein expression levels of p-IRE1 and p-JNK were also increased significantly(P<0.05). Compared with NaF group, in NaF+NAC group the apoptosis index was reduced, the expression levels of IRE1 and JNK mRNA were down-regulated, and protein expression level of p-JNK was decreased significantly(P<0.05). Conclusion: Fluorine exposure could induce endoplasmic reticulum stress, and activate IRE1 mediated JNK apoptosis signaling pathway. NAC could inhibit endoplasmic reticulum stress, playing a protective role in fluoride-exposed male rat reproductive system injury.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.007

*河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目 13A330735

R114