陳建興 孫玉江 潘慶杰 馬運峰 嵇傳良 劉春環(huán)

摘要：驢具有很大的市場開發(fā)潛力和價值。通過生物信息學技術分析了驢基因的氨基酸序列特征，以期為阿膠原材料的鑒定或阿膠用驢的選育提供科學依據(jù)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)驢基因的氨基酸構成富含大量的甘氨酸和脯氨酸，而色氨酸含量很低。氨基酸序列開頭的22個殘基預測為該肽鏈的信號肽區(qū)域，COL1A1蛋白中存在大量的卷曲螺旋。驢和馬該基因（剔除gap）mRNA序列間存在12處變異，氨基酸序列間只發(fā)現(xiàn)1處替換。提示在做原材料鑒定時，若以該基因為分子標記，應著重檢測DNA間的差異。

關鍵詞：驢；馬；基因；比較分析

中圖分類號： S822.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0042-03

養(yǎng)驢業(yè)是我國畜牧業(yè)的重要組成部分，在國民經(jīng)濟及人民生活中具有重要地位。雖然隨著交通運輸業(yè)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)機械化的普及，驢的役用價值逐漸消失了，伴隨而來的是驢群數(shù)量減少和種質(zhì)下滑[1-2]。在全國的大部分地區(qū)，驢的種群變化趨勢大致如此，但在內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰地區(qū)，養(yǎng)驢業(yè)已明顯向肉用和藥用（阿膠）這2個發(fā)展方向過渡，養(yǎng)驢業(yè)仍是當?shù)剞r(nóng)村發(fā)展經(jīng)濟的重要組成部分。

膠原蛋白（也稱膠原，collagen）是細胞外基質(zhì)的一種結構蛋白質(zhì)，為多糖蛋白，約占膠原纖維固體物的85%。膠原蛋白是動物體中普遍存在的一種大分子蛋白，主要存在于動物的結締組織（骨、軟骨、皮膚、肌腱、韌帶等）中，占哺乳動物體內(nèi)蛋白質(zhì)的25%～30%，相當于體質(zhì)量的6%[3-4]。膠原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，比如低抗原性、在體內(nèi)易被人體吸收、能促進細胞成活與生長、促進血小板凝集等，在食品、醫(yī)藥、組織工程、化妝品等領域獲得廣泛的應用。中國傳統(tǒng)的膠原保健品“東阿阿膠”主要是以驢皮為原料（其實主要就是驢皮中所含的膠原蛋白）經(jīng)特殊工藝生產(chǎn)出來的，具有較好的滋補保健作用[5]。

膠原蛋白種類較多，常見類型為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅺ型。Ⅰ型膠原蛋白廣泛分布于動物的肌肉、皮膚等組織中，是動物體內(nèi)含量最豐富的膠原蛋白成分，具有調(diào)控膠原纖維形成、組織分化、損傷修復等多種功能。部分學者發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原蛋白的主要成分α1鏈（COL1A1）在損傷組織修復過程中具有重要的生物學功能[6]。

人類基因（編碼Ⅰ型膠原蛋白3股螺旋鏈中的2股）是骨相關疾病和群體骨自然變異檢測的首選基因[7]，這是因為首先該基因的突變被證明與骨質(zhì)疏松、成骨不全（OI）等骨病的發(fā)生有關[8-9]；其次，有研究發(fā)現(xiàn)，基因與骨強度（以骨礦物質(zhì)密度來度量）相關[10-12]。[JP+1]對于驢基因的研究，僅有Lian等的相關報道[6]。為此，本研究通過生物信息學技術初步比較分析驢和馬基因的序列特征，為阿膠原材料的鑒定或者阿膠用驢的選育提供科學依據(jù)。[JP]

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源

所用的驢和馬基因序列，全部來自GenBank。驢和馬的登錄號分別為FJ594763、XM_005597481。

1.2分析方法

通過DNAMAN 7.0軟件完成所有分析。

2結果與分析

2.1驢COL1A1蛋白氨基酸構成分析

通過對驢的COL1A1蛋白氨基酸組成進行分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列長度為1 463個氨基酸殘基。從氨基酸構成來看，驢的COL1A1中氨基酸以甘氨酸所占比例最高（出現(xiàn)388次，26.52%），其次為脯氨酸（出現(xiàn)278次，19%），最低的為色氨酸（出現(xiàn)6次，0.41%），具體見表1。

預計驢COL1A1氨基酸序列的等電點（pI）為5.55。

2.2驢COL1A1氨基酸序列信號肽預測

通過DNAMAN 7.0對驢COL1A1氨基酸序列進行信號肽序列預測，結果發(fā)現(xiàn)在氨基酸序列開頭的前22個氨基酸殘基構成的序列信號肽的信號強度最大，估計此段序列為驢COL1A1的信號肽序列（圖1）。

2.3驢COL1A1蛋白氨基酸序列二級結構預測

對驢COL1A1蛋白氨基酸序列的二級結構進行預測，發(fā)現(xiàn)序列中存在大量的卷曲（coiled-coil），而另2種二級結構——螺旋（helices）和折疊（strands）出現(xiàn)的概率很?。▓D2）。

2.4驢和馬 mRNA序列和編碼氨基酸序列比對分析[HT]

通過DNAMAN 7.0軟件的多重比對功能，對驢和馬的mRNA序列和編碼氨基酸序列進行了比對分析。結果發(fā)現(xiàn)，除去馬的登錄序列中的gap區(qū)段，mRNA序列中存在12處變異，而氨基酸序列間僅出現(xiàn)1個在驢中是A而在馬中是G的替換，結果見圖3。

3討論與結論

由表1可知，驢的COL1A1中氨基酸以甘氨酸所占比例最高，這是因為動物的膠原蛋白都是由3條α肽鏈形成的3股螺旋，而形成3股螺旋須要有大量甘氨酸的存在[3]。在膠原蛋白的肽鏈上每3個氨基酸就有1個甘氨酸，形成Gly-X-Y重復區(qū)域，X和Y經(jīng)常是脯氨酸或4-羥脯氨酸[3]，這也可以解釋脯氨酸的含量為何是第二大的。

信號肽能夠引導蛋白質(zhì)跨膜轉移到特定亞細胞結構或分泌至胞外。信號肽一般包含3個區(qū)，N端帶正電荷；中間是主要功能區(qū)，以中性氨基酸為主，能形成α螺旋；C端含小分子氨基酸，帶負電荷，是信號序列切割位點。具備以上3個區(qū)，且位于分泌蛋白的N端，才能夠形成信號肽。通過DNAMAN7.0對驢COL1A1氨基酸序列進行信號肽序列預測，結果發(fā)現(xiàn)在氨基酸序列開頭的前22個氨基酸殘基構成的序列信號肽信號強度最大，估計此段序列為驢COL1A1的信號肽序列。

對驢COL1A1氨基酸序列的二級結構進行預測，發(fā)現(xiàn)序列中存在大量的卷曲（coiled-coil），而另2種二級結構螺旋和折疊出現(xiàn)的概率很小。卷曲螺旋是由2股或2股以上α螺旋相互纏繞形成的超螺旋結構。而在驢以COL1A1蛋白作為主要成分的膠原蛋白中，的確存在大量這種螺旋結構，這也很好地支持了本研究的預測結果。

通過DNAMAN 7.0軟件的多重比對功能，對驢和馬的mRNA序列和編碼氨基酸序列進行了比對分析。結果發(fā)現(xiàn)，除去馬的登錄序列中的gap區(qū)段，mRNA序列中存在12處變異；而氨基酸序列間僅出現(xiàn)1個，為在驢中是A而在馬中是G的替換。因為在所有動物中，都是一個保守基因，其序列本來就很少發(fā)生變化，在驢和馬親緣關系較近的物種對間，這種較小差異的出現(xiàn)也在情理之中。這也提示在做阿膠原材料鑒定時，以DNA為材料可能比以蛋白為材料更準確和靈敏。

參考文獻：

[1]Chen J X，Song Z H，Rong M J，et al. The association analysis between Cytb polymorphism and growth traits in three Chinese donkey breeds[J]. Livestock Science，2009，126：306-309.

[2]孫玉江，陳建興，李新. 發(fā)展我國肉驢產(chǎn)業(yè)的對策[J]. 當代畜牧，2007（8）：2-4.

[3]Gelse K，Poschl E，Collagens-structure A T，et al. And biosynthesis[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2003，55：1531-1546.

[4]Viguet-carrin S，Garnero P，Delmas P D. The role of collagen in bone strength[J]. Osteoporosis International，2006，17（3）：319-336.[JP]

[5]張少權. 阿膠原料的主要蛋白組成及其生理活性的研究[D]. 福州：福州大學，2005：1-14.

[6]Lian J，Qin Y，You J，et al. Molecular cloning of full-length coding sequences and characterization of α chains for donkey（Equus asinus）type Ⅰ collagen[J]. African Journal of Biotechnology，2013，12（27）：4290-4302.

[7]Stover D A，Verrelli B C. Comparative vertebrate evolutionary analyses of type Ⅰ collagen：potential of gene structure and intron variation for common bone-related diseases[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（1）：533-542.[HJ1.7mm]

[8]Parker M J，Deshpande C，Rankin J，et al. Type 1 collagenopathy presenting with a Russell-Silver phenotype[J]. American Journal of Medical Genetics Part A，2011，155A（6）：1414-1418.

[9]Malfait F，Symoens S，de Backer J，et al. Three arginine to cysteine substitutions in the pro-alpha （Ⅰ）-collagen chain cause Ehlers-Danlos syndrome with a propensity to arterial rupture in early adulthood[J]. Human Mutation，2007，28（4）：387-395.

[10]Garcia-Giralt N，Nogués X，Enjuanes Anna，et al. Two new single-nucleotide polymorphisms in the upstream regulatory region and their relationship to bone mineral density[J]. Journal of Bone and Mineral Research，2002，17（3）：384-393.

[11]Stewart T L，Jin Huilin，Mcguigan F E，et al. Haplotypes defined by promoter and intron 1 polymorphisms of the gene regulate bone mineral density in women[J]. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，2006，91（9）：3575-3583.

[12]Jiang H，Lei S F，Xiao S M，et al. Association and linkage analysis of and [WTBX][STBX]AHSG[WTBZ][STBZ] gene polymorphisms with femoral neck bone geometric parameters in both Caucasian and Chinese nuclear families[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2007，28（3）：375-381.