李琳琳 嚴林 金生英 謝久祥 溫小成

摘要：為探討適合枸杞棉蚜基因組DNA提取的方法，采用9種方法提取枸杞棉蚜基因組DNA，并對每種方法提取的DNA樣本質(zhì)量進行綜合比較分析。結(jié)果表明，改進十二烷基硫酸鈉（SDS）法、優(yōu)化KAc法、STE精提法、Chelex粗提法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、鹽析法均可從枸杞棉蚜中提取總DNA，濃度高且所制備出的DNA均可成功應(yīng)用于mtDNA CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因擴增。STE粗提法、Chelex精提法、飽和NaCl法Ⅱ提取的枸杞棉蚜基因組DNA質(zhì)量低，不能滿足分析要求。改進SDS法及STE精提法所制備的DNA質(zhì)量較佳、產(chǎn)量較高、實用性強，是值得推廣應(yīng)用的枸杞棉蚜基因組DNA提取方法。鹽析法提取DNA，試劑成本低、毒性小，是一種安全有效的枸杞棉蚜基因組DNA提取方法。Chelex粗提法是一種快速的枸杞棉蚜基因組DNA提取方法。

關(guān)鍵詞：枸杞；棉蚜；基因組DNA；提取方法

中圖分類號： S435.671文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0030-04

枸杞棉蚜（Aphis gossypii Glover）屬同翅目（Hompotera）蚜科（Aphididae）蚜屬（Aphis），是我國西北地區(qū)栽培枸杞（Licium barbarum L.）分布地的主要害蟲，短期內(nèi)可暴發(fā)成災(zāi)，引起枸杞果產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重下降[1]。棉蚜具有明顯的生物型[2-3]，如棉花型和黃瓜型[4-5]，而枸杞棉蚜屬于何種生物型亟待驗證。確定昆蟲的生物型，不僅需要采用傳統(tǒng)的生物學特征和生態(tài)學參數(shù)比較[4，6-7]，而且需要分子遺傳學數(shù)據(jù)佐證[2，7-8]。

單頭枸杞棉蚜基因組DNA提取是開展枸杞棉蚜分子遺傳學研究的前提與基礎(chǔ)[9]。由于枸杞棉蚜體型微小，體表有外骨骼，其DNA提取有一定難度。Black等通過十二烷基硫酸鈉（SDS）方法提取蚜蟲基因組DNA，并通過隨機擴增多態(tài)性DNA-PCR（RAPD-PCR）檢測蚜蟲多態(tài)性[10]；龔鵬等在棉蚜DNA的提取中采用STE精提法，用簡單重復序列PCR（SSR-PCR）技術(shù)研究了棉花和木槿上棉蚜的多態(tài)性[11]；安瑞生等對KAc法、SDS法的研磨步驟進行了改進[12-13]；張帆對改進后的KAc法中加入蛋白酶K進行了優(yōu)化，并用 mtDNA-CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]技術(shù)研究了棉花型、黃瓜型棉蚜的多態(tài)性[14]。目前，國內(nèi)最常用的2種棉蚜基因組DNA提取方法為改進SDS法和優(yōu)化KAc法。國外棉蚜基因組DNA提取常采用SDS法[2，8]，以及Chelex粗提法[7，15]。

為篩選出適合枸杞上棉蚜基因組DNA的提取方法，本研究借鑒國內(nèi)外應(yīng)用較多的提取蚜蟲DNA的8種方法對其稍作改進，即改進SDS法、優(yōu)化KAc法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、鹽析法、飽和NaCl法Ⅱ、STE粗提法、Chelex粗提法、STE精提法，并參照Chelex粗提法自創(chuàng)了Chelex精提法，對這9種方法提取的基因組DNA的質(zhì)量、DNA提取所需時間、操作難易程度和所用試劑的毒性大小進行綜合比較，為進一步開展枸杞棉蚜遺傳結(jié)構(gòu)分析奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

于2015年7—8月在青海諾木洪枸杞主產(chǎn)區(qū)蚜蟲發(fā)生較重的栽培枸杞田，采集無翅蚜蟲成蟲，每株枸杞采集1頭試蟲，每頭試蟲所在植株至少間隔5 m，樣品單頭分別放于盛有無水乙醇的1.5 mL離心管中浸泡，于4 ℃低溫采樣箱內(nèi)保存，帶回實驗室后，于-40 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。試驗時隨機抽取。

1.2基因組DNA的提取方法

改進SDS法：參照楊子祥等的改進SDS法[16]，稍作改進。具體方法：將單頭蚜蟲在雙蒸水中漂洗，濾紙吸干后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入100 μL勻漿液（按A液 ∶[KG-*3]B液 ∶[KG-*3]C液體積比25 ∶[KG-*3]3 ∶[KG-*3]2配制。其中A液：Tris-HCl 10 mol/L，NaCl 01 mol/L，EDTA 1 mol/L，pH值為8.0；B液：10% SDS；C液：蛋白酶K 10 mg/mL）。用滅菌玻璃研磨棒對蚜蟲進行研磨。并用500 μL勻漿液沖洗研磨棒，56 ℃水浴4 h（若裂解液未透明，水浴時間延長至8 h），其間搖勻3～4次。加入600 μL Tris飽和酚，在搖床上緩慢搖勻20 min后，7 000 r/min 離心10 min，取上清液。加入600 μL三氯甲烷 ∶[KG-*3]異戊醇（體積比為24 ∶[KG-*3]1），在搖床上緩慢搖勻20 min后，7 000 r/min 離心 10 min，取上清液。加入600 μL無水乙醇（-20 ℃預(yù)處理），混勻，-20 ℃冰箱內(nèi)放置1 h以上。12 000 r/min 離心 10 min，棄去上清液。加入600 μL 70%乙醇（-7 ℃預(yù)處理），12 000 r/min離心10 min，棄去上清液。自然干燥后，加入20 μL ddH2O溶解，-20 ℃保存。

優(yōu)化KAc法：參照張帆的優(yōu)化KAc法[14]。

STE粗提法：參照Gomi等的STE粗提法[17]，挑取蚜蟲方法同改進SDS法中的挑取方法，加入20 μL STE緩沖液（100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH值為8.0），用玻璃研磨棒研磨，加入1.6 μL蛋白酶K（10 mg/mL）；簡單離心后，37 ℃孵育30 min；95 ℃初始變性5 min；簡單離心后，-20 ℃保存。

Chelex粗提法：參照Carletto等的Chelex粗提法[7，15]，蚜蟲在0.65%（質(zhì)量分數(shù)）NaCl溶液中洗2次；將蚜蟲放入 1.5 mL 離心管中，管內(nèi)放有55 μL 5%（質(zhì)量分數(shù)）Chelex樹脂溶液，用玻璃研磨棒研磨；56 ℃水浴30 min，在100 ℃水浴7 min；5 000 r/min離心1 min，取上清液，-20 ℃保存。

STE精提法：參照龔鵬等的STE精提法[11]，在STE粗提法的基礎(chǔ)上進行改進，挑取單頭蚜蟲置于1.5 mL離心管內(nèi)分別加入200 μL STE緩沖液（100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH值為8.0），用玻璃研磨棒研磨，分別向離心管內(nèi)再加入500 μL勻漿液、1.6 μL蛋白酶K（10 mg/mL），56 ℃水浴4 h；剩余步驟參照改進SDS法進行酚-三氯甲烷抽提，無水乙醇沉淀DNA，溶解保存。

Chelex精提法：在Chelex粗提法的基礎(chǔ)上進行改進，蚜蟲在0.65%（質(zhì)量分數(shù)）NaCl溶液中洗2次；將蚜蟲放入 1.5 mL 離心管中，管內(nèi)放有100 μL 5%（質(zhì)量體積比）Chelex樹脂溶液，研磨；分別向離心管內(nèi)再加入500 μL勻漿液、2 μL蛋白酶K（10 mg/mL），56 ℃水浴4 h；剩余步驟參照改進SDS法進行酚-三氯甲烷抽提，無水乙醇沉淀DNA，溶解保存。

CTAB法：參照韓玉翠等的CTAB法[18]，稍作改進。具體步驟如下：挑取蚜蟲于離心管中，加入50 μL CTAB 緩沖液[2%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl（pH值為8.0），0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，0.2% β-巰基乙醇]，用滅菌玻璃研磨棒對蚜蟲進行研磨。并用150 μL CTAB緩沖液沖洗研磨棒；65 ℃水浴1 h；取出后加入1 U RNA酶，置于37 ℃溫箱中1 h；取出后加入500 μL三氯甲烷-異戊醇（體積比為 24 ∶[KG-*3]1），緩慢搖動混勻，13 000～15 000 r/min離心15 min；取上清液（約 150 μL），加入2倍體積的冰無水乙醇，約1/10體積NaAc（3 mol/L，pH值為5.2），混勻后置于-20 ℃ 3 h以上；13 000 r/min 離心15 min，棄上清液，用70%乙醇（-20 ℃ 預(yù)處理）清洗2次；室溫干燥，加入20 μL TE緩沖液溶解，于-20 ℃ 保存。

鹽析法：參照Sunnucks等的鹽析法[19]，稍作改進。具體步驟如下：挑取蚜蟲于離心管中，加入20 μL TNES提取緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH值為7.5，400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，0.5% SDS），用滅菌玻璃研磨棒對蚜蟲進行研磨，并用200 μL TNES沖洗研磨棒；再加入5 μL蛋白酶K（20 mg/mL），輕搖混勻，于60 ℃水浴1 h（中間取出搖勻1次）；加入80 μL 5 mol/L NaCl，用力搖動15 s，4 ℃、14 000 r/min 離心5 min，取上清液；加入300 μL預(yù)冷的無水乙醇輕輕混勻，-20 ℃放置30 min；4 ℃、14 000 r/min離心 5 min，棄上清液；加入300 μL 75%乙醇（-20 ℃預(yù)處理）洗滌，4 ℃、14 000 r/min離心5 min，棄上清液；在室溫下干燥，然后加20 μL滅菌ddH2O，充分溶解后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

飽和NaCl法Ⅱ：參照馬麗濱等挑取螞蟻的飽和NaCl法Ⅱ[20]。

1.3基因組DNA純度及濃度檢測

對9種方法提取的DNA濃度和純度進行檢測。用Biowave DNA型蛋白核酸分析儀測定DNA純度和濃度。純度由D260 nm/D280 nm值確定，該值介于1.7～1.9之間時DNA純度較好，以測量值為參數(shù)確定DNA濃度。

1.4基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

采用1%瓊脂糖凝膠（添加了0.01% GoldView I型核酸染色劑）電泳，將8.0 μL DNA、2 μL 6×Loading Buffer混勻后上樣，電泳條件為140 V，30 min，經(jīng)Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)（購自美國BIO-RAD公司）照相和分析。DNA的條帶無拖尾、無RNA污染，點樣孔無酚、蛋白質(zhì)殘留，可用于mt-DNA CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]擴增研究。

1.5PCR 擴增及檢測

參照張帆使用的棉蚜CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]引物[14]，上游引物為CAL：5′-TAATAACGAACAGGAACAG-3′，下游引物為CAR：5′-TAGTTGCTGATGAAGTAG-3′，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴增體系為50 μL：25μL Premix TaqTM（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye），1 μL上游引物，1 μL下游引物，1 μL DNA，22 μL ddH2O。擴增程序為94 ℃預(yù)變性 2 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物于-20 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠（添加了0.01% GoldView I型核酸染色劑）電泳檢測（140 V，30 min），上樣量為每孔 10 μL，經(jīng)Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)照相和分析。其中CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因在電泳中檢測到目標片段后，將40 μL擴增產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，以PCR引物為測序引物，在ABI3730測序儀上進行正向測序。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA純度及濃度檢測

通過9種方法提取單頭枸杞蚜蟲樣品，檢測DNA的濃度和純度，如表1所示，改進SDS法、STE精提法、Chelex粗提法提取DNA樣品濃度的平均值分別為264.33、225.00、256.67 ng/mL，D260 nm/D280 nm 平均值分別為1.73、1.84、1.73，均為高質(zhì)量DNA；CTAB法、鹽析法、飽和NaCl法Ⅱ提取DNA樣品濃度的平均值分別為316.67、456.67、216.67 ng/mL，D260 nm/D280 nm平均值分別為1.94、1.94、1.90，可見DNA中有少量RNA的污染；Chelex精提法提取DNA樣品濃度的平均值為36.67 ng/mL，D260 nm/D280 nm平均值為213，說明DNA中有大量RNA的污染，DNA濃度過低；優(yōu)化KAc法提取DNA樣品濃度的平均值為318.33 ng/mL，D260 nm/D280 nm平均值為1.63，說明DNA中有蛋白質(zhì)或酚的污染；STE粗提法提取DNA樣品濃度的平均值為834.67 ng/mL，D260 nm/D280 nm平均值為146，說明DNA中有大量蛋白質(zhì)或酚的污染。

2.2基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

9種提取枸杞棉蚜基因組DNA方法的電泳檢測結(jié)果如圖1、圖2所示，改進SDS法、STE精提法、CTAB法、鹽析法顯示DNA主帶明顯，其中改進SDS法、STE精提法中有RNA條帶；飽和NaCl法Ⅱ條帶暗，說明濃度低；優(yōu)化KAc法DNA主帶不明顯，DNA不完整，有降解；STE粗提法、Chelex粗提法、Chelex精提法均無DNA條帶， 說明STE粗提法、Chelex粗提

法提取的DNA含大量雜質(zhì)，無法檢測出DNA主條帶，Chelex精提法提取的DNA濃度極低，因而無法檢測出DNA條帶。

2.3PCR擴增及檢測

按照“1.5”節(jié)中的方法進行CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]引物的特異性擴增，結(jié)果顯示，STE粗提法、Chelex精提法、飽和NaCl法Ⅱ沒有擴增到特異性條帶，而其余6個方法均擴增到目的條帶，且目的條帶清晰，如圖3、圖4所示。

2.4測序結(jié)果分析

以改進SDS法、優(yōu)化KAc法、STE精提法、Chelex粗提法、CTAB法、鹽析法提取的枸杞蚜蟲的基因組DNA為模板，以CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]引物擴增的產(chǎn)物均能達到測序要求，獲得成功測序，

部分測序結(jié)果如圖5所示。將所測定的蚜蟲CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，根據(jù)結(jié)果判定為棉蚜。

3討論與結(jié)論

本研究首次采用國內(nèi)外9種方法對枸杞棉蚜基因組DNA[JP]提取進行了比較試驗。結(jié)果表明，改進SDS法、STE精提法、Chelex粗提法、CTAB法、鹽析法均可有效地提取枸杞棉蚜基因組DNA，并成功應(yīng)用于mtDNA CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因的擴增；飽和NaCl法Ⅱ可以提取枸杞棉蚜DNA，但質(zhì)量較低，在CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]擴增中不能顯示出DNA條帶；STE粗提法、Chelex精提法提取的枸杞棉蚜基因組DNA質(zhì)量低，不能滿足分析的需求。

楊子祥等認為改進SDS法優(yōu)于KAc法[13]，本試驗的結(jié)果[CM（25]與之一致。在用改進SDS法提取棉蚜DNA過程中，采用[CM）]

無水乙醇沉淀DNA也能制備出高質(zhì)量棉蚜的DNA，滿足 CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）] 擴增需求；張帆采用優(yōu)化KAc法成功提取棉蚜DNA，并滿足CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]擴增[14]，本研究采用優(yōu)化KAc法提取的DNA雖能滿足CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]擴增，但提取的DNA樣品不完整，D260 nm/D280 nm 值低于165，原因可能是枸杞棉蚜較棉花棉蚜、黃瓜棉蚜體壁顏色深，該方法不能有效去除色素雜質(zhì)，并且研磨時間長，導致提取的DNA樣品降解。

龔鵬等采用STE精提法需要30頭棉蚜混合制備高質(zhì)量DNA[11]，而本研究用單頭棉蚜也可以提取出相同質(zhì)量的棉蚜DNA，說明STE裂解液能有效釋放枸杞棉蚜的DNA，經(jīng)由酚-三氯甲烷抽提可以有效去除雜質(zhì)，即制備出高質(zhì)量的DNA。本研究STE粗提法未能快速提取枸杞棉蚜高質(zhì)量的DNA，與Gomi等的研究結(jié)果[17]不一致，Gomi等采用STE粗提法提取單頭葉螨DNA，滿足16S rDNA的分析，原因可能是STE粗提法提取枸杞棉蚜DNA時，水浴條件為37 ℃、30 min，導致蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)不能完全降解。是否可以通過提高水浴溫度、延長孵育時間使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)完全降解，有待進一步驗證。

本研究表明，鹽析法也適用于棉蚜DNA的提取，與前人試驗結(jié)果一致，他們通過鹽析法高效地提取了大豆蚜[21]、麥長管蚜[22]、煙粉虱[23]的DNA，其中張燁等采取液氮破碎蟲體[22]，本研究改進使用滅菌玻璃研磨棒研磨蟲體，也可提取相同質(zhì)量的DNA，使操作更加簡便。

采用CTAB法提取枸杞棉蚜DNA過程中，采取無水乙醇沉淀DNA無法制備高質(zhì)量的DNA，與韓玉翠等的研究結(jié)果[18]一致，韓玉翠等用CTAB法提取麥長管蚜、高粱蚜DNA，認為異丙醇沉淀DNA優(yōu)于無水乙醇沉淀DNA[18]。使用異丙醇沉淀DNA能否制備高質(zhì)量棉蚜DNA有待進一步驗證。

胡尊瑞等采用CTAB法、飽和NaCl法Ⅱ、鹽析法提取桃蚜DNA時，認為飽和NaCl法Ⅱ優(yōu)于其他方法[24]，本試驗結(jié)果與之不一致，表明飽和NaCl法Ⅱ不適用于提取枸杞棉蚜DNA，原因可能是試驗材料物種不同。

Chelex粗提法是國外常用的提取棉蚜DNA的方法，本試驗也證明Chelex粗提法能夠快速地提取高質(zhì)量的枸杞棉蚜DNA。Chelex精提法，提取DNA濃度極低，不能滿足CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]分析，原因可能是Chelex-100為化學離子螯合樹脂，Chelex-100吸附DNA，經(jīng)酚抽提時，DNA也進入有機相，故上層水相中無DNA。

綜上所述，在時間充裕并要求提取高產(chǎn)量、高質(zhì)量的DNA情況下，提取枸杞棉蚜DNA建議選用改進SDS法、STE精提法；在要求減少對試驗人員毒害的前提下，建議選用鹽析法，此方法在安全性及時間方面優(yōu)于改進SDS法、STE精提法；在時間緊促情況下，建議選用Chelex粗提法，該方法操作簡單，耗時最少，Chelex-100使用手冊上指出該法所獲得DNA模板保存時間較短，應(yīng)在1周內(nèi)使用。因此，可以根據(jù)試驗?zāi)康?、試驗成本等情況綜合考慮，選取合適的枸杞棉蚜基因組DNA提取方法。

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