毛加寧+楊瑩+農(nóng)向

摘要：采用改性殼聚糖作為載體研究改性殼聚糖作為固定化材料對纖維素酶吸附大小的影響。結(jié)果表明，當(dāng)交聯(lián)劑濃度達(dá)到4%時對改性固定化酶活性影響最大，改性殼聚糖固定化酶的最適pH值為4.3，改性殼聚糖作為載體的固定化纖維素酶米氏常數(shù)為3.7×10-3，未改性殼聚糖為載體的固定化纖維素酶的米氏常數(shù)為7.2×10-3，用改性殼聚糖作為載體的固定化纖維素酶最適溫度為55 ℃左右。結(jié)果表明，改性殼聚糖作為載體固定化纖維素酶可以提高游離酶的性質(zhì)。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；殼聚糖；固定化；改性

中圖分類號： S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0160-04

纖維素作為地球上最豐富的可再生資源，具有廣闊的開發(fā)利用前景，以纖維素酶為固化對象，通過試驗(yàn)比較化學(xué)改性與未改性殼聚糖固化酶載體，探索固化酶的制備方法與性質(zhì)，旨在研究固化酶的最適條件，從而改善傳統(tǒng)意義殼聚糖固定化纖維素酶的相關(guān)研究。甲殼類動物廢棄的外殼中可以提取一種多糖——?dú)ぞ厶牵瑢W(xué)名為2-氨基-1，4-β葡聚糖，含有極其豐富的甲殼素（chitin）。殼聚糖的結(jié)構(gòu)與纖維素類似，也是至今為止在自然界中被發(fā)現(xiàn)的唯一的陽離子型可食用纖維，對疾病有很好的保健和預(yù)防作用[1-4]。由于分子中存在氨基，使其易于酶共價結(jié)合，也可絡(luò)合金屬離子，化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，耐熱性好，經(jīng)常作為固定化酶的載體[5-8]。本試驗(yàn)通過采用化學(xué)方法改性殼聚糖固定化纖維素酶，改變殼聚糖的某些分子結(jié)構(gòu)，探索相比未改性殼聚糖分子更優(yōu)化的性質(zhì)。

本研究采用簡單的化學(xué)方法對殼聚糖進(jìn)行了改性，并采用拉曼光譜和X光衍射分別測定了改性殼聚糖的部分性質(zhì)。最后，研究了改性殼聚糖固定化纖維素酶的效果。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

纖維素酶，殼聚糖，氨基硫脲-殼聚糖改性產(chǎn)物，3，5-二硝基水楊酸染色液，羧甲基纖維素鈉鹽溶液，其他試劑均為分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1纖維素酶液的制備取1 g纖維素酶，加入1 000 mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢柚敝寥咳芙?，得纖維素酶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2羧甲基纖維素鈉鹽溶液的配制準(zhǔn)確稱取1.00 g羧甲基纖維素鈉，用50 mmol/L、pH值為 5.0的檸檬酸鈉緩沖液加熱溶解后，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，待冷卻后，用該緩沖液定容至刻度，4 ℃保存?zhèn)溆?。母液A（0.2 mol/L檸檬酸溶液）：稱取42.03 g C6H8O7·H2O 溶解稀釋至1 000 mL；母液B（0.2 mol/L 檸檬酸鈉溶液）：稱取58.82 g Na3C6H5O7·2H2O 溶解稀釋至1 000 mL；取20.5 mL母液A和29.5 mL母液B混合，調(diào)節(jié)pH值至5.0，稀釋至200 mL，即得 50 mmol/L、pH值為 5.0的檸檬酸鈉緩沖液。

1.2.3固定化酶活性測定

在一定量固定化酶中（一般取0.1～0.5 g）加入一定量（一般為3.0 mL）羧甲基纖維素鈉鹽溶液，40 ℃水浴保溫10 min后離心5 min，吸取反應(yīng)液 2.0 mL，加入0.4 mL 2 mol/L NaOH溶液，加入0.8 mL 3，5-二硝基水楊酸顯色劑，定容至6.2 mL，沸水浴中加熱5 min后流水冷卻，在最適條件（40 ℃）下，1 min內(nèi)催化1 μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量定為1個活性單位，用721分光光度計(jì)在490 nm處測定吸光度[5]。

1.2.4殼聚糖改性產(chǎn)物的制備

殼聚糖乙酸溶液的制備[1]：將1 g殼聚糖在100 mL蒸餾水中浸泡潤濕15 min，然后加入40 mL 2.5%的乙酸溶液，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓吹玫綒ぞ厶且宜崛芤骸?/p>

殼聚糖改性吸附劑的制備：稱取3 g氨基硫脲置于 250 mL 燒杯中，加入100 mL蒸餾水，加熱攪拌至50 ℃時，逐滴加入6 mL 25%的戊二醛溶液，并充分反應(yīng)45 min。加入配制好的殼聚糖乙酸溶液，加熱至70 ℃，充分反應(yīng)30 min后，取出反應(yīng)物，流水冷卻，再分3次加入80 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液，攪拌充分后，抽濾，用蒸餾水洗滌產(chǎn)物至濾液pH值為7.0，再用乙酸乙酯、無水乙醇分別洗滌后，放入真空干燥箱于60 ℃下至質(zhì)量不再變化，最終獲得淡黃色固體粉末狀殼聚糖改性產(chǎn)物。

1.2.5纖維素酶的固定化

稱取2 g改性殼聚糖，加入100 mL 6%的戊二醛，充分?jǐn)嚢?.5 h直至溶解，靜置24 h，3 000 r/min 離心5 min后棄去上清液，水洗2～3次以除去殘余戊二醛，抽濾，往交聯(lián)后的殼聚糖中加入1 g纖維素酶，室溫下繼續(xù)攪拌2.5 h，轉(zhuǎn)入冰箱于4 ℃保存?zhèn)溆?。靜置24 h，3 000 r/min 離心5 min后棄去上清液，水洗2～3次，抽濾即得改性固定化酶；稱取一定量的未改性殼聚糖作以上同樣的處理，即得未改性固定化酶。

1.2.6酶活性的測定

葡萄糖含量的測定用3，5 - 二硝基水楊酸法，并作如下修改：1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖水溶液，濃度梯度終體積為4 mL，加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸準(zhǔn)確煮沸5 min，流水冷卻后于520 nm處比色，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)生的葡萄糖量，從而計(jì)算酶活性，以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為 y=1.935 40x-0.062 05，r2=0.996 51。

2結(jié)果與分析

2.1拉曼光譜（Raman spectra）

拉曼光譜（Raman spectra）是一種散射光譜。拉曼光譜分析法是基于印度科學(xué)家C.V.拉曼（Raman）所發(fā)現(xiàn)的拉曼散射效應(yīng)，對與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析以得到分子振動、轉(zhuǎn)動方面信息，并應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究的一種分析方法。

拉曼光譜分析技術(shù)是以拉曼效應(yīng)為基礎(chǔ)建立起來的分子結(jié)構(gòu)表征技術(shù)，其信號來源于分子的振動和轉(zhuǎn)動。拉曼光譜分析技術(shù)對不同的物質(zhì)具有不同的特征光譜，因此可以通過光譜進(jìn)行改性殼聚糖的定性分析，根據(jù)物質(zhì)對光譜的吸光度的特點(diǎn)，可以對改性殼聚糖物質(zhì)的量進(jìn)行分析。

改性殼聚糖或未改性殼聚糖的拉曼光譜都產(chǎn)生了明顯的波長變化，隨著拉曼頻移逐漸增大，殼聚糖的拉曼光強(qiáng)逐漸減小，相比未改性殼聚糖，改性殼聚糖在拉曼頻移為1 300 cm-1時，拉曼光強(qiáng)為32 000左右，而未改性殼聚糖在拉曼頻移為 1 300 cm-1 時，拉曼光強(qiáng)為18 000左右（圖1）。拉曼散射光的強(qiáng)度并不是在所有方向上相等。影響2種殼聚糖拉曼峰強(qiáng)的因素有很多，晶體材料比非晶體材料有更強(qiáng)的拉曼峰，拉曼強(qiáng)度也會隨鍵級而增強(qiáng)。

2.2X光衍射（X-ray diffraction）

X光衍射（X-ray diffraction），即X射線衍射。X光的波長范圍為10-2～102 nm，與原子尺度接近。X光繞射廣泛被用來探知物質(zhì)內(nèi)部的微結(jié)構(gòu)，利用特性X光入射到結(jié)晶材料，在某些入射角材料的相鄰結(jié)晶面散波彼此相位相同，且光程[CM（25]差為波長的整數(shù)倍，因此發(fā)生了建設(shè)性干涉。根據(jù)改性殼

[FK（W21][TPMJN1.tif]

聚糖與未改性殼聚糖結(jié)晶結(jié)構(gòu)的不同，有所謂的空間群（space group）的區(qū)分，即使結(jié)構(gòu)相同晶體內(nèi)部原子組成不同，其結(jié)構(gòu)因子（structure factor）不同，對于X光散射能力也不同。

X光衍射可以進(jìn)行多物相成分的定性分析，殼聚糖的2種晶形分別稱為FormI（2θ在32°左右）和FormII（2θ在20°左右），如圖2所示，改性殼聚糖在32°有明顯的衍射峰，表明原料殼聚糖粉末只有FormI一種晶體存在。當(dāng)殼聚糖被改性后，改變了殼聚糖分子的結(jié)構(gòu)，F(xiàn)ormI晶形的衍射峰從20.0°遷移到32.8°，這表明伴隨著殼聚糖改性，一種新的晶體逐步形成。

2.3用不同濃度的戊二醛溶液對2種固定化酶活性的影響

稱取6份0.1 g 改性殼聚糖于小燒杯中，分別加入濃度為1%～6%的戊二醛溶液5.0 mL，充分?jǐn)嚢?.5 h，置于離心機(jī)中3 000 r/min離心10 min進(jìn)行分離，用蒸餾水洗滌2～3次以除去溶液中的戊二醛，往交聯(lián)物中分別加入4.0 mL 1 g/L 的纖維素酶溶液，置于4 ℃冰箱中，1 h攪拌1次，持續(xù)24 h，3 000 r/min 離心5 min棄去上清液，水洗3次，得固定化酶。稱取6份0.1 g 未改性殼聚糖作同樣的處理。

固定化酶活性測定結(jié)果如圖3所示，殼聚糖改性固化酶最適戊二醛交聯(lián)濃度為3%，未改性殼聚糖固化酶最適戊二醛交聯(lián)濃度為4%，當(dāng)戊二醛的濃度達(dá)到3%時，改性固化酶的活力已達(dá)到最大。

[BT2+*5]2.42種固定化酶的最適pH值

準(zhǔn)確配制pH值為3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6的 HAc/NaAc 緩沖液。吸取梯度緩沖液各1.5 mL，分別加入 15 mL 20 %的蔗糖溶液。與改性固定化酶反應(yīng)時，先在固定化酶中加入1 mL蒸餾水，混勻后再將蔗糖溶液倒入纖維素酶中，30 ℃反應(yīng) 5 min，殼聚糖固定化酶則用沸水浴反應(yīng) 1 min 終止反應(yīng)，4 000 r/min離心5 min，各管取反應(yīng)液 0.5 mL，加入35 mL蒸餾水中，加入1 mL染色液，顯色后測吸光度。結(jié)果如圖4所示，改性殼聚糖固定化酶的最適pH值為4.3，而未改

性殼聚糖固定化酶的最適pH值為3.8。

2.5原酶、固定化酶與改性固定化酶米氏常數(shù)的比較

平行取固定化酶與改性固定化酶各0.1 g、原酶0.5 mL（1 g/L）各6份，分別與一定量（3.0 mL）不同濃度（1%～6%）的底物于40 ℃水浴中反應(yīng)15 min，測其吸光度，用Linew eaver Burk雙倒數(shù)法作圖，求得米氏常數(shù)（Km）。結(jié)果如圖5所示，原酶的Km值為7.3×10-3 g/L，未改性固化酶的Km值為 72×10-3 g/L，改性固化酶的Km值為3.7×10-3 g/L，殼聚糖被改性后，固定纖維素酶表現(xiàn)為米氏常數(shù)減小。

2.6溫度對酶活性的影響

酶在固定化后，穩(wěn)定性普遍增加，這主要表現(xiàn)在改性固定化酶的最適溫度較原酶高，對熱的穩(wěn)定性也較原酶高。

平行取0.1 g固定化酶、0.1 g改性固定化酶和0.5 mL 1 g/L 的原酶各6份，分別在不同溫度（30～80 ℃）條件下測定酶活性。如圖6所示，未改性固化酶的最適溫度為40 ℃，之后隨著溫度升高，曲線趨勢較陡峭，酶的活性降低；當(dāng)殼聚糖被改性后，使得酶的最適溫度有所提升，改性固化酶活性的最適溫度在55 ℃左右，相比未改性固化酶，改性固化酶對熱的穩(wěn)定性有所提高。

2.7改性殼聚糖、未改性殼聚糖固定化酶的穩(wěn)定性

隨著時間的推移，殼聚糖固化酶的穩(wěn)定性由高變低，在 12～24 h固化酶的穩(wěn)定性普遍較好，相比未改性固化酶，改性殼聚糖固化酶有更好的穩(wěn)定性（圖7）。

3討論

大多數(shù)試驗(yàn)中均采用殼聚糖作吸附劑、戊二醛為交聯(lián)劑固定化酶[2]，但采用化學(xué)方法改性殼聚糖固定化纖維素酶，卻沒有相關(guān)說明。通過試驗(yàn)改性殼聚糖，殼聚糖作為載體的性能得到了提高。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)交聯(lián)劑濃度為4%時，對改性固定化酶活性影響最大；改性殼聚糖固定化酶的最適pH值為4.3，未改性殼聚糖固定化酶的最適pH值為3.8；采用改性殼聚糖為載體的纖維素固化酶的米氏常數(shù)為3.7×10-3 g/L，未改性殼聚糖為載體的纖維素固化酶的米氏常數(shù)為7.2×10-3 g/L，將纖維素酶用改性殼聚糖固定后，改性固化酶最適溫度在55 ℃左右，未

改性固化酶最適溫度為40 ℃，通過試驗(yàn)對比改性固定化酶與未改性固定化酶發(fā)現(xiàn)，改性固定化酶熱穩(wěn)定性與貯藏穩(wěn)定性更高。

殼聚糖與甲殼素作為自然界唯一的堿性多糖，來源廣泛，更簡單制備，對于其利用開發(fā)，對環(huán)境保護(hù)和資源開發(fā)有著一定的作用[9-13]。通過研究發(fā)現(xiàn)，將殼聚糖通過化學(xué)方法改性處理后，殼聚糖的分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了變化，性質(zhì)也跟改性前大不相同，在戊二醛濃度對固定化酶活性影響的試驗(yàn)中，改性殼聚糖固定化酶的最適pH值高于未改性殼聚糖，固定化酶的活性也比未改性殼聚糖固定化酶的略高，在對溫度的研究中，改性固定化酶比未改性固化酶的耐受溫度更高，穩(wěn)定性也更強(qiáng)。酶的活性容易受環(huán)境條件的影響，通過固定化，正好可以將纖維素酶的活性得以保留。

參考文獻(xiàn)：

[1]武娜娜. 殼聚糖改性吸附劑的制備及其在重金屬污染的污水和土壤處理中的應(yīng)用[D]. 廣州：華南理工大學(xué)，2014.

[2]農(nóng)向，胥成浩，伍紅. 交聯(lián)改性前后殼聚糖的纖維素酶固定效率研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（2）：424-425.

[3]Jones P O，Vasudevan P T. Cellulose hydrolysis by immobilized Trichoderma reesei cellulase[J]. Biotechnology Letters，2010，32（1）：103-106.

[4]Sohel D，Aparna S，Nath G M. A multipurpose immobilized biocatalyst with pectinase，xylanase and cellulase activities[J]. Chemistry Central Journal，2007，1（1）：1-5.

[5]農(nóng)向. 瑞氏木霉QM9414產(chǎn)纖維素酶的研究[D]. 成都：西南民族大學(xué)，2006.

[6]Panagiotou G，Olsson L. Effect of compounds released during pretreatment of wheat straw on microbial growth and enzymatic hydrolysis rates[J]. Biotechnology & Bioengineering，2007，96（2）：250-258.

[7]Mosier N，Wyman C，Dale B，et al. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass[J]. Bioresource Technology，2005，96（6）：673-686.

[8]張強(qiáng). 用殼聚糖固定化纖維素酶的研究[D]. 西安：陜西科技大學(xué)，2005.

[9]高培基. 纖維素酶降解機(jī)制及纖維素酶分子結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J]. 自然科學(xué)進(jìn)展，2003，13（1）：21-29.

[10]楊永彬，黃諺諺，林躍鑫. 纖維素酶的結(jié)構(gòu)及分子多樣性[J]. 生命的化學(xué)，2004，24（3）：21.

[11]Saville B A，Khavkine M，Seetharam G，et al. Characterization and performance of immobilized amylase and cellulase[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2004，116（1）：251-259.

[12]Zhang J，Yan H，Yang T，et al. Removal of dicofol from water by immobilized cellulase and its reaction kinetics[J]. Journal of Environmental Management，2011，92（1）：53-58.

[13]Zhang Y H，Ding S Y，Mielenz J R，et al. Fractionating recalcitrant lignocellulose at modest reaction conditions[J]. Biotechnology & Bioengineering，2007，97（2）：214-223.