趙立娜，陳紫紅，陳 濠，花朋朋，劉 斌,,*

（1.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

響應(yīng)面法優(yōu)化菌草靈芝多肽-硒螯合物的制備工藝

趙立娜1，陳紫紅2，陳 濠2，花朋朋2，劉 斌1,2,*

（1.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化菌草靈芝多肽-硒螯合物的制備工藝，以螯合物中硒含量為指標(biāo)，考察亞硒酸鈉溶液與多肽溶液體積比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和pH值對螯合反應(yīng)的影響，同時(shí)建立螯合物制備工藝的二次項(xiàng)數(shù)學(xué)模型并驗(yàn)證其可靠性，并利用紅外光譜法對菌草靈芝多肽-硒螯合物進(jìn)行表征。結(jié)果表明：影響菌草靈芝多肽與硒離子螯合的因素主次順序?yàn)閜H值＞反應(yīng)溫度＞體積比＞反應(yīng)時(shí)間，最佳的螯合工藝條件為反應(yīng)時(shí)間60 min、反應(yīng)溫度75 ℃、pH 9、亞硒酸鈉溶液與多肽溶液體積比1∶2，最佳制備工藝條件下，螯合物中硒含量為（2 985.89±10.59）μg/g。采用紅外光譜法對螯合物進(jìn)行表征，表明所得物質(zhì)為菌草靈芝多肽與硒的螯合物。本研究為合成有機(jī)硒化合物提供了一種新的原料，也為菌草靈芝的開發(fā)利用提供了一個(gè)新的思路。

菌草靈芝多肽；螯合物；響應(yīng)面法；菌草靈芝多肽-硒螯合物

靈芝屬（Ganoderma）真菌隸屬于多孔菌科（Polyporaceae）藥食兼用菌，全世界共有108 種[1-2]。菌草靈芝是用菌草代替木屑栽培出來的，其藥用價(jià)值比單純用木屑栽培出的靈芝要高得多，其多肽所含的必需氨基酸豐富，營養(yǎng)價(jià)值高，易于被人體吸收，同時(shí)菌草靈芝多肽具有降血脂、降血壓、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤等功效[3-5]。硒是維持生物體機(jī)能包括生長、發(fā)育、繁衍等不可或缺的一類物質(zhì)，雖然人體對硒的需求量極少，但是對生物體的生理健康和有關(guān)生理疾病的預(yù)防都與之密不可分。人體缺硒能造成體內(nèi)重要器官的功能失調(diào)，還會(huì)使得糖尿病、腫瘤、心血管疾病、白內(nèi)障、克山病等疾病的發(fā)病率提高[6-8]。由于人工合成的有機(jī)硒化合物的生物安全性明顯高于人工合成或天然的無機(jī)硒化物，甚至有些功能活性優(yōu)于無機(jī)硒[9]。因此，具有較高生物活性和較低毒副作用的有機(jī)硒化合物具有更廣闊的發(fā)展空間。

目前國內(nèi)外關(guān)于各種肽源與Fe、Zn、Ca等礦物質(zhì)離子螯合制備礦物質(zhì)螯合物的研究較多[10-12]，而以菌草靈芝為原料制備多肽-硒螯合物的研究鮮有報(bào)道。本研究利用菌草靈芝蛋白水解后的菌草靈芝多肽與硒螯合，優(yōu)化菌草靈芝多肽硒螯合物的工藝條件，制備菌草靈芝多肽-硒螯合物，可充分發(fā)揮多肽和礦質(zhì)元素對人體的雙重營養(yǎng)功能特性，為菌草靈芝開發(fā)和應(yīng)用提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌草靈芝 江西井岡山井祥菌草生態(tài)科技股份有限公司。

復(fù)合蛋白酶NS37119 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；亞硒酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉等所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；KDC-40低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；J-25I型高速離心機(jī) 美國Beckman公司；循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FE20型精密pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FD-3冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌草靈芝多肽的制備

菌草靈芝→粉碎→蒸餾水溶解（料液比1∶50）→調(diào)pH 11.0→60 ℃水浴1.5 h→6 層紗布過濾→取上清液→抽濾→調(diào)pH 2.5→4 500 r/min離心→ 沉淀冷凍干燥→靈芝蛋白→配成底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%→調(diào)pH 10.0→復(fù)合蛋白酶酶解（溫度50 ℃、酶/底物6 000 U/g）→50 ℃水浴1 h→沸水浴10 min滅酶→4 500 r/min離心10 min→上清液（菌草靈芝多肽溶液）

1.3.2 菌草靈芝肽-硒螯合物的制備

取一定量靈芝多肽溶液（取3 次平行），加入一定體積比例的0.5 mol/L的亞硒酸鈉溶液，充分?jǐn)嚢瑁齪H值調(diào)節(jié)到一定值后，將其放置于一定溫度的水浴搖床中充分反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)后置于室溫冷卻，在4 500 r/min、10 min的條件下離心取上清液，加入5 倍體積的95%乙醇溶液，靜置沉淀12 h，4500 r/min、10 min離心取沉淀，用無水乙醇對沉淀物洗滌數(shù)次，將其置于烘箱中進(jìn)行低溫干燥處理使無水乙醇揮發(fā)，后進(jìn)行凍干獲得多肽-硒螯合物粉末。

1.3.3 螯合條件單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 體積比（亞硒酸鈉溶液-多肽溶液）對螯合物中的硒含量的影響

體積比分別為1∶6、1∶3、1∶2、2∶3、5∶6，取菌草靈芝多肽溶液2 mL，反應(yīng)溫度80 ℃，pH 8.0，反應(yīng)時(shí)間120 min。

1.3.3.2 反應(yīng)溫度對螯合物中硒含量的影響

反應(yīng)溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃條件下，取菌草靈芝多肽溶液2 mL，亞硒酸鈉和多肽溶液體積比為1∶2，pH 8.0，反應(yīng)時(shí)間120 min。

1.3.3.3 反應(yīng)時(shí)間對螯合物中硒含量的影響

反應(yīng)時(shí)間分別取10、20、30、60、90、120 min，取菌草靈芝多肽溶液2 mL，亞硒酸鈉和多肽溶液體積比為1∶2，pH 8.0，反應(yīng)溫度60 ℃。

1.3.3.4 pH值對螯合物中硒含量的影響

pH值分別取4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，取菌草靈芝多肽溶液2 mL，亞硒酸鈉和多肽溶液體積比為1∶2，反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時(shí)間60 min。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以硒含量為指標(biāo)，對pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和體積比這4 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，因素與水平設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their levels used in response surface design

1.3.5 硒含量的測定

采用3,3’-二氨基聯(lián)苯胺比色法[13]測定硒含量，計(jì)算如下式所示：

式中：p為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得相當(dāng)于硒的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為甲苯萃取所得的樣品體積/mL；m為樣品的質(zhì)量/g；N為用于測定的樣品體積占總定容后樣品的體積分?jǐn)?shù)/%。

1.3.6 紅外光譜測定

菌草靈芝多肽與菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜圖的測定采用KBr壓片法[14]。取固體樣品1 mg和干燥后的KBr 100 mg，放入瑪瑙研缽中混合研磨，研磨至粒度在2.5～2.0 μm以下；裝入壓片裝置中，加壓至20 MPa，維持1～2 min；取出壓片，呈半透明狀，利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 亞硒酸鈉與多肽溶液體積比對螯合物中硒含量的影響

圖1 體積比對硒含量的影響Fig. 1 Effect of the ratio of sodium selenite to peptides on selenium content

由圖1可知，當(dāng)亞硒酸鈉溶液與多肽溶液體積比為1∶2時(shí)，硒含量達(dá)到最高值，繼續(xù)添加亞硒酸鈉溶液，螯合物中的硒含量逐漸趨于平衡。由此可見，亞硒酸鈉溶液與菌草靈芝多肽溶液體積比對螯合物中硒含量影響較大，當(dāng)亞硒酸鈉溶液的添加量較小時(shí)，螯合物的硒含量較低，可能是因?yàn)榇藭r(shí)的硒離子含量較少，多肽過量，使得部分多肽無法與硒離子形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。最終選擇亞硒酸鈉溶液與多肽溶液體積比1∶2。

2.1.2 反應(yīng)溫度對螯合物中硒含量的影響

圖2 反應(yīng)溫度對硒含量的影響Fig. 2 Effect of reaction temperature on selenium content

由圖2可知，溫度對螯合反應(yīng)有一定的影響，螯合溫度到達(dá)60 ℃時(shí)硒含量最高，再繼續(xù)升高溫度硒含量略微降低。此結(jié)果與張曉霞[15]、毛學(xué)英[16]等的結(jié)論類似，溫度過高可能會(huì)使氨基酸或者小肽發(fā)生羰氨反應(yīng)，與硒離子形成競爭，導(dǎo)致螯合能力降低，溫度過低會(huì)使螯合反應(yīng)速率變慢[17]。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對螯合物中硒含量的影響

圖3 反應(yīng)時(shí)間對硒含量的影響Fig. 3 Effect of reaction time on selenium content

由圖3可知，反應(yīng)時(shí)間為10～60 min時(shí)，螯合物中的硒含量隨反應(yīng)時(shí)間的延長而快速增高，當(dāng)達(dá)至60 min時(shí)螯合物中硒含量達(dá)到最高。但是，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間再延長時(shí)，硒含量卻有略微下降，之后趨于穩(wěn)定。此結(jié)果與馬利華[18]和金文剛[19]等研究結(jié)果一致，螯合時(shí)間過長反而不利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行，易導(dǎo)致螯合物的結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，阻礙了螯合反應(yīng)的進(jìn)行，從而使得硒螯合能力有所降低。

2.1.4 pH值對螯合物中硒含量的影響

圖4 pH值對硒含量的影響Fig. 4 Effect of pH on selenium content

由圖4可知，反應(yīng)在酸性條件下進(jìn)行時(shí)，螯合物中的硒含量較低。這可能是由于H+與硒離子競爭供電子基團(tuán)[20]，阻礙了菌草靈芝多肽-硒螯合物的生成。當(dāng)pH值在4.0～9.0之間時(shí)，隨著pH值的不斷升高，硒螯合能力快速提升，在pH 9.0時(shí)硒含量達(dá)到最高，但當(dāng)pH值超過9.0后硒含量反而下降，可能是因?yàn)樵趶?qiáng)堿條件下發(fā)生了一系列的副反應(yīng)，導(dǎo)致硒含量降低[21]。

2.2 螯合條件響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

如表2所示，以菌草靈芝多肽-硒螯合物的硒含量為響應(yīng)值，采用Design-Expert回歸分析軟件分析表2中29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值，經(jīng)軟件綜合分析后，各試驗(yàn)因素對菌草靈芝多肽-硒螯合物的硒含量的影響可采用如下回歸方程表示：

硒含量/（μg/g）=2 487.84+419.73A+531.81B+ 205.44C+230.46D+193.87AB-205.60AC-62.59AD+ 385.68BC+43.83BD-104.99CD-262.45A2-481.08B2-222.15C2-438.21D2

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic response surface model

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。對菌草靈芝多肽-硒螯合物的硒含量而言，其因變量和全體自變量之間存在顯著的線性關(guān)系，R2=0.930 3，說明該方程是高度顯著的，其中響應(yīng)值的改變有93.03%源自于所選變量，即體積比、pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，因此該回歸方程的擬合性較好，所建模型是可行的。由表3可知，A、B、C、D、BC、A2、B2、C2、D2項(xiàng)都對響應(yīng)值有顯著的影響，其影響強(qiáng)弱的排序?yàn)椋簆H值＞反應(yīng)溫度＞體積比＞反應(yīng)時(shí)間。通過對該回歸方程中的各項(xiàng)方差進(jìn)行分析得出以下結(jié)論：從一次項(xiàng)角度可以看出pH值和反應(yīng)溫度是影響菌草靈芝多肽-硒螯合物硒含量的主要因素；對于二次項(xiàng)除BC外都是由單因素中的顯著因素變成不顯著因素，進(jìn)而表明了各試驗(yàn)因素與該響應(yīng)值之間的影響是由于其復(fù)雜的線性關(guān)系。因此，可以利用該回歸方程確定最佳螯合工藝條件是可行的。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析及對菌草靈芝多肽硒-螯合物制備的優(yōu)化

通過Design-Expert軟件綜合分析得出所需的回歸方程，讓各因素保持不變，只對回歸模型進(jìn)行降維處理，從而考察各因素間的交互作用對菌草靈芝多肽-硒螯合物硒含量產(chǎn)生的影響。通過對回歸分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理，作出響應(yīng)面和等高線圖，如圖5所示。響應(yīng)值出現(xiàn)最大值，各參數(shù)間的等高線呈橢圓形，具有顯著的相互作用關(guān)系，并且通過響應(yīng)面圖能夠觀察出最高點(diǎn)[22-23]。說明pH值和反應(yīng)時(shí)間之間存在著顯著的相互作用。

圖5 反應(yīng)時(shí)間和pH值交互作用對硒含量影響的響應(yīng)面圖Fig. 5 Response surface plot showing the effect of reaction time and pH of selenium content

利用Design-Expert軟件由所建的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得出菌草靈芝多肽-硒螯合物的硒含量最高參數(shù)條件為：反應(yīng)時(shí)間58.62 min、反應(yīng)溫度76.78 ℃、pH 9、體積比3.15∶6。此優(yōu)化工藝下硒含量的預(yù)測值為3 075.29 μg/g，為適合實(shí)驗(yàn)操作，調(diào)整條件為反應(yīng)時(shí)間60 min、反應(yīng)溫度75 ℃、pH 9、體積比1∶2。對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證得硒含量為（2 985.89±10.59）μg/g，該回歸方程可應(yīng)用于實(shí)踐。

2.3 菌草靈芝多肽和菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜分析

圖6 菌草靈芝多肽和菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜圖Fig. 6 IR spectra of bioactive peptides from Ganodorma lucidum and their selenium chelate

由于菌草靈芝多肽鏈中含有氨基和羧基，所以紅外光譜圖中的吸收峰必然會(huì)隨著氨基的伸縮振動(dòng)、變角振動(dòng)和羧基的伸縮振動(dòng)等的變化而發(fā)生改變，當(dāng)硒離子與多肽發(fā)生一系列的反應(yīng)時(shí)，吸收峰的峰位也必然會(huì)隨之發(fā)生變化。圖6是菌草靈芝多肽和菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜圖，可以明顯看出，菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜曲線不同于菌草靈芝多肽。對菌草靈芝多肽的紅外光譜圖進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，在2 924 cm-1和2 852 cm-1處的吸收為C—H伸縮振動(dòng)引起的特征吸收峰[24]。而1 649 cm-1和1 564 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰屬于酰胺Ⅱ帶，是由N—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)和C—N伸縮振動(dòng)所引起的[25]。1 410 cm-1屬于菌草靈芝多肽氨基酸殘基的羧基[26-27]，560 cm-1是由C＝O的面外彎曲引起。與菌草靈芝多肽的紅外光譜圖相比，當(dāng)多肽與硒離子發(fā)生反應(yīng)后，整個(gè)波形發(fā)生了變化：菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜圖在2 852 cm-1處的N—H伸縮振動(dòng)峰消失了，推測應(yīng)是誘導(dǎo)效應(yīng)或者是偶極場效應(yīng)導(dǎo)致其上面的電子云密度增大，力常數(shù)增大，頻率升高[28]，而在低波數(shù)1 075 cm-1處吸收加強(qiáng)也證實(shí)了這一點(diǎn)，有可能是由于Se—N發(fā)生配位而引起伸縮振動(dòng)；與菌草靈芝多肽相比，多肽-硒螯合物在875 cm-1處C—H的特征吸收峰發(fā)生了紅移，是由C—H面外彎曲振動(dòng)引起的，說明其參與了配位反應(yīng)，并且在560 cm-1出現(xiàn)C＝O的反對稱振動(dòng)吸收峰，推測應(yīng)是硒離子與多肽上的羧基進(jìn)行了螯合反應(yīng)，這與Palika[29]、Zhao Lina[30]等的結(jié)論類似。通過對菌草靈芝多肽和菌草靈芝多肽-硒螯合物的紅外光譜對比可以看出，菌草靈芝多肽的氨基和羧基均參與了硒離子的配位，說明菌草靈芝多肽與硒螯合后生成了新的物質(zhì)。

3 結(jié) 論

利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化菌草靈芝多肽與硒螯合的最佳工藝條件為反應(yīng)時(shí)間60 min、反應(yīng)溫度75 ℃、pH 9、亞硒酸鈉溶液與多肽溶液體積比1∶2，在此條件下制備的螯合物中硒含量為（2 985.89±10.59）μg/g，與響應(yīng)面模型預(yù)測值3 075.29 μg/g無顯著性差異，該模型可很好地應(yīng)用于螯合工藝條件的優(yōu)化。由紅外光譜分析可知，菌草靈芝多肽和硒離子發(fā)生螯合反應(yīng)，生成了一種新型物質(zhì)，即菌草靈芝多肽-硒螯合物，為合成有機(jī)硒化合物提供了一種新的原料，同時(shí)也為菌草靈芝的開發(fā)利用提供了一個(gè)新的思路。

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Optimization of Chelation of Juncao Ganoderma lucidum Peptides with Selenium by Response Surface Methodology

ZHAO Lina1, CHEN Zihong2, CHEN Hao2, HUA Pengpeng2, LIU Bin1,2,*
(1. China National Engineering Research Center of Juncao Technology, Fuzhou 350002, China; 2. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

The purpose of the present study was to optimize the preparation of Juncao Ganoderma lucidum peptideselenium chelate using response surface methodology. The independent variables were pH, the ratio of sodium selenite solution to protein hydrolysate (V/V), reaction time, and temperature. The response was selenium content. A quadratic polynomial regression model was established and its reliability was validated. The chelate was characterized by infrared (IR) spectroscopy. The results showed that in decreasing order significance, pH, reaction temperature, the ratio of sodium selenite solution to protein hydrolysate and reaction time affected the selenium content of chelates, and the optimal values of these factors were 9, 75 ℃, 1:2 and 60 min, respectively. The selenium content of the obtained product was (2 985.89±10.59) μg/g. IR spectral analysis confirmed the chelation reaction between Juncao Ganoderma lucidum peptides and selenium ions and the generation of a new chelate. This study can provide a new approach for the development and utilization of Juncao Ganoderma lucidum.

Juncao Ganoderma lucidum peptide; chelation; response surface methodology; peptide-selenium chelate

10.7506/spkx1002-6630-201714029

TS201.2

A

1002-6630（2017）14-0187-06

趙立娜, 陳紫紅, 陳濠, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化菌草靈芝多肽-硒螯合物的制備工藝[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 187-192.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714029. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Lina, CHEN Zihong, CHEN Hao, et al. Optimization of celation of Juncao Ganoderma lucidum peptides with selenium by response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(14): 187-192. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714029. http://www.spkx.net.cn

2016-10-08

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31501432）；福建省科技重大專項(xiàng)（2014NZ2002-1）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAD15B01）；福建農(nóng)林大學(xué)校杰出青年項(xiàng)目（xjq201608）；福建省科學(xué)技術(shù)廳高校產(chǎn)學(xué)合作項(xiàng)目（2017N5003）

趙立娜（1984—），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zln20002000@163.com

*通信作者：劉斌（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：liubin618@hotmail.com