熊東彥，李志遠(yuǎn)，黃 丹，慕 昕，劉 楨

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

酪氨酸酶結(jié)構(gòu)功能分析及其抑制物的設(shè)計(jì)

熊東彥，李志遠(yuǎn)，黃 丹，慕 昕，劉 楨

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

黑色素生成與酪氨酸酶相關(guān)。在保證健康的前提下，為了適當(dāng)抑制黑色素生成，美白皮膚，我們使用生物信息學(xué)方法研究了酪氨酸酶的性質(zhì)，并針對(duì)其性質(zhì)設(shè)計(jì)了抑制分子。利用遺傳算法得到了不同物種的酪氨酸酶系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)東非狒狒、獼猴等的酪氨酸酶與人類的具有較高的相似度。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)到人類酪氨酸酶與巨大芽孢桿菌酪氨酸酶在空間結(jié)構(gòu)上具有最大相似度。N端與C端分別有1個(gè)β-折疊，N端與C端之間有多個(gè)α-螺旋。由此發(fā)現(xiàn)，Zn2+和Cl-能夠有效降低酪氨酸酶的活性。黑色素合成受信號(hào)通路調(diào)控，JNK通路可以通過(guò)阻止cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白來(lái)抑制酪氨酸酶的合成。雌激素為黑色素合成的“第一信使”，其作用通過(guò)ER途徑介導(dǎo)，由此尋找到抑制其活性的分子，比如?？颂婺帷⑴撂婺?。

酪氨酸酶；生物信息學(xué)；抑制分子；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

黑色素是一種生物色素，能保護(hù)生物體免受紫外線傷害，過(guò)多的黑色素沉積易引發(fā)黑色素瘤。黑色素合成受多個(gè)途徑調(diào)控，其中，由酪氨酸酶參與的合成途徑是黑色素合成的重要途徑之一。酪氨酸酶是一種氧化還原酶，廣泛存在于各生物中，與生物體合成色素直接相關(guān)。目前，酪氨酸酶在醫(yī)療美容方面的應(yīng)用發(fā)展迅速。隨著生活水平的提高，人們對(duì)美的享受也越來(lái)越講究，美白劑的開(kāi)發(fā)隨之成為化妝品行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

目前，市場(chǎng)上的美白劑主要有熊果苷、曲酸等，文獻(xiàn)表明這些物質(zhì)均具有較好的美白功效，但這些物質(zhì)具有一定的皮膚刺激性，或穩(wěn)定性較差。如何實(shí)現(xiàn)“安全、健康美白”已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。在本次研究中，我們利用生物信息學(xué)分析了酪氨酸酶合成與代謝通路，提出了相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，設(shè)計(jì)出了能夠改善人類皮膚健康問(wèn)題的、安全無(wú)副作用的絡(luò)氨酸酶抑制分子。這將對(duì)美白產(chǎn)品的研制及色素性皮膚損傷治療具有重要指導(dǎo)意義。

圖1 人類酪氨酸酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

1 進(jìn)化分析

在NCBI的UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到人類酪氨酸酶的氨基酸序列導(dǎo)入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用Multi-BLASTp進(jìn)行多序列比對(duì)，下載包括人類在內(nèi)的前25名物種的酪氨酸酶氨基酸序列的fasta文件，利用Mega7設(shè)置大于70%相似度系數(shù)，選擇NJ算法，計(jì)算得到了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖1所示。

分析進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，與人類酪氨酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有較高相似度的其他物種的酪氨酸酶分別為東非狒狒、大鼠、獼猴和小鼠的酪氨酸酶。為了進(jìn)一步挖掘可能具有相似功能的其他物種的酪氨酸酶，我們進(jìn)行了高級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)構(gòu)分析

由于該酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)暫時(shí)不清楚，所以，我們采用生物信息學(xué)方法用一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)高級(jí)結(jié)構(gòu)。我們將氨基酸序列導(dǎo)入PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中，在Search欄目中使用Sequence Search方法，按照相似度排名得到以下結(jié)果，如圖2所示。

圖2中從上到下、從左至右的PDB ID為3NPY、3NQ1、3NTM、3NM8、3NQ0、3NTM，這些酪氨酸酶都提自巨大芽孢桿菌，所以根據(jù)數(shù)據(jù)篩選發(fā)現(xiàn)，東非狒狒、大鼠、獼猴、小鼠和巨大芽孢桿菌這5個(gè)物種的酪氨酸酶可能與人類的酪氨酸酶具有非常相似的結(jié)構(gòu)與功能。我們提出了一種研究思路，可以分別尋找這些物種的酪氨酸酶的抑制分子。

對(duì)于高級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)抑制分子，我們想到了通過(guò)破壞結(jié)構(gòu)域的方式進(jìn)行研究，選擇了相似度排名前三的3NPY、3NQ1、3NTM作為分析對(duì)象，具體如圖3所示。

圖2 人類酪氨酸酶高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圖3 巨大芽孢桿菌酪氨酸酶高級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)

圖3中我們可以看出，酪氨酸酶的N端與C端分別有一個(gè)β-折疊（Secsine部分的黃色元件），N端與C端之間有數(shù)個(gè)α-螺旋，這樣的結(jié)構(gòu)有利于酪氨酸酶形成活性中心，我們分析Cu離子位于這個(gè)活性中心處。Zn離子能夠通過(guò)不與底物結(jié)合的方式抑制酶活性。

3 黑色素合成相關(guān)通路的研究

黑素細(xì)胞是人體表皮基底層中產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞。哺乳動(dòng)物黑色素的合成在不同生長(zhǎng)階段均受到調(diào)控。主要是通過(guò)有關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，包括TYR、TRP-1、TRP-2這些信號(hào)通路的起始由各種激素誘發(fā)。有3條最重要的抑制黑色素形成的信號(hào)通路：cAMP信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路以及ERK信號(hào)通路。

α-促黑色素激素（α-MSH）是來(lái)源于阿片-促黑素細(xì)胞皮質(zhì)激素元（POMC）的一種多肽，通過(guò)cAMP依賴的信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)黑色素的合成。當(dāng)α-MSH與黑色素細(xì)胞膜上的腎上腺皮質(zhì)受體結(jié)合后，通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體會(huì)激活腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生cAMP，其隨后激活PKA，后者通過(guò)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白的磷酸化，從而激活MITF基因的表達(dá)，最后，MITF有效激活與黑色素形成相關(guān)的蛋白的表達(dá)，最終促進(jìn)黑色素的形成。Wnt信號(hào)通路中Wnts是一類富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白，在胚胎發(fā)育中起重要作用。該通路起始于Wnt與卷曲蛋白的結(jié)合，通過(guò)靶向調(diào)控MITF基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)黑色素的形成。在缺乏Wnt信號(hào)通路的細(xì)胞中，β鏈蛋白是由糖原合成酶-3磷酸化，而磷酸化的β鏈蛋白由泛素連接符合體識(shí)別，通過(guò)泛素依賴途徑使β鏈蛋白降解。

4 結(jié)論

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中人類酪氨酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有高相似度的其他物種酪氨酸酶分別為東非狒狒、大鼠、獼猴、小鼠；高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中人類酪氨酸酶與巨大芽孢桿菌的酪氨酸酶高級(jí)結(jié)構(gòu)相似，所以，可以分別從一級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)分別研究對(duì)應(yīng)的低級(jí)物質(zhì)酪氨酸酶性質(zhì)，設(shè)計(jì)初步抑制分子最后使用到人類身上。酪氨酸酶的N端與C端分別有1個(gè)β-折疊，N端與C端之間有數(shù)個(gè)α-螺旋，這樣的結(jié)構(gòu)有利于酪氨酸酶形成活性中心，Cu離子位于這個(gè)活性中心處，可以利用適當(dāng)?shù)姆忾]劑封閉銅離子；Zn2+能阻止蛋白質(zhì)活性但不抑制底物結(jié)合。MAPk通路是細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞生理反應(yīng)的共同途徑，JNK通路則可以通過(guò)降低cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白的結(jié)合來(lái)抑制酪氨酸酶的合成。

［1］陳清西，宋康康.酪氨酸酶的研究進(jìn)展［J］.廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006（05）.

［2］穆燕，李琳，董方圓，等.對(duì)甲氧基肉桂酸對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012（12）.

［3］鄧觀杰，劉有停，凌沛學(xué).丹皮復(fù)方提取液美白功效研究［J］.藥學(xué)研究，2016（05）.

〔編輯：張思楠〕

S917.4

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2017.13.118

2095-6835（2017）13-0118-02

熊東彥，就讀于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，研究方向?yàn)樯镄畔W(xué)。