曾承露，李鋒*，黃德娜

（黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州都勻558000）

紡錘形賴氨酸芽孢桿菌P-3產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

曾承露，李鋒*，黃德娜

（黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州都勻558000）

利用響應(yīng)面法對紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）P-3產(chǎn)胞外多糖（EPS）發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。通過單因素試驗篩選到顯著因素，對顯著因素進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計優(yōu)化，建立EPS產(chǎn)量與各因素的多元回歸方程；最終確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量3%、初始pH 7、發(fā)酵溫度34℃、發(fā)酵時間32 h和轉(zhuǎn)速161 r/min。在此優(yōu)化條件下，EPS平均產(chǎn)量為2.92 g/L。關(guān)鍵詞：紡錘形賴氨酸芽孢桿菌；胞外多糖；響應(yīng)面法；發(fā)酵工藝

微生物胞外多糖（exocellular polysaccharides，EPS）是微生物在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞外的粘液或者莢膜多糖[1-3]。近年來因其具有多種生物活性[4-6]和生理功能[7-8]，以及生產(chǎn)成本低受到普遍關(guān)注。微生物產(chǎn)胞外多糖的研究熱點主要集中在篩選優(yōu)良安全的菌種及優(yōu)化發(fā)酵工藝提高多糖產(chǎn)率兩方面[9-13]。基于多糖應(yīng)用安全方面考慮，從可食用食品中篩選產(chǎn)多糖微生物倍受研究者青睞，如于靜等[14]從新疆酸馬奶中分離到一株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌RB2，其胞外多糖產(chǎn)率為511 μg/mL。JOSHI S R等[15]從印度的一種部落飲料中分離出乳酸明串珠菌（Leuconostoclactis），在含有蔗糖MRS培養(yǎng)基和釕紅牛奶瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測得其EPS產(chǎn)量為340.82 mg/L，在之后對影響產(chǎn)量的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在28℃、pH值為6.5、以蔗糖為碳源的條件下，其EPS產(chǎn)量顯著提高。

我國西南地區(qū)具有獨特的自然環(huán)境和氣候特點，當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族利用自然環(huán)境中的微生物，采用傳統(tǒng)方法制作蔬菜發(fā)酵食品，經(jīng)過長期自然馴化，這些食品中保留了大量優(yōu)勢菌種，為進(jìn)一步開發(fā)利用提供寶貴資源。本實驗室從獨山鹽酸菜中分離得到一株能夠分泌多糖的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）P-3，為進(jìn)一步深入研究和促進(jìn)工業(yè)生產(chǎn)開發(fā)，首先通過單因素試驗確定對EPS產(chǎn)量影響顯著因素及水平，再運(yùn)用響應(yīng)面分析方法（response surface method，RSM）對菌株P(guān)-3產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高菌株P(guān)-3的胞外多糖產(chǎn)量。目前微生物產(chǎn)胞外多糖量還較低，優(yōu)化產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）P-3由本實驗室篩選自獨山農(nóng)家自制鹽酸菜。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉15 g/L，加蒸餾水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：在以上液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%瓊脂粉。121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：NaNO30.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.5g/L，NaCl10g/L，蔗糖25 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨3 g/L，加蒸餾水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

無水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、NaNO3、K2HPO4、MgSO4、NaCl（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750高溫蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；ZF-C紫外/可見光分光光度計：上海滬西分析儀器公司；5804R小型臺式離心機(jī)：德國Eppendoff公司；APlus730R回轉(zhuǎn)式振蕩恒溫培養(yǎng)箱：美國APlus公司；FE-20KpH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-20型超凈工作臺：蘇州華科凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

取-80℃保存的菌株，解凍后取50 μL菌液接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基的試管中，置于30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中180 r/min活化12 h，取少量菌液涂布于LB平板，待長出單菌落，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件同上），作為發(fā)酵種子液。

1.3.2 粗多糖提取

發(fā)酵液以8 000 r/min離心5 min，取上清液5 mL，加入20 mL無水乙醇沉淀多糖，4℃放置1 h后，8 000 r/min離心10 min，棄上清。所得沉淀用2 mL蒸餾水溶解，制得多糖粗提液[16]。

1.3.3 胞外多糖含量測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法[17]測定發(fā)酵液中粗多糖含量。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取7支15mL具塞試管分別吸取0.1 mg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL分別置于試管中，然后每只試管再用蒸餾水補(bǔ)足1 mL，空白對照取1 mL蒸餾水。依次加入6%苯酚溶液1mL，搖勻，然后迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后，室溫靜置30 min，于波長490 nm處測吸光度值，以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.561 71x-0.0369 33，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算樣品中多糖含量。

1.3.4 發(fā)酵工藝參數(shù)對EPS產(chǎn)量影響的單因素試驗

裝液量為100 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）P-3在接種量2%、溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下培養(yǎng)36 h，測定不同初始pH（5、6、7、8、9）對其EPS產(chǎn)量的影響；在初始pH值為7、溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下培養(yǎng)36 h，測定不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%）對EPS產(chǎn)量的影響；在初始pH值為7、接種量為3%、轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下培養(yǎng)36 h，測定不同發(fā)酵溫度（25℃、30℃、35℃、40℃）對EPS產(chǎn)量的影響；在初始pH值為7、接種量為3%、溫度30℃的條件下培養(yǎng)36 h，測定不同轉(zhuǎn)速（120 r/min、150 r/min、180 r/min、210 r/min）對EPS產(chǎn)量的影響；在初始pH值為7、接種量2%、溫度30℃、轉(zhuǎn)速180r/min的條件下，測定不同發(fā)酵時間（24h、36h、48h、60 h、72 h）對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面設(shè)計試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以EPS產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，選擇對EPS產(chǎn)量影響較顯著的因素發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）和轉(zhuǎn)速（C）進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，設(shè)計3因素3水平試驗方案，因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 初始pH對EPS產(chǎn)量影響

pH值的變化可能會影響菌株細(xì)胞膜形態(tài)的穩(wěn)定性以及營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，進(jìn)而影響了細(xì)菌的生長速率和代謝產(chǎn)物積累[18-19]，不同初始pH對EPS產(chǎn)量影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株P(guān)-3在初始pH值為5～7時，EPS產(chǎn)量隨著初始pH值的增加而增加；菌株P(guān)-3在初始pH值為7時，EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值1.69 g/L；菌株P(guān)-3在初始pH值為7～9時，EPS產(chǎn)量隨著初始pH值的增加而減少；培養(yǎng)基過酸或者過堿都會導(dǎo)致細(xì)菌代謝能力變差。在初始pH 5～9范圍內(nèi)該菌都可以產(chǎn)多糖，并且產(chǎn)量差異不顯著。因此選擇培養(yǎng)基最適初始pH值為7。

圖1 初始pH對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of initial pH on exopolysaccharides yield

2.1.2 接種量對EPS產(chǎn)量影響

接種量直接影響發(fā)酵液中最初活菌數(shù)，菌體數(shù)的多少直接影響菌體的生長代謝，不同接種量對EPS產(chǎn)量影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)接種量在1%～3%時，隨著接種量的增加，EPS產(chǎn)量也隨之增大；當(dāng)接種量達(dá)到3%時，EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值1.75 g/L；當(dāng)接種量為3%～5%時，EPS產(chǎn)量開始下降。這可能是由于接種量過大，菌體生長過快，發(fā)酵液中菌體濃度過高，發(fā)酵中后期碳源消耗殆盡而導(dǎo)致合成胞外多糖的前體物質(zhì)減少，從而降低EPS產(chǎn)量；而接種量過小，發(fā)酵液中菌體較少，導(dǎo)致生長延滯期，營養(yǎng)物質(zhì)無法得到有效利用，不利于EPS代謝合成。因此選擇最適接種量為3%。

圖2 接種量對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of inoculum on exopolysaccharides yield

2.1.3 發(fā)酵溫度對EPS產(chǎn)量影響

發(fā)酵溫度直接影響微生物生長繁殖和新陳代謝，微生物產(chǎn)不同代謝產(chǎn)物所需溫度也不盡相同，不同發(fā)酵溫度對EPS產(chǎn)量影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為25～35℃時，隨著發(fā)酵溫度的增加，EPS產(chǎn)量也隨之增大；當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到35℃時，EPS產(chǎn)量達(dá)到2.23 g/L；當(dāng)發(fā)酵溫度高于35℃之后，EPS產(chǎn)量開始下降。由此可以推斷溫度過高或者過低可能會影響參與細(xì)菌代謝過程中酶的活力，從而對菌體代謝產(chǎn)物積累造成影響。因此選擇最佳發(fā)酵溫度為35℃。

圖3 發(fā)酵溫度對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on exopolysaccharides yield

2.1.4 轉(zhuǎn)速對EPS產(chǎn)量影響

菌株P(guān)-3是好氧菌，細(xì)菌生長與繁殖需要一定的氧氣參與其代謝。發(fā)酵液中溶氧量的大小直接與轉(zhuǎn)速有關(guān)，不同轉(zhuǎn)速對EPS產(chǎn)量影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速在120～150 r/min時，隨著轉(zhuǎn)速的增加，EPS產(chǎn)量也隨之增大；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到150 r/min時，EPS產(chǎn)量達(dá)到2.257 g/L；當(dāng)轉(zhuǎn)速＞150 r/min之后，EPS產(chǎn)量開始下降。當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時，EPS產(chǎn)量最高。轉(zhuǎn)速過低時，發(fā)酵液中溶氧量不足影響細(xì)菌代謝，而提高轉(zhuǎn)速后雖有利于菌體生長，但同時養(yǎng)分消耗過快，碳源只作為營養(yǎng)物質(zhì)供菌體繁殖，而導(dǎo)致菌體合成EPS能力降低；且轉(zhuǎn)速過高，對菌體產(chǎn)生機(jī)械性損傷，引起菌體自溶，從而抑制EPS合成[20]。因此選擇最佳轉(zhuǎn)速為150r/min。

圖4 轉(zhuǎn)速對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of rotate speed on exopolysaccharides yield

2.1.5 發(fā)酵時間對EPS產(chǎn)量影響

不同發(fā)酵時間對EPS產(chǎn)量影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵時間在24～36h時，隨著發(fā)酵時間的增加，EPS產(chǎn)量也隨之增大；當(dāng)發(fā)酵時間達(dá)到36 h時，EPS產(chǎn)量達(dá)到2.276 g/L；當(dāng)發(fā)酵時間＞36 h之后，EPS產(chǎn)量開始下降。EPS含量呈逐漸下降趨勢，可能是因為碳源及營養(yǎng)成分減少，無法繼續(xù)提供菌體細(xì)胞生長及EPS分泌，也可能是被細(xì)菌產(chǎn)生相關(guān)酶降解的原因[21]。因此選擇最適發(fā)酵時間為36 h。

圖5 發(fā)酵時間對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on exopolysaccharides yield

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化Lysinibacillus fusiformisP-3發(fā)酵條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對EPS產(chǎn)量影響顯著的3個因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，即以發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）和轉(zhuǎn)速（C）作為自變量，以EPS產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面分析試驗。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken experiments design

利用Desing-Expert V8.0.6軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，建立數(shù)學(xué)模型回歸方程：Y=-37.091+1.387 05A+ 0.327 79B+0.135 71C+7.916 67×10-4AB-2.333 33×10-4AC-8.40278×10-4BC-0.01924A2-2.55903×10-3B2-3.12222×10-4C2

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，該數(shù)學(xué)模型極顯著（P＜0.000 1）；試驗所選取3個試驗因素對EPS產(chǎn)量的影響從大到小依次為B＞A＞C。失擬項P=0.075 2＞0.05，失擬項差異不顯著；決定系數(shù)為R2=0.992 0，表明實測值與預(yù)測值高度相關(guān)，擬合度＞99%。同時，回歸方程的一次項A、B、C對結(jié)果影響均極顯著（P＜0.01）；二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響均極顯著（P＜0.01）；交互項BC對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項AB、AC對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)確定及驗證

發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和轉(zhuǎn)速交互作用對EPS產(chǎn)量影響的響應(yīng)面見圖6。由圖6可以直觀找到最佳工藝參數(shù)，以及對任意兩因素之間交互作用影響EPS產(chǎn)量進(jìn)行分析和評價，并從中確定提取工藝的最佳水平范圍。由圖6可知，在所選的因素水平范圍內(nèi)存在最大值，即響應(yīng)面的最高點。

圖6 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和轉(zhuǎn)速交互作用對胞外多糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,time and rotate speed on exopolysaccharides yield

通過回歸模型預(yù)測，得到最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度34.41℃、發(fā)酵時間32.28 h和轉(zhuǎn)速161.02 r/min，預(yù)測響應(yīng)值（EPS產(chǎn)量）為2.988 g/L。為檢驗回歸方程的可靠性，進(jìn)行驗證試驗；考慮到試驗的可操作性，將發(fā)酵工藝參數(shù)調(diào)整為發(fā)酵溫度34℃、發(fā)酵時間32 h和轉(zhuǎn)速161 r/min，在此條件下進(jìn)行3次平行驗證試驗，測得EPS產(chǎn)量平均值為2.92 g/L，達(dá)到預(yù)測值的97.7%，說明所建立方程模型具有較高準(zhǔn)確性。

通過優(yōu)化發(fā)酵工藝條件使EPS產(chǎn)量高于文獻(xiàn)[16]報道的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌S-1多糖產(chǎn)量（1.5g/L），低于文獻(xiàn)[21]報道的解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量（104.37 g/L）。胞外多糖產(chǎn)量低的原因可是由于蔗糖質(zhì)量濃度不同，培養(yǎng)基成分有明顯差異，并且不同種細(xì)菌之間合成多糖能力存在差異。微生物發(fā)酵的是一個動態(tài)過程，除了與發(fā)酵環(huán)境有關(guān)外，培養(yǎng)基配方也直接影響微生物的代謝產(chǎn)物。因此，需進(jìn)一步研究培養(yǎng)基配方及尋找廉價原料作為碳源，使其具有工業(yè)化應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

首先通過單因素試驗篩選出對EPS產(chǎn)量影響顯著的3個因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化建立二次多項數(shù)學(xué)模型，運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)方法檢驗?zāi)Ｐ惋@著性，探討各因素交互作用對EPS產(chǎn)量影響，最終確定紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）P-3產(chǎn)胞外多糖最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量3%、初始pH 7、發(fā)酵溫度34℃、發(fā)酵時間32 h和轉(zhuǎn)速161 r/min。在此最佳條件下，EPS產(chǎn)量為2.92 g/L。

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Optimization of fermentation technical parameters ofLysinibacillus fusiformisP-3 for exopolysaccharides production

ZENG Chenglu,LI Feng*,HUANG Dena
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Qiannan Normal College for Nationalities,Duyun 558000,China)

The fermentation technical parameters of exopolysaccharides(EPS)-producingLysinibacillus fusiformisP-3 were optimized by response surface methodology.The significant factors were screened and optimized by single factor and Box-Behnken experiments.The multiple regression equation of EPS yield and all the factors was established.Finally,the optimum fermentation technical parameters were determined as followed:inoculum 3%,initial pH 7,fermentation temperature 34℃,time 32 h and rotate speed 161 r/min.Under the optimal conditions,the average yield of EPS was 2.92 g/L.

Lysinibacillus fusiformis;exopolysaccharides;response surface methodology;fermentation technology

TQ920.6

0254-5071（2017）06-0111-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.023

2017-03-13

貴州省教育廳自然科學(xué)研究重點項目（黔教合KY[2014]286）；貴州省科學(xué)技術(shù)聯(lián)合基金項目（黔科合LH字[2014]7418）

曾承露（1986-），女，講師，碩士，研究方向食品微生物。

*通訊作者：李鋒（1982-），男，講師，博士研究生，研究方向微生物代謝機(jī)理。