宋玉芹，于光輝，王建琳，張 燦，張廷榮

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

IGFBP3基因內(nèi)含子2多態(tài)性及其與豬主要生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

宋玉芹，于光輝，王建琳，張 燦，張廷榮*

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（Insulin- like Growth Factor Binding Proteins，IGFBPs）與動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育有著密切的聯(lián)系，為研究IGFBP3的多態(tài)性與豬生長(zhǎng)性狀之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)采用PCR-RFLP方法對(duì)大白豬、杜洛克及長(zhǎng)白豬IGFBP3基因內(nèi)含子2的多態(tài)性進(jìn)行分析，并且研究了IGFBP3不同基因型對(duì)體長(zhǎng)、體高、瘦肉率、活體背膘、肌肉厚度、0～100 kg日增重、30～100 kg日增重及100 kg體重日齡等主要生長(zhǎng)性狀的影響。結(jié)果表明：IGFBP3基因內(nèi)含子2共417 bp，在3個(gè)豬群中有1個(gè)A307G多態(tài)位點(diǎn)與豬的生長(zhǎng)性狀有關(guān)，并且都是AG基因型占優(yōu)勢(shì)，杜洛克與長(zhǎng)白豬在該位點(diǎn)上偏離Hardy-Weinberg平衡（P＜0.010）；3個(gè)品種豬群IGFBP3基因的多態(tài)性信息含量（PIC）均表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.34～0.37）；IGFBP3基因的GG基因型對(duì)大白豬的體高（P=0.068）、瘦肉率（P=0.058）的影響較大，對(duì)杜洛克豬的瘦肉率（P=0.099）、肌肉厚度（P=0.079）的影響較大，對(duì)長(zhǎng)白豬的0～100 kg日增重的影響均接近顯著水平（P=0.08）。GG基因型豬具有體高、瘦肉率高和生長(zhǎng)較快的特點(diǎn)，為以后豬的育種和選種提供參考。

豬；IGFBP3；PCR-RFLP；關(guān)聯(lián)分析

生長(zhǎng)激素（Growth Hormone，GH）主要是通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-like Growth Factor，IGFs）介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)促生長(zhǎng)作用。哺乳動(dòng)物的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（Insulin- like Growth Factor Binding Proteins, IGFBPs）能夠與IGFs結(jié)合成穩(wěn)固的復(fù)合物，延長(zhǎng)IGFs的半衰期，增加IGFs在靶組織中的分布，調(diào)節(jié)IGFs的生物學(xué)功能[1]。IGFBP3不僅能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制癌細(xì)胞，而且能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期， 因?yàn)镮GFBP3本身有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用，與胎盤(pán)的形成以及后期胎兒在子宮內(nèi)的發(fā)育具有極為密切關(guān)系[2]。IGFBP3也與肌肉發(fā)育有關(guān)，兒童骨骼肌中此蛋白的含量高于成年人[3]。豬的IGFBP3基因定位在18q24染色體上，全長(zhǎng)4 532 bp，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼293個(gè)氨基酸[4]。IGFBP3基因存在較多的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，通過(guò)標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析，認(rèn)為部分位點(diǎn)可能對(duì)豬的部分生長(zhǎng)性狀有重要影響[4]。本研究采用PCRRFLP方法對(duì)豬IGFBP3基因內(nèi)含子2的Tas I限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，研究該位點(diǎn)的基因型與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)情況，為該基因結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)群體取自山東某種畜禽有限公司原種豬場(chǎng)，其中有大白豬189頭，杜洛克154頭，長(zhǎng)白豬117 頭。采集耳組織樣品，用常規(guī)的苯酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，稀釋成100 ng/μL備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank已知序列（No: AY422045）設(shè)計(jì)引物，由青島擎科生物工程有限公司合成。上游引物：5'-CCGCGTGGGAAT GGTAACTACA-3'，下游引物：5'-GCGGGAACG GGAGGGAGAG -3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，其中MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，上下游混合引物（50 μmol/L）0.3 μL，Taq 酶（5 U/μL ）0.2 μL，模板DNA 1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，雙蒸水19 μL。循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)和酶切：取4 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇特異性強(qiáng)的產(chǎn)物用于酶切反應(yīng)。

1.3 酶切 酶切時(shí)取8 μL PCR產(chǎn)物加入0.4 μL TAS I 酶和0.9 μL Buffer，65℃恒溫過(guò)夜。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以5～10 V/cm電壓電泳約25 min，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并記錄結(jié)果。

1.4 主要生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 利用GB8467-87瘦肉型種豬性能測(cè)定技術(shù)規(guī)程，獲得試驗(yàn)豬生長(zhǎng)性狀的測(cè)定結(jié)果。主要生長(zhǎng)指標(biāo)有體長(zhǎng)、體高、瘦肉率、活體背膘、肌肉厚度、0～100 kg日增重、30～100 kg日增重及100 kg體重日齡。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

遺傳雜合度（He）為某一群體中一個(gè)特定的基因位點(diǎn)上等位基因雜合的雜合度。計(jì)算群體內(nèi)某一座位的基因雜合度Nei氏公式[5]：

式中，Pi為某一座位第i個(gè)等位基因頻率；n 為該座位等位基因數(shù)。

有效等位基因數(shù)（Ne）反映等位基因間的相互影響，是衡量基因純合度的指標(biāo)。等位基因在群體中分布的越均勻，有效等位基因數(shù)越接近實(shí)際檢測(cè)到的等位基因個(gè)數(shù)。

多態(tài)信息含量（PIC）用于對(duì)標(biāo)記基因多態(tài)性的估計(jì)。利用Bot-stein 公式[6]計(jì)算：

式中，Pi和Pj分別為第i和第j個(gè)等位基因在群體中的頻率，n為等位基因數(shù)。

圖1 TASI酶切417 bp PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2 結(jié) 果

2.1 PCR酶切結(jié)果 如圖1所示，PCR擴(kuò)增的IGFBP3基因的內(nèi)含子2的片段長(zhǎng)度為417 bp，而且經(jīng)限制性內(nèi)切酶TASI 65℃消化后，在檢測(cè)的所有個(gè)體中共有3種基因型，分別被定義為AA基因型（417 bp），AG基因型（417/307/110 bp）和GG基因型（307/110 bp）。

2.2 IGFBP3的基因型與基因頻率 大白豬、杜洛克及長(zhǎng)白豬各品種群體的基因頻率和基因型頻率見(jiàn)表1。3個(gè)豬群中都以IGFBP3基因AG基因型占明顯優(yōu)勢(shì)，占一半以上。經(jīng)Х2適合性檢驗(yàn)表明杜洛克、長(zhǎng)白豬群體在該位點(diǎn)上偏離Hardy-Weinberg平衡。

2.3 不同種群IGFBP3基因雜合度及多態(tài)信息含量由表2可見(jiàn)，大白、杜洛克、長(zhǎng)白3個(gè)品種群體IGFBP3基因均表現(xiàn)為中度多態(tài)，在IGFBP3基因影響的性狀選擇上還有較大的選擇空間。Ne是衡量基因純合度的又一指標(biāo)，Ne越接近實(shí)際檢測(cè)到的等位基因的個(gè)數(shù)，等位基因在群體中分布的越均勻。大白、杜洛克和長(zhǎng)白豬3個(gè)種群中只有杜洛克豬群體的Ne與實(shí)際檢測(cè)到的等位基因數(shù)相差稍大。

表1 IGFBP3基因型頻率、基因頻率分布

表2 IGFBP3基因在3個(gè)種群中的He、Ne和PIC

2.4 IGFBP3不同基因型與主要生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表3可見(jiàn)，3種基因型對(duì)杜洛克、大白、長(zhǎng)白3個(gè)豬種的8個(gè)生長(zhǎng)性狀的影響均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05），但GG型對(duì)大白豬的體高和瘦肉率、杜洛克豬的瘦肉率和肌肉厚度、長(zhǎng)白豬的0～100 kg日增重的影響均接近顯著水平，顯示了GG基因型豬群有體高與瘦肉率較高，生長(zhǎng)較快的特點(diǎn)。

3 討 論

3.1 IGFBP3基因的遺傳效應(yīng)與性狀之間的關(guān)系IGFBP3在組織中的表達(dá)水平與動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，IGFBP3基因mRNA和蛋白在小月齡胎兒中的表達(dá)水平高于適齡胎兒[7]，豬血清中IGFBP3的含量與平均日增重也呈負(fù)相關(guān)[8]。長(zhǎng)白豬與藍(lán)塘豬的雜交F2代資源群IGFBP3基因A2670G位點(diǎn)與豬的胴體和肉質(zhì)性狀的關(guān)系研究表明，IGFBP3與豬的多個(gè)性狀間存在顯著相關(guān)，其中G基因可能是選擇瘦肉率的有利基因，而A基因?qū)x擇肌肉的大理石花紋有利[9]。大白豬IGFBP3基因G3695A位點(diǎn)不同基因型與其生長(zhǎng)速度和背膘厚有關(guān)，其中GG基因型生長(zhǎng)速度顯著提高，而雜合子GA基因型的背膘厚顯著降低[10]。本研究結(jié)果顯示，GG基因型對(duì)大白豬的體高和瘦肉率、杜洛克豬的瘦肉率和肌肉厚度、長(zhǎng)白豬的0～100 kg日增重的影響均接近顯著水平，顯示GG基因型豬群體高與瘦肉率較高，生長(zhǎng)速度較快?？芍狦G基因型對(duì)豬有促進(jìn)生長(zhǎng)、增加瘦肉率的正效應(yīng)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

表3 不同基因型對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響

3.2 3個(gè)豬群IGFBP3基因的多態(tài)性 芬蘭大白豬IGFBP3基因G3695A位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果表明，GC基因型的頻率為0.4950，G等位基因的頻率為0.6955，均為最高[11]。楊士紅等[10]研究中國(guó)大白豬IGFBP3基因G3695A位點(diǎn)多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)GA基因型和A等位基因的頻率最高，分別為0.7127和0.5759。而本研究3個(gè)品種豬群也是雜合基因型AG的基因型頻率最高，都在一半以上，與前人研究結(jié)果一致。但是等位基因A的頻率在大白豬和長(zhǎng)白豬中比等位基因G大，而在杜洛克群體中等位基因G的頻率大于A，這可能由于不同豬群的遺傳背景不同或在育種過(guò)程中選育方向不同造成的。本研究中杜洛克、長(zhǎng)白豬群體在該位點(diǎn)上偏離Hardy-Weinberg平衡，這種現(xiàn)象在不同的群體中經(jīng)常發(fā)生，特別是培育品種體系中由于親本的貢獻(xiàn)不同造成的[12]。

綜上所述，可知IGFBP3基因在大白豬、杜洛克和長(zhǎng)白豬多態(tài)性較高，GG基因型豬具有體高、瘦肉率高和生長(zhǎng)較快的特點(diǎn)，是一個(gè)值得研究的重要基因。

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The Polymorphism of IGFBP3 Intron 2 and Its Relationship with the Main Growth Traits of Pigs

SONG Yu-qin, YU Guang-hui, WANG Jian-lin, ZHANG Can, ZHANG Ting-rong*
(College oAnimal Science, Qingdao Agricultural University, Shandong Qingdao 266109, China)

There is a relationship between the Insulin-like Growth Factor Binding Proteins (IGFBPs) and animals’growth and development. This research aimed to study the polymorphism oIGFBP3 and its relationship with pig growth characteristics. The method oPCR-RFLP was used to study the intron 2 oIGFBP3 of Landrace, Duroc and Landrace pigs. The inuence oIGFBP3 gene type to pig body length, body height, lean meat rate, backat, muscle thickness, 0～100 kg gain weight, 30～100 kg and 100 kg gain weight growth traits were analyzed. The results showed that there were 417 bps for the intron 2 of IGFBP3, and the polymorphism oA307G aected the pig growth. The three pigs with IGFBP3 gene heterozygous AG genotype were dominant. Duroc and Landrace were deviatedrom Hardy-Weinberg one quilibrium at thesite (P＜0.01). The IGFBP3 gene PIC showed moderate polymorphism in the three varieties opig (0.34～0.37). The GG genotype of IGFBP3 gene had greatly inuence in the body height (P=0.068) and lean meat rate (P=0.058) in large white. It had greatly inuenced in the lean meat rate (P=0.099) and muscle thickness (P=0.079) oDuroc. The eect to weight gain at 0-100 kg were close to signicant level in Landrace (P=0.08). This is showed that the GG genotype pig had the characteristics ohigher body height andaster growth. It could suer a suggestionor pig genetics and breeding.

Pig; IGFBP3; PCR-RFLP; Association analysis

S828.2

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-044

2016-10-12；

2017-02-11

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SDAI T-08-13）

宋玉芹（1965-），女，山東招遠(yuǎn)人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail: songyuqin65@126.com

* 通訊作者：張廷榮（1962-），男，山東安丘人，教授，研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種，E-mail: zhangtr2006@126. com