何小龍，付紹印，李 蓓，祁云霞，王 標(biāo)，特日格勒，郝晨芳，達(dá) 賴，劉永斌*，榮威恒

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

烏珠穆沁羊不同組織基因組DNA甲基化狀態(tài)的MSAP分析

何小龍1，付紹印1，李 蓓2，祁云霞1，王 標(biāo)1，特日格勒1，郝晨芳1，達(dá) 賴1，劉永斌1*，榮威恒1

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

本研究應(yīng)用甲基敏感擴(kuò)增片段多態(tài)性方法（MSAP），選用10對(duì)選擇性引物分別對(duì)5只烏珠穆沁羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長(zhǎng)肌組織樣品混池DNA中CCGG位點(diǎn)進(jìn)行了甲基化檢測(cè)。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)共獲得條帶1 249條，其中TypeⅡ型條帶154條，TypeⅢ型條帶231條；通過(guò)計(jì)算不同組織的甲基化率，烏珠穆沁羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長(zhǎng)肌平均甲基化率為37.58%、39.88%、50.63%、25.82%、20.53%、28.19%、19.21%；在所檢測(cè)組織中，脾臟組織的甲基化程度最高，肌肉組織的甲基化程度最低。本研究為進(jìn)一步了解甲基化在綿羊組織分化過(guò)程中所起到的作用奠定了基礎(chǔ)。

烏珠穆沁羊；組織；甲基化；MSAP

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，其原理是哺乳動(dòng)物基因組在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的作用下，把S-腺苷甲硫氨酸（SSAM）作為甲基供體，將胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸（CpG）的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5mC）的一種共價(jià)修飾反應(yīng)。這種共價(jià)修飾具有表觀遺傳效應(yīng)和突變效應(yīng)，進(jìn)而可導(dǎo)致基因的特異表達(dá)、細(xì)胞分化和染色質(zhì)失活[1]等，因此DNA甲基化在動(dòng)物的細(xì)胞及組織分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。隨著研究的不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，家畜不同的發(fā)育階段以及不同的組織中，DNA序列并不發(fā)生改變，而基因的表達(dá)具有特定模式，DNA甲基化不僅與基因表達(dá)模式有關(guān)[2]，而且動(dòng)物的生長(zhǎng)階段和組織特異性與DNA甲基化水平動(dòng)態(tài)變化也密切相關(guān)[3]。

蒙古高原是世界家畜起源地之一，也是現(xiàn)代放牧家畜——牛馬羊駝的馴養(yǎng)中心之一。在蒙古高原上，歷史悠久的蒙古羊系統(tǒng)很少受到外來(lái)羊系統(tǒng)的影響而混雜，較好地保持了原有的種質(zhì)特性。烏珠穆沁羊就是在這種特定的自然條件和生態(tài)環(huán)境中經(jīng)歷長(zhǎng)期的自然選擇和人工培育而形成的地方優(yōu)良品種，來(lái)源于喀爾喀蒙古羊血統(tǒng)，在生產(chǎn)性能方面優(yōu)于一般蒙古羊。本研究選擇烏珠穆沁羊作為研究模式動(dòng)物，首次應(yīng)用MSAP方法檢測(cè)烏珠穆沁羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長(zhǎng)肌7個(gè)組織基因組DNA甲基化的程度，通過(guò)對(duì)烏珠穆沁羊不同組織全基因組DNA甲基化的分析，獲得烏珠穆沁羊不同組織全基因組DNA甲基化水平，為進(jìn)一步了解甲基化在綿羊組織分化過(guò)程中所起到的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取相同飼養(yǎng)環(huán)境、體況良好3周歲左右烏珠穆沁羊5只，屠宰后迅速采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長(zhǎng)肌組織樣品1 g左右，液氮速凍帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器 TIAN amp Genomic DNA kit 血液/細(xì)胞/組織/基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN公司），TMEMD（Coolaber），蛋白酶K、EcoR I、Hpa II、Msp I酶、Mix購(gòu)自TaKaRa公司，瓊脂糖（Invitrogen），無(wú)水碳酸鈉、硝酸銀、甲醛、硫代硫酸鈉、冰乙酸均購(gòu)自天津市科盟化工工貿(mào)有限公司和國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；分析天平、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、微型離心機(jī)、電泳儀、恒溫培養(yǎng)振蕩器、電熱鼓風(fēng)干燥器、凝膠成像系統(tǒng)、微量紫外分光光度計(jì)等。

1.3 各組織DNA提取及混樣 使用TIAN amp Genomic DNA kit 血液/細(xì)胞/組織/基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取5只羊的不同組織DNA，對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。所有組織DNA提取完成后，分別吸取3 μL每個(gè)體的同一組織DNA進(jìn)行混樣，分別組成心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長(zhǎng)肌7個(gè)DNA混樣，置于-20℃冰箱中備用。

1.4 MSAP分析

1.4.1 酶切反應(yīng) 分別用HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ2種限制性內(nèi)切酶組合進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系為：不同組織混樣基因組DNA 5 μL，10×Tango TM buffer 2 μL，HpaⅡ/MspⅠ 0.5 μL，EcoRⅠ 0.5 μL，ddH2O 12 μL，合計(jì)20 μL。每種組織樣品混樣DNA樣品酶切反應(yīng)做2管，在PCR儀中37℃恒溫1 h。

1.4.2 接頭連接反應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)中所用接頭為：接頭EcoRⅠ：5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'，3'-CATCTGACGCATGGTTAA-5'；接頭HpaⅡ/ MspⅠ：5'-GACGATGAGTCTAGAA-3'，3'-CTACTCAGATCTTGC-5'，接頭由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。將上下游接頭稀釋100倍之后等體積混勻，再將酶切產(chǎn)物與接頭連接，16℃連接過(guò)夜，-20℃保存。連接體系為：酶切產(chǎn)物10 μL，ddH2O 6.5 μL，10×Tango TM buffer 2 μL，HpaⅡ/MspⅠ 0.5 μL，EcoRⅠ 接頭0.5 μL，T4 DNA 連接酶 0.5 μL，合計(jì)20 μL。

1.4.3 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng) 將連接產(chǎn)物稀釋10倍，進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增引物序列如下：EcoRⅠ 預(yù)擴(kuò)增引物：5'-GACTGCGTACCAATTCA-3'，HpaⅡ/MspⅠ預(yù)擴(kuò)增引物：5'-GATGAGTCTAGAACGGT-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。預(yù)擴(kuò)增體系為：Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，連接產(chǎn)物2 μL，預(yù)擴(kuò)增引物各1 μL，合計(jì)20 μL。預(yù)擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，72℃ 7 min，30個(gè)循環(huán)，4℃保存。

1.4.4 選擇性擴(kuò)增反應(yīng) 將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物10倍稀釋，進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。選擇性擴(kuò)增體系為：Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，選擇性擴(kuò)增上下游引物各1 μL，合計(jì)20 μL。選擇性擴(kuò)增條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s（每個(gè)循環(huán)降低0.7℃），72℃ 1 min，13個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，23個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.4.5 PCR產(chǎn)物電泳及銀染 將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)條件為：先在200 V條件下預(yù)電泳 10 min，再在100V條件下電泳6 h左右。電泳結(jié)束后，小心將膠板放入托盤中進(jìn)行銀染，銀染最后用蒸餾水漂洗膠板兩遍，室溫下自然干燥，拍照保存，統(tǒng)計(jì)凝膠上各種模式的片段，用保鮮膜將膠板包裹完整，寫上日期和引物名稱以及點(diǎn)樣順序，放在4℃冰箱中備用。

表1 選擇性擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性擴(kuò)增結(jié)果 分別利用HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ2種限制性內(nèi)切酶組合對(duì)每種組織混池DNA基因組進(jìn)行酶切后，再與接頭進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物稀釋10倍作為模板，進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用篩選好的10對(duì)引物組合，分別對(duì)7個(gè)組織的混池DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，由圖1可見(jiàn)，選擇性擴(kuò)增結(jié)果大多集中在100～1 000 bp之間，呈比較均勻的彌散狀，分辨不出明顯的主帶，這也側(cè)面反映了接頭連接的效率較高，達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖1 DNA選擇性擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析 選用10 對(duì)引物組合通過(guò)MSAP方法對(duì)烏珠穆沁羊不同組織的基因組甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，不同組織都獲得了清晰的擴(kuò)增譜帶，每對(duì)引物組合擴(kuò)增片段10～20條，長(zhǎng)度在100～1 000 bp之間，大于1 000 bp 的片段比較少，結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠的分辨率，小于100 bp的條帶一般認(rèn)為不可取，所以本次實(shí)驗(yàn)主要選取100～500 bp之間的擴(kuò)增片段進(jìn)行分析。在同1對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果中當(dāng)1個(gè)樣品在甲基化模式上不同于其他樣品時(shí)，DNA甲基化就被認(rèn)為有1個(gè)多態(tài)性。部分檢測(cè)結(jié)果如圖2所示（以E2H2檢測(cè)結(jié)果為例）。

圖2 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3 烏珠穆沁羊不同組織基因組DNA 甲基化狀態(tài)分析 在MSAP技術(shù)中，應(yīng)用同裂酶HpaⅡ/ EcoRⅠ和MspⅠ/ EcoRⅠ分別對(duì)基因組進(jìn)行雙酶切，同裂酶HpaⅡ和MspⅠ能夠識(shí)別并切割CCGG位點(diǎn)，但是對(duì)位點(diǎn)中胞嘧啶的甲基化程度的敏感性不同。HpaⅡ可識(shí)別內(nèi)部胞嘧啶的甲基化（CmGG），MspⅠ可識(shí)別外部胞嘧啶的甲基化（mCCGG），因此通過(guò)比較分析MSAP電泳圖譜，可以分析樣品DNA的甲基化狀況。

根據(jù)不同組織DNA在MSAP 電泳圖譜上擴(kuò)增條帶出現(xiàn)的情況，每個(gè)組織基因組甲基化可分為3種模式：TypeⅠ（非甲基化），擴(kuò)增條帶在H和M 2個(gè)泳道同時(shí)出現(xiàn)，這種情況CCGG 位點(diǎn)一般沒(méi)有發(fā)生甲基化；Type Ⅱ（半甲基化），擴(kuò)增條帶在H 泳道出現(xiàn)而在M 泳道缺失，這種情況CCGG 位點(diǎn)發(fā)生半甲基化；Type Ⅲ（全甲基化），擴(kuò)增條帶在M 泳道出現(xiàn)而在H 泳道缺失，這種情況CCGG位點(diǎn)發(fā)生全甲基化，具體分型依據(jù)可見(jiàn)圖3。一個(gè)組織基因組的甲基化程度計(jì)算公式為Type Ⅱ+TypeⅢ與TypeⅠ+TypeⅡ+TypeⅢ的比值。

圖3 3種甲基化模式

表2 不同組織基因組DNA 甲基化程度比較

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)10對(duì)選擇性引物對(duì)5只烏珠穆沁羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長(zhǎng)肌組織樣品混池DNA中CCGG位點(diǎn)進(jìn)行了甲基化檢測(cè)，通過(guò)聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)共獲得條帶1 249條，其中TypeⅡ型條帶154條，TypeⅢ型條帶231條。通過(guò)對(duì)不同組織基因組DNA甲基化程度比較，計(jì)算其甲基化率。通過(guò)計(jì)算，心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長(zhǎng)肌的半甲基化水平分別為16.36%、13.50%、18.35%、9.34%、7.89%、12.77%、9.85%；全甲基化水平分別為21.21%、26.38%、32.28%、16.48%、12.63%、15.43%、9.36%；總體的甲基化水平為37.58%、39.88%、50.63%、25.82%、20.53%、28.19%、19.21%（表2）。從各組織DNA甲基化水平來(lái)看，在所檢測(cè)組織中，脾臟組織的甲基化程度最高，肌肉組織的甲基化程度最低。

3 討 論

由于MSAP方法具有較好的通用性、易操作性和多態(tài)性高、信息豐富的特點(diǎn)，可在全基因組范圍檢測(cè)CCGG位點(diǎn)的胞嘧啶甲基化變化情況[4]，因此已廣泛應(yīng)用于基因的甲基化研究中。Ma等[5]應(yīng)用MSAP方法對(duì)豬的脂肪和肌肉組織的甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明不同組織的甲基化水平在性別間差異不顯著，而脂肪與肌肉組織的甲基化水平差異顯著。唐紹青等[6]應(yīng)用MSAP方法檢測(cè)了4種哺乳動(dòng)物（豬、牛、羊、小鼠）和2種家禽（雞和鴨）不同組織基因組的DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)不同動(dòng)物相同組織基因組的甲基化程度不同，相同動(dòng)物不同組織基因組的甲基化模式具有特異性；同一種動(dòng)物，組織基因組的甲基化程度一般都高于血液基因組，哺乳動(dòng)物與禽類基因組甲基化程度差別不大。蔣曹德[7]用MSAP的方法檢測(cè)了2個(gè)純種和2個(gè)雜交F1代豬群體的血液和肌肉組織DNA甲基化水平，檢測(cè)結(jié)果表明4個(gè)群體的甲基化水平在10.2%～10.5%之間，整體上甲基化差異不顯著，3種甲基化差異類型均與雜種一代表現(xiàn)顯著相關(guān)。李金龍等[8]應(yīng)用MSAP的方法檢測(cè)北京油雞肌肉和卵巢組織的基因組DNA甲基化模式和程度，通過(guò)檢測(cè)肌肉組織的甲基化水平為35.86%，卵巢組織為31.50%，2種組織的甲基化水平差異顯著。與體重相關(guān)性進(jìn)行分析表明，肌肉組織的甲基化狀態(tài)對(duì)北京油雞的體重具有重要作用。徐青等[9]應(yīng)用MSAP的方法檢測(cè)了白洛克肉雞和白來(lái)航蛋雞及其雜交F1 代的肌肉、心臟、肝臟和腎臟4個(gè)不同組織基因組在CCGG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其肌肉、心臟、肝臟和腎臟組織的甲基化水平約為29.7%、27.5%、27.5%和26.1%，研究結(jié)果表明雞不同組織基因組的甲基化狀態(tài)是不同的，同一組織的甲基化水平在不同的群體是不同的，而不同組織甲基化水平的排序在不同的群體也不一致。肖正中等[10]應(yīng)用MSAP技術(shù)對(duì)6頭長(zhǎng)白公豬、50頭藍(lán)塘母豬及長(zhǎng)×藍(lán)51頭雜交F1代3個(gè)群體共107個(gè)個(gè)體耳組織基因組DNA胞嘧啶甲基化模式和程度進(jìn)行評(píng)估，父母代及其雜交F1代3個(gè)群體基因組DNA甲基化總體水平分別是27.7%、27.8%和25.1%，結(jié)果提示豬基因組甲基化多態(tài)性豐富，雜種F1代與其父母代之間的基因組甲基化水平存在差異。

本研究通過(guò)10對(duì)選擇性引物對(duì)烏珠穆沁羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長(zhǎng)肌組織樣品混池DNA中CCGG位點(diǎn)進(jìn)行了甲基化檢測(cè)，得出上述各組織的甲基化水平分別為37.58%、39.88%、50.63%、25.82%、20.53%、28.19%、19.21%，脾臟組織的甲基化程度最高，肌肉組織的甲基化程度最低；在檢測(cè)的所有組織中，各組織間的半甲基化率和全甲基化率差異較大，進(jìn)而導(dǎo)致不同組織間的甲基化率及甲基化模式不同。另外本研究中所獲得的總條帶數(shù)較少，推測(cè)與本研究的樣本量少及DNA混池法有關(guān)。雖然MSAP技術(shù)具有一定的局限性，只能檢測(cè)全基因組范圍內(nèi)的CCGG位點(diǎn)的甲基化變化，對(duì)其他位點(diǎn)的甲基化不能檢出，但是在真核生物中，90%甲基化存在于CG序列中，所以多數(shù)研究人員認(rèn)為CCGG位點(diǎn)的胞嘧啶甲基化比例能夠客觀反映基因組DNA甲基化修飾水平。因此，本研究也客觀地反映出烏珠穆沁羊不同組織的甲基化狀況，下一步將選擇甲基化程度最高的脾臟組織進(jìn)行差異甲基化片段的回收與鑒定，通過(guò)生物信息學(xué)的分析找出差異甲基化基因，分析這些基因在組織分化過(guò)程中的調(diào)控作用。

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Analysis of DNA Methylation in Dif f erent Ujumqin Sheep Tissues with MSAP

HE Xiao-long1, FU Shao-yin1, LI Bei2, QI Yun-xia1, WANG Biao1, TE Ri-Ge-Le1, HAO Chen-fang1, DA Lai1, LIU Yong-Bin1*, RONG Wei-heng1
(1. Inner Mongolia Academy oAgricultural & Animal Husbandry Sciences, Inner Mongolia Hohhot 010031, China; 2. College oAnimal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Inner Mongolia Hohhot 010018, China)

The CCGG sites in genomes were detected among heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach and longissimus muscle o5 Ujumqin sheepor 10 pairs oselective primers by methylation sensitive amplied polymorphism (MSAP) method. A total o1249 DNAragments were detected by the polyacrylamide gel electrophoresis, including 154 type Ⅱand 231 type Ⅲragments. Through calculation the methylation rates odierent tissuesor Ujumqin sheep, the average methylation rate oheart, liver, spleen, lung, kidney, stomach and longissimus muscle was 37.58%, 39.88%, 50.63%, 25.82%, 20.53%, 28.19%, 19.21% respectively. For the all detected tissues, the spleen tissue methylation degree was The highest and the muscle tissue was the lowest. This study laid theoundationorurther understanding othe role oDNA methylation regulatory eector the sheep tissue dierentiation.

Ujumqin Sheep; Tissue; Methylation; MSAP

S826.2

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-035

2016-11-01；

2016-12-27

內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院青年創(chuàng)新基金(2013QNJJ M01)；國(guó)家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-39）；內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新基金（2015CXJJM02）；內(nèi)蒙古自治區(qū)草原英才建設(shè)項(xiàng)目

何小龍（1983-），男，陜西眉縣人，博士，副研究員，主要從事生物技術(shù)與草食家畜育種研究，E-mail: hexiaolong1983@163.com

* 通訊作者：劉永斌，博士，研究員，研究方向?yàn)榧倚笥N與生產(chǎn)，E-mail:ybliu117@126.com