覃容貴 曹旭林 徐昌艷 鄧強 周鎂 范菊娣

摘要 [目的]建立貴州寬葉纈草地上部分總黃酮含量測定方法，確定貴州寬葉纈草兼顧地上部分和藥用部位的適宜采收期。[方法]采用紫外分光光度法測定不同采收期寬葉纈草藥用部位與地上部分總黃酮含量，并運用主成分分析法確定黔產(chǎn)寬葉纈草適宜采收期。[結(jié)果]蘆丁在0.010 0～0.080 0 mg/mL線性關(guān)系良好，加樣回收率為101.02%，RSD值為2.01%。不同采收期寬葉纈草藥用部位與地上部分總黃酮含量呈動態(tài)變化，由高到低依次為7月份、8月份、6月份、5月份、4月份、3月份，7月份采收的寬葉纈草綜合評價指數(shù)最高。[結(jié)論]所建立的含量測定方法具有操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好等特點，可用于寬葉纈草地上部分總黃酮含量測定；7月份為寬葉纈草適宜的采收期。

關(guān)鍵詞 寬葉纈草；總黃酮；主成分分析法；采收期

Study on Harvest Period of Valeriana officinalis from Guizhou Province

QIN Rong-gui，CAO Xu-lin，XU Chang-yan，F(xiàn)AN Ju-di* et al （Guizhou Medcial University， Guiyang，Guizhou 550025）

Abstract [Objective] The research aimed to establish the method for the content determination of total flavones from the aerial parts of Valeriana officinalis，and determine the optimal harvesting period of the aerial parts and medicinal parts of Valeriana officinalis from Guizhou Province.[Method]Ultraviolet visible spectrophotometry was used to determine the total flavonoids contents of medical and aerial parts in Valeriana officinalis，which were from different collection period， and principal component analysis （ PCA） was used to confirm the optimal harvesting time.[Result]Rutin showed good linear relationship in the concentration range of 0.010 0-0.080 0 mg/mL， the recovery rate was 101.02%， RSD was 2.01%.There were dynamic changes of the total flavones contents in the samples of different harvest month. It was as follows in descending order： July，August，June，May，April，March， the comprehensive evaluation index of samples collected in July was better than others.[Conclusion]The established method is simple， accurate，repeatable， and can be used for quality control of the aerial parts of Valeriana officinalis. The optimal harvest period of Valeriana officinalis is July.

Key words Valeriana officinalis；Total flavones；Principal component analysis；Harvest period

寬葉纈草為敗醬科纈草屬植物寬葉纈草（Valeriana officinalis L. var.latifolia Miq.）的干燥根及根莖，常生于林下、溝邊以及高山山坡，廣泛分布于我國東北至西南等地[1]，為貴州省中藥民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2003版收載品種[2]。目前，在貴州江口縣和劍河縣已經(jīng)建立了規(guī)?；睦i草種植基地。

纈草生物活性廣泛，療效明顯，安全性好，是一種很有開發(fā)前景的中藥資源[3]。目前，纈草提取物及制劑在國際市場上十分走俏，是美國十大暢銷天然產(chǎn)物制劑之一，我國寬葉纈草的研究開發(fā)也取得了一定成果，但還不夠系統(tǒng)深入[4-6]。寬葉纈草傳統(tǒng)入藥部位為根和根莖，采收期多在7—8月份，此時地上部分也正是生長旺盛時期，但都被丟棄不用。現(xiàn)代研究表明，纈草中含有揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜、有機酸、生物堿、黃酮等化學(xué)成分[7-8]。其中黃酮類化合物在臨床上應(yīng)用非常廣泛，常用于抗腫瘤、防治心腦血管和呼吸系統(tǒng)疾病等[9-10]。覃容貴等[11]研究發(fā)現(xiàn)，寬葉纈草地上部分富含黃酮類成分，如加以利用，將有利于提高寬葉纈草的經(jīng)濟價值。筆者立足于貴州豐富的寬葉纈草資源，建立貴州寬葉纈草地上部分的總黃酮含量測定方法，測定其不同采收期藥用部位和地上部分總黃酮含量，通過主成分分析確定貴州寬葉纈草兼顧地上部分和藥用部位的適宜采收期，為寬葉纈草規(guī)范化種植提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。從貴州省江口縣寬葉纈草種植基地某固定區(qū)域內(nèi)隨機采集寬葉纈草生長期各月份樣品，藥材經(jīng)鑒定為敗醬科植物寬葉纈草（Valeriana officinalis L. var.latifolia Miq.）。

1.1.2 試劑。對照品蘆丁（中國藥品生物制品檢定所，批號100080200707）；亞硝酸鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號20130110）；硝酸鋁（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號20071118）；氫氧化鈉（重慶川東化工有限公司，批號20130601）；三氯化鋁、乙醇等均為分析純，水為蒸餾水。

1.1.3 儀器。AL204電子天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]；紫外可見分光光度計（島津UV-2401）；MH-2000 調(diào)溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；101-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海路達(dá)實驗儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備。精密稱取蘆丁對照品適量，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇溶解、定容，搖勻，制成濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液。

1.2.2 提取溶劑和最大吸收波長的選擇。精密稱取3份寬葉纈草地上部分1 g，分別置于索氏提取器裝置中，加石油醚100 mL加熱回流提取至提取液無色，藥渣揮去石油醚，分別加入80 mL 50%、75%、95%乙醇繼續(xù)提取至無色，提取液放置室溫后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，分別用不同濃度乙醇定容至刻度，搖勻，作供試品溶液[12]。

精密量取1 mL供試品溶液于10 mL容量瓶中，加入不同濃度乙醇至5.0 mL，再分別加入5% NaNO2試劑0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加10% Al（NO3）3試液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，再加4% NaOH試液4 mL，用不同濃度乙醇溶液定容至刻度，搖勻，靜置15 min，在200～700 nm處進(jìn)行全波長掃描[13]。

1.2.3 顯色劑的選擇。

1.2.3.1 0.1 mol/L AlCl3顯色。分別精密量取對照品與寬葉纈草地上部分供試品溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，精密加入3 mL 0.1 mol/L AlCl3 溶液，再加入4 mL 1 mol/L NaAc溶液，搖勻，置恒溫水浴鍋（20 ℃）顯色2 min，取出，用80%乙醇定容，冷卻。以隨行試劑為空白，于200～700 nm處進(jìn)行全波長掃描[14-15]。

1.2.3.2 0.5 mol/L AlCl3顯色。分別精密量取對照品與寬葉纈草地上部分供試品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 0.5 moL/L A1Cl3溶液，搖勻，放置15 min，再用pH 6.0 HAc-NaAc緩沖溶液定容，搖勻，超聲振蕩5 min，以隨行試劑為空白，于200～700 nm處進(jìn)行全波長掃描。

1.2.3.3 5% NaNO2-10%Al（NO3）3-4%NaOH顯色。分別精密量取對照品與寬葉纈草地上部分供試品溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，加入75%乙醇至5.0 mL，再分別加入5% NaNO2試劑0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加10%Al（NO3）3試液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入4 mL 4%NaOH溶液，用75%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置15 min，于200～700 nm處進(jìn)行全波長掃描[16]。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密量取蘆丁對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于10 mL具塞試管中，加入75%乙醇至5.0 mL，再分別加入5% NaNO2試劑0.3 mL，搖勻后靜置6 min，加10%Al（NO3）3試液0.3 mL，搖勻靜置6 min，再加4% NaOH試液4 mL，用75%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻靜置15 min。以未加標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為空白對照，于508 nm處測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 精密度試驗。稱取寬葉纈草地上部分0.5 g，精密稱定，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，精密量取2 mL于10 mL具塞試管中，按照“1.2.4.1”方法從“加入75%乙醇至5.0 mL”起，顯色，于508 nm波長處測定吸光度，連續(xù)重復(fù)測定吸光度6次。

1.2.4.3 重復(fù)性試驗。取同一批寬葉纈草地上部分6份，各0.5 g，精密稱定，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，精密量取2 mL于10 mL具塞試管中，按照“1.2.4.1”方法從“加入75%乙醇至5.0 mL”起，顯色，于508 nm波長出測定吸光度。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗。取寬葉纈草地上部分0.5 g，精密稱定，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，精密量取2 mL于10 mL具塞試管中，按照“1.2.4.1”方法從“加入75%乙醇至5.0 mL”起，顯色，每隔20 min于508 nm處測定，持續(xù)2 h。

1.2.4.5 加樣回收率試驗。精密稱取已知總黃酮含量的寬葉纈草地上部分0.25 g，共9份，精密稱定，在已知總黃酮含量的寬葉纈草地上部分中按1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2的比例加入對照品，每個比例做3份，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，精密量取2 mL于10 mL具塞試管中，按照“1.2.4.1”方法從“加入75%乙醇至5.0 mL”起，顯色，于508 nm處測定吸光度。

1.2.5 寬葉纈草地上部分樣品總黃酮含量的測定。取同一產(chǎn)地不同采收期寬葉纈草地上部分約0.5 g，精密稱定，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，精密量取2 mL于10 mL具塞試管中，按照“1.2.4.1”方法從“加入75%乙醇至5.0 mL”起，顯色，于508 nm處測定吸光度，計算總黃酮含量。

1.2.6 不同采收期寬葉纈草藥用部位總黃酮含量的測定。參照周鎂等[17]測定黔產(chǎn)寬葉纈草根中總黃酮含量的方法，對同一產(chǎn)地不同采收期寬葉纈草藥用部位總黃酮含量進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理 運用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，采用主成分分析對不同采收時間寬葉纈草藥用部位和地上部分總黃酮2個指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果進(jìn)行分析評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑和最大吸收波長的選擇 由圖1可知，各濃度乙醇提取的寬葉纈草供試品溶液于200～700 nm掃描時，峰形基本一致，最大吸收波長為508 nm，其75%乙醇提取供試品溶液吸光度較大，故選擇75%乙醇為提取溶劑。

2.2 顯色劑的選擇 分別對0.1 mol/L AlCl3顯色、0.5 mol/L AlCl3顯色、5% NaNO2 -10%Al（NO3）3-4% NaOH 顯色進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），5%NaNO2 -10%Al（NO3）3-4% NaOH顯色對照品與供試品溶液在508 nm處均有最大吸收，因此確定以5%NaNO2 -10%Al（NO3）3-4% NaOH顯色體系用于寬葉纈草地上部分總黃酮顯色。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程Y=11.7X+0.001 1（R2=0.999 8），表明蘆丁在0.010 0～0.080 0 mg/mL與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗。按照“1.2.4.2”操作，測得吸光度分別為0.270 9、0.271 1、0.270 5、0.271 0、0.270 6、0.270 6，計算RSD值為0.09%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗。按照“1.2.4.3”操作，平行樣6份，測得吸光度分別為0.207 2、0.214 0、0.218 5、0.216 5、0.213 6、0.208 8，計算RSD值為2.05%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.4.4”操作，測得供試品溶液吸光度值分別為0.270 6、0.269 0、0.266 3、0.264 6、0.263 5、0.262 5，計算RSD值為1.20%（n=6）。表明供試品溶液在顯色后2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗。由表1可見，蘆丁的平均加樣回收率為101.02%，RSD值為2.01%。表明該方法回收率較好，方法可行。

2.4 不同采收期寬葉纈草地上部分和藥用部位總黃酮含量 由表2可知，寬葉纈草地上部分總黃酮含量遠(yuǎn)高于藥用部位，藥用部位總黃酮含量在3—4月份激增，之后小幅增長，7月份達(dá)高峰，8月份下降；而地上部分推遲1個月，在4—5月份迅速增高，之后緩慢增長，7月份達(dá)高峰，8月份下降。直觀分析，兼顧地上部分及藥用部位寬葉纈草適宜的采收期在7月份。

2.5 主成分分析確定寬葉纈草最佳采收期 運用主成分分析對不同采收時間寬葉纈草藥用部位和地上部分總黃酮含量測定結(jié)果進(jìn)行分析評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)特征值可以排列主成分名次λ1=1.737>λ2=0.263；從貢獻(xiàn)率以及累計貢獻(xiàn)率來看，第1主成分方差貢獻(xiàn)率最大，為85.979%，當(dāng)累計貢獻(xiàn)率達(dá)到70%即認(rèn)為比較滿意[18]，所以取第1主成分即可基本反映總體情況，達(dá)到降維的目的。根據(jù)特征向量各元素標(biāo)準(zhǔn)化值的線性組合，可得到主成分線性組合表達(dá)式為：F=AF1=0.87F1，其中A=λ1 /（λ1+λ2），F(xiàn)1=0.707B1+0.500 B2（B1、B2為各成分含量標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)）。

按上述主成分表達(dá)式，計算出不同采收時間寬葉纈草樣品綜合主成分評價值并排序（表3），確定最佳采收期。根據(jù)綜合評分值的排序（表3）可以看出，排序第一的采收時間在7月份，說明7月份藥材包含了2種指標(biāo)成分的最佳綜合信息，可將7月份確定為寬葉纈草藥材的最佳采收期。

3 討論與小結(jié)

3.1 寬葉纈草適宜采收期的確定 藥材采收期確定應(yīng)綜合考慮有效成分的積累動態(tài)與藥用部位的生長動態(tài)。寬葉纈草作為藥材，其傳統(tǒng)藥用部位為根和根莖，具有安神鎮(zhèn)靜、驅(qū)風(fēng)解痙、生肌止血、止痛等功效，由于其特征性成分環(huán)烯醚萜類含量極低，穩(wěn)定性差，樣品間含量無明顯差異性，不宜作為檢測指標(biāo)；而黃酮類成分含量較高，易于測定，樣品間含量差異性顯著，且其抗腫瘤、防治心腦血管和呼吸系統(tǒng)疾病作用良好，因此該研究選用黃酮類成分作為檢測指標(biāo)，研究寬葉纈草中有效成分的累積動態(tài)。從累積動態(tài)來看，藥用部位從4月份開始、地上部分從5月份開始總黃酮含量即無明顯提高；從生長動態(tài)來看，7、8月份是貴州江口、劍河寬葉纈草生長旺盛期，9月份植株倒苗。綜合考慮，寬葉纈草有效成分含量高峰期與藥用部位產(chǎn)量高峰期在7、8月份，8月份總黃酮含量稍有下降，因此其最佳采收期在7月份。從主成分分析結(jié)果來看，藥用部位總黃酮含量為第1主成分，累積貢獻(xiàn)率大，為采收期確定的主要考察因素。7月份藥材包含了2種指標(biāo)成分的最佳綜合信息，因此可將7月份確定為寬葉纈草藥材的最佳采收期。在實際生產(chǎn)中，貴州江口、劍河寬葉纈草產(chǎn)區(qū)傳統(tǒng)采收期在7、8月份，8月份地上部分和藥用部位總黃酮含量均有所下降，為確保藥材質(zhì)量和經(jīng)濟價值，建議在7月份采收較為適宜。

從總黃酮含量來看，寬葉纈草地上部分總黃酮含量遠(yuǎn)高于藥用部位，在產(chǎn)區(qū)地上部分常常被丟棄不用，浪費了寶貴的藥用植物資源，非?？上АＴ泄緦⑵浣?jīng)簡單加工制成袋泡茶，有較好的安眠作用。建議7月份采收后，將地上部分進(jìn)行開發(fā)利用，實現(xiàn)藥材經(jīng)濟價值最大化。

3.2 寬葉纈草地上部分總黃酮含量測定中色素的處理 除色素問題是以地上部分（全草）入藥的中藥材采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行含量測定必須解決的問題。纈草藥材雖不是全草入藥，但為了開發(fā)其地上部分，在測定地上部分總黃酮時為了減小樣品溶液本身的顏色對顯色效果的影響，故應(yīng)考慮除去地上部分的色素。試驗過程中探討了樣品除色素與不除色素對總黃酮含量測定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異確實較大，說明色素對總黃酮測定的影響較大，因為色素是屬于小極性的物質(zhì)，用極性較小的石油醚除去即可，且因石油醚極性較小，不會影響黃酮類物質(zhì)的提取。