廖蕤堃，曾丹妮，張竹，張力強，SAGAR Thapa，文明

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 放射科，重慶 400016)

·論 著·

廖蕤堃，曾丹妮，張竹，張力強，SAGAR Thapa，文明

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 放射科，重慶 400016)

超順磁性氧化鐵； 分子探針； 磁共振成像； 掃描濃度； 裸鼠

1 材料與方法

1.1 主要材料及設備

探針由課題組制備，并獲得國家發(fā)明專利授權(專利號：ZL201410064217.6)；SKOV3腫瘤細胞株(中國科學院上海細胞庫)；細胞培養(yǎng)基RPMI 1640及胎牛血清(美國GIBCO公司)；0.25%胰蛋白酶(美國HYCLONE公司)；磷酸緩沖液(PBS)；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)；BALB/c裸鼠，雌性，4～6周齡，體重(22±3)g，購買并飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心(省部級共建重點實驗室)；戊巴比妥鈉(德國Merck公司)；核固紅(武漢博士德生物工程有限公司)；亞鐵氰化鉀[生工生物工程(上海)有限公司]，3.0 T超導型MR成像儀及腕關節(jié)線圈(美國GE公司)。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 SKOV3腫瘤細胞株培養(yǎng)及荷瘤裸鼠模型建立

參照課題組既往的成熟方法[3]，將SKOV3卵巢癌細胞株置于含有10%胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)基內常規(guī)(恒溫37 ℃、濃度為5%CO2孵箱中)培養(yǎng)，選擇對數(shù)期生長細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集至10 ml離心管內，以800 r·min-1離心5 min，隨后用無血清、無抗生素細胞懸液稀釋至細胞濃度為5×107個·ml-1備用。BALB/c裸鼠30只，統(tǒng)一在每只后背部近左側大腿區(qū)域皮下接種SKOV3腫瘤細胞懸液約0.2 ml(含細胞數(shù)約為1×107個)，常規(guī)飼養(yǎng)，每天定時(人為規(guī)定在上午10：00)觀察并記錄裸鼠精神狀態(tài)、飲食及腫瘤生長情況，接種后(20±5)d瘤體直徑大于1.0 cm，提示荷瘤裸鼠建模成功，可以用于進一步的實驗。

1.2.2 探針注射后荷瘤裸鼠活體MR掃描

1.2.2.3 MR掃描參數(shù)設置及掃描序列選擇 考慮到掃描時間為探針注射后27 h，若注射前至MR掃描結束這段時間內持續(xù)麻醉荷瘤裸鼠，可能因為不符合動物的生活狀態(tài)而影響實驗效果，故而選擇在注射探針前先行MR掃描作為對照，掃描結束后各組分別注射不同濃度的探針，放回動物實驗中心常規(guī)分盒飼養(yǎng)，在尾靜脈注射探針27 h開始再次MR掃描，兩次掃描的部位、參數(shù)及序列一致。

在每次MR掃描前均將2%戊巴比妥鈉麻醉[劑量為0.1 ml·(20 g)-1]注入荷瘤裸鼠腹腔內，置于自制泡沫板上，醫(yī)用膠布俯臥位固定，待其呼吸頻率降低且呼吸平穩(wěn)后(目的在于減少呼吸偽影對MR圖像的干擾)，置于腕關節(jié)線圈內，行MR橫斷位及冠狀位掃描。

在參照文獻[7]基礎上，經(jīng)反復預實驗并適當調整，最終用于實驗的參數(shù)如下：(1)T1WI快速自旋回波序列FSE：脈沖序列重復時間/回波時間(TE/TR) 85/300 MinFull, 冠狀位FOV 11 cm，橫斷位FOV 6 cm，激勵次數(shù)3，層厚 2 mm，間距0.5 mm，矩陣320×224，翻轉角20°；(2)T2WI FSE：TE/TR 85/600 ms，F(xiàn)OV 6 cm，激勵次數(shù)3，層厚2 mm，矩陣320×256，翻轉角17°；(3)T2*GRE梯度回波(GRE)：TE/TR 300 ms/MinFull，F(xiàn)OV 6 cm，激勵次數(shù)3，層厚2 mm，間距 0.5 mm，矩陣320×256，翻轉角20°。

1.2.2.4 MR圖像采集及分析 采集掃描圖像并傳輸至GE AW 4.6工作站，分別測量最大層面腫瘤及對側肌肉組織信號強度。為避免誤差，人為規(guī)定感興趣區(qū)(region of interest ROI)圖形為方形游標，面積為20 mm2，測量3次，記錄其平均值。

1.2.2.5 病理切片及染色 第2次MR掃描結束后，立即經(jīng)腹腔注入過量的2%戊巴比妥鈉處死裸鼠，取腫瘤組織及荷瘤對側肌肉組織，以10%緩沖福爾馬林液固定，48 h后行石蠟包埋切片，分別行HE及普魯士藍染色，光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理

計量結果以均數(shù)±標準差表示，使用SPSS 18.0軟件，濃度組間比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 裸鼠模型建立

對數(shù)期SKOV3腫瘤細胞經(jīng)皮下注射后，于實驗動物中心統(tǒng)一飼養(yǎng)，30只荷瘤裸鼠生長良好，無一只死亡。在注射(20±5)d，瘤體長徑大于1 cm，色澤紅潤、形態(tài)規(guī)則(圖1)。6、12、18、24、30 mg·kg-1濃度組腫瘤組織體積依次為(1 518.5±605)、(1 641±498)、(1 523±397)、(1 705±580)、(1 400±387)mm3，各濃度組間腫瘤組織體積大小差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 接種腫瘤細胞并飼養(yǎng)18 d

Fig 1 18 d breeding after inoculation

2.2 裸鼠MR成像結果

探針注射前無裸鼠死亡，探針注射后30 mg·kg-1組立即死亡1只，MR掃描結束后24、30 mg·kg-1組各死亡1只(實驗過程中均采取保溫等相關防護措施，盡量模擬飼養(yǎng)條件)，其余27只裸鼠均存活。

2.2.1 T1WI FSE信號強度變化

不同濃度組的腫瘤組織均出現(xiàn)信號強度改變，與探針注射前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；18、24、30 mg·kg-1組較6、12 mg·kg-1組差異更顯著，而18、24、30 mg·kg-1組間差異無統(tǒng)計學意義；對側相應區(qū)域肌肉組探針注射后信號改變較注射前差異無統(tǒng)計學意義。見表1和圖2。

組 織組織信號強度注射前6mg·kg-1組12mg·kg-1組18mg·kg-1組24mg·kg-1組30mg·kg-1組腫 瘤732±35777±29a798±32a843±28a865±33a876±41a對側肌肉588±31613±24621±44634±21625±29619±26

a 與注射前比較，P<0.05

圖2 探針注射后不同濃度組腫瘤組織T1信號變化圖像(橫斷位)

Fig 2 Diagram of signal intensity T1WI FSE in tumor tissues after injected with molecular probe at different concentrations(Axial)

2.2.2 T2WI FSE信號強度變化

不同濃度組腫瘤組織于探針注射后均出現(xiàn)信號強度改變，與注射前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；18、24、30 mg·kg-1組較6、12 mg·kg-1組改變更為明顯，18、24、30 mg·kg-1組間差異無統(tǒng)計學意義；對側相應區(qū)域肌肉組織探針注射后信號改變較注射前差異無統(tǒng)計學意義。見表2和圖3。

組 織組織信號強度注射前6mg·kg-1組12mg·kg-1組18mg·kg-1組24mg·kg-1組30mg·kg-1組腫 瘤566±40479±31a358±33a247±43b229±39b214±29b對側肌肉218±22203±12216±18207±19194±21199±17

a 與注射前比較，P<0.05； b 與注射前比較，P<0.001

2.2.3 T2*GRE信號強度變化

不同濃度組腫瘤組織于探針注射后均出現(xiàn)信號強度改變，與注射前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；18、24、30 mg·kg-1組較6、12 mg·kg-1組改變更為明顯，18、24、30 mg·kg-1組間差異無統(tǒng)計學意義；對側相應區(qū)域肌肉組織探針注射后信號改變較注射前差異無統(tǒng)計學意義。腫瘤大致變化趨勢與T2WI相似。見表3和圖4。

2.3 病理結果

各濃度組的腫瘤組織HE染色結果類似，以24 mg·kg-1組為例，可見腫瘤組織結構紊亂，瘤細胞形態(tài)不規(guī)則，大小不一致，細胞核異型性較多，部分可見核分裂象改變(圖5)；肌肉組織無明顯變性、壞死等征象顯示。

普魯士藍染色結果，探針注射前各濃度組腫瘤組織中未見藍染顆粒；注射探針后各濃度組均可以見腫瘤組織中存在藍染顆粒，當探針濃度為18、24、30 mg·kg-1時藍染顆粒較多(圖6)，而對照的肌肉組織中未見藍染顆粒。

3 討 論

圖3 探針注射后不同濃度組腫瘤組織T2信號變化圖像(冠狀位)

Fig 3 Diagram of signal intensity T2WI FSE in tumor tissues after injected with molecular probe at different concentrations(Coronal)

組 織組織信號強度注射前6mg·kg-1組12mg·kg-1組18mg·kg-1組24mg·kg-1組30mg·kg-1組腫 瘤536±23478±29a355±35a288±15b304±24b299±18b對側肌肉561±28510±21511±22506±30488±29492±32

a 與注射前比較，P<0.05； b 與注射前比較，P<0.001

圖4 探針注射后不同濃度組腫瘤組織T2*GRE信號變化圖像(橫斷位)

Fig 4 Diagram of signal intensity T2*GRE in tumor tissues after injected with molecular probe at different concentrations(Axial)

圖5 24 mg·kg-1組HE染色結果 ×400

Fig 5 HE straining images(×400)

本課題組前期實驗結果及相關文獻[2]報道均表明，探針注射24 h后主要富集于活體肝臟、脾臟中，這與共識的網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)吞噬作用相吻合，同時在MR掃描的T2*GRE序列表現(xiàn)為信號減低。隨著探針劑量的加大，肝、脾信號強度呈梯度減低，這些結果為本實驗設置濃度梯度提供了依據(jù)。分析以上各濃度組掃描圖像及信號值，探針注射腫瘤組織均出現(xiàn)信號強度減低，也印證了前期的實驗結果。另外，24、30 mg·kg-1組部分裸鼠在探針注射后立即或隨后掃描中相繼出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，我們推測與探針濃度過高有關，即裸鼠無法耐受24 mg·kg-1以上的探針濃度，提示24、30 mg·kg-1不是理想的探針濃度。隨后的實驗結果也表明，當探針濃度為18 mg·kg-1時，腫瘤組織在T1WI上呈輕度升高，而T2WI及T2*GRE上呈低信號改變，探針濃度在裸鼠耐受范圍內且信號強度改變較其余各組明顯，能達到肉眼所能分辨程度。因此，活體荷瘤裸鼠MR掃描最佳的探針濃度為18 mg·kg-1。此外，對側相應區(qū)域肌肉組織T1WI、T2WI、T2*GRE信號無明顯變化，且與腫瘤組織變化趨勢不盡相同，信號差別明顯，在圖像上能夠得到較好的分辨。病理結果也表明，腫瘤組織中藍染鐵顆粒表達較豐富，而肝臟、脾臟中僅存在少量鐵顆粒染色，與MR圖像觀察結果一致。由此可以推斷出，本課題組制備的納米級分子探針(平均粒徑為7.37 nm)[12]，能夠大部分逃避網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)的吞噬，易于透過血管及組織間隙，并成功富集于腫瘤組織中，達到了實驗的預期目的。

圖6 各濃度組普魯士藍染色結果 ×400

Fig 6 Prussian blue straining images(×400)

(DepartmentofRadiology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

superparamagnetic iron oxide; molecular probe; magnetic resonance imaging; scanning concentration；nude mice

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