沈 璐， 易 高， 張春云， 方向明

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 廣東 廣州 517000)

熱休克蛋白90和糖皮質(zhì)激素受體mRNA在糖皮質(zhì)激素敏感型依賴型和抵抗型哮喘中的表達(dá)及其在抵抗型哮喘發(fā)病中的作用*

沈 璐， 易 高， 張春云， 方向明

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 廣東 廣州 517000)

目的：觀察糖皮質(zhì)激素抵抗型、敏感型、依賴型中熱休克蛋白90(HSP90)、糖皮質(zhì)激素受體(GR)mRNA表達(dá)情況，同時(shí)分析HSP90、GR mRNA在抵抗型哮喘發(fā)病中的作用，提高臨床不同類型哮喘患者治療效果。方法:以2015年7月至2016年8月間我院門診部門收治的86例哮喘患者為研究對(duì)象，根據(jù)患者對(duì)糖皮質(zhì)激素不同反應(yīng)分為敏感組(39例)、抵抗組(20例)、依賴組(27例)，同時(shí)隨機(jī)選取入院行健康檢查結(jié)果正常的受檢者為對(duì)比組(35例)，所有受檢者均空腹抽取外周血，使用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈(RT-PCR)測(cè)定熱休克蛋白90、GR mRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況，同時(shí)在體外分別以白介素4(IL-4)、白介素2(IL-2)以及聯(lián)合刺激細(xì)胞，記錄HSP90、GR mRNA表達(dá)改變情況。結(jié)果:抵抗組HSP90、GR mRNA細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯高于其他組，而HSP90/ GR明顯低于其他組，P<0.05；在IL-4、IL-2刺激下各組GR、HSP90 mRNA均出現(xiàn)不同的表達(dá)上升情況。結(jié)論:抵抗型哮喘者出現(xiàn)抵抗反應(yīng)可能與細(xì)胞中HSP 90表達(dá)不足有關(guān)。

哮 喘； 糖皮質(zhì)激素不同反應(yīng)型； HSP90； GR mRNA

哮喘是臨床常見的呼吸科疾病，主要癥狀為喘息、氣促、咳嗽、呼吸不暢等，疾病發(fā)作時(shí)對(duì)患者日常生活影響較大，不僅降低患者生活質(zhì)量，同時(shí)對(duì)工作、學(xué)習(xí)等均會(huì)造成困擾，近幾年隨著臨床對(duì)疾病研究的深入，發(fā)現(xiàn)通過預(yù)防、控制氣道高反應(yīng)、氣道炎癥，能有效改善患者癥狀[1]。其中糖皮質(zhì)激素是目前疾病常用藥，但臨床發(fā)現(xiàn)此藥用于治療時(shí)治療效果存在較大差異，部分患者對(duì)藥物會(huì)產(chǎn)生抵抗反應(yīng)，使疾病治療難度增加、引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥[2]。有研究表明抵抗型哮喘較敏感型，患者患病時(shí)間長(zhǎng)、年紀(jì)大、氣道反應(yīng)明顯增高，同時(shí)激素抵抗不僅會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)失衡，引發(fā)免疫性損傷，同時(shí)對(duì)外源性糖皮質(zhì)激素治療造成影響，降低藥物治療效果[3]。因此有效了解糖皮質(zhì)激素抵抗的原因，對(duì)臨床治療有重要意義。有研究表明藥物作用發(fā)揮與糖皮質(zhì)激素及其受體結(jié)合力有關(guān)，而HSP90對(duì)GR結(jié)合力有一定影響，因此本文探究對(duì)糖皮質(zhì)激素不同反應(yīng)類型哮喘者HSP90、GR mRNA表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1．1 一般資料:以2015.7～2016.8期間我院門診部門收治的86例哮喘患者為研究對(duì)象，患者無用藥禁忌癥，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的關(guān)于哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，近一個(gè)月未使用相關(guān)糖皮質(zhì)激素藥物，除對(duì)糖皮質(zhì)激素依賴型的哮喘患者。根據(jù)患者對(duì)糖皮質(zhì)激素不同反應(yīng)分為敏感組(SS)、抵抗組(SR)、依賴組(SD)，其中抵抗型評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：患者持續(xù)1周口服潑尼松40mg，經(jīng)1s用力呼氣容積(FEV1)測(cè)評(píng)值在15%以下；依賴型評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：患者持續(xù)2年以上每天需要服用相當(dāng)潑尼松10mg以上的糖皮質(zhì)激素藥物才能控制癥狀。其中男38例，女48例，年齡29～58歲，平均年齡(41.7±3.8)歲，患病時(shí)間1～12年，平均時(shí)間(7.5±1.2)年；敏感組(39例)、抵抗組(20例)、依賴組(27例)。同時(shí)隨機(jī)選取入院行健康檢查結(jié)果正常的受檢者為對(duì)比組(35例)，男16例，女19例，年齡31～62歲，平均年齡(42.3±3.5)歲，四組受檢者性別、年齡等一般資料相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 儀器、材料、方法

1.2.1 本次研究所有儀器、材料：重組人白細(xì)胞介素-2以及白細(xì)胞介素-4(PEPROTECHEC LTD 英國(guó))，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(HARRIS 美國(guó))，總RNA提取試劑(BOEHRINGERMANNHEIM 美國(guó))Twin Block System PCR儀(ERICOMP 美國(guó))，凝膠圖像掃描儀及分析系統(tǒng)(UVI 英國(guó))，RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO 美國(guó))，GR、HSP 90內(nèi)參照磷酸丙糖脫氫酶(GAPDH)特異性引物由北京賽百盛生物公司合成。

1.2.2 樣本獲取方法：所有哮喘者空腹靜脈取血10mL，置入抗凝管中，用1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞將細(xì)胞調(diào)到1×106L-1/mL后，將樣血分為兩個(gè)部分，一個(gè)經(jīng)離心處理去上清液并加入總RNA提取試劑1mL，放于-20℃環(huán)境中保存；一個(gè)行體外培養(yǎng)，將細(xì)胞懸液在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入1mL，本次設(shè)置空白組、IL-2組、IL-4組以及IL-2聯(lián)合IL-4組，每個(gè)標(biāo)本用4孔，1孔留白，其他分別加入IL-4、IL-2、IL-2聯(lián)合IL-4，加入量為50U/mL，將培養(yǎng)板放于37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，后取1.5mL于離心管中，經(jīng)離心處理取沉淀細(xì)胞，加入總RNA提取試劑1mL，放于-20℃環(huán)境中保存。

1.2.3 檢測(cè)方法：總RNA提取：將上述獲取的RNA稀釋后使用紫外分光光度儀測(cè)定260、280nm吸收值，鑒定純度并測(cè)定濃度；RT-PCR：在0.5mL PCR薄壁管內(nèi)混合下列成份，9μL總RNA樣本，5μL5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，5μL4×dNTP，3μL二硫蘇糖醇，1μL RNasin，1μL Oligo(dT)15，1μL M-MLV，混合均勻后在37℃環(huán)境中放置1 h，并以98℃溫度加熱5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR：在0.5 mL PCR薄壁管中加入以下反應(yīng)體系，5μL10×PCR緩沖液，0.5μL3′-目的引物，0.5μL5′-目的引物，3μLMgCl2，5μL4×dNTP，0.5μL3′-GAPDH引物，2μLTaq DNA聚合酶，3μLRT- PCR，最后加入31μL去離子水以及石蠟油30μL，使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，在95℃溫度變性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，同時(shí)HSP 90需要循環(huán)25次，而GR需要循環(huán)28次。 PCR產(chǎn)物掃描分析：將2μL緩沖液、10μL產(chǎn)物混合后上樣，在2%脂糖凝膠上電泳，將結(jié)果拍成黑白照片，并在凝膠圖像掃描儀上掃描，觀察記錄DNA擴(kuò)增帶密，同時(shí)將內(nèi)參照提供的擴(kuò)增片段密度比值為定量指標(biāo)，對(duì)比所得到的目的DNA擴(kuò)增片段密度。

1.3 觀察指標(biāo):觀察對(duì)糖皮質(zhì)激素不同反應(yīng)的哮喘組以及正常者的對(duì)比組，其細(xì)胞中熱休克蛋白90、GR mRNA表達(dá)情況，同時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)HSP90、GR mRNA分別以白介素4(IL-4)、白介素2(IL-2)以及聯(lián)合刺激后，表達(dá)改變情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組受檢組HSP90、GR mRNA細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況比較 抵抗組HSP90、GR mRNA細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯高于其他組，而HSP90/ GR低于其他組，P<0.05見表1。

表1 各組HSP90、GR mRNA變化情況

注：與對(duì)比組比較，aP<0.05；與抵抗組比較，bP<0.05；與依賴組比較，cP<0.05

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)GR mRNA在白介素2、白介素4刺激下變化情況統(tǒng)計(jì) 除對(duì)比組，所有哮喘著在IL-4、IL-2聯(lián)合刺激時(shí)，GR mRNA表達(dá)明顯上升，P<0.05，具體見表2。

表2 白介素2、白介素4刺激細(xì)胞GR mRNA變化情況

注：與空白組比較，aP<0.05

2.3 各組細(xì)胞內(nèi)HSP90 mRNA在白介素2、白介素4刺激下變化情況統(tǒng)計(jì):依賴組、敏感組在IL-4、IL-2聯(lián)合刺激下HSP90mRNA表達(dá)升高，其他組細(xì)胞內(nèi)HSP90mRNA無明顯改變，具體見表3。

表3 白介素2、白介素4刺激細(xì)胞HSP90 mRNA變化情況

注：與空白組比較，aP<0.05

3 討 論

糖皮質(zhì)激素時(shí)近幾年臨床常用哮喘治療藥物，其通過降低氣道炎癥反應(yīng)，從而改善患者癥狀，但臨床發(fā)現(xiàn)部分患者對(duì)糖皮質(zhì)激素有抵抗反應(yīng)，對(duì)于這類患者若使用糖皮質(zhì)激素藥物治療，不僅無法改善患者癥狀，同時(shí)會(huì)造成患者免疫失衡[5]。因此了解GC抵抗的分子機(jī)制對(duì)臨床疾病治療有重要意義，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)GC需要與GR結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，而HSP90作為GR重要的伴侶蛋白，在GR形成以及功能作用中起重要作用。其與GR結(jié)合后，能促進(jìn)活化GR向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)；從而使GR在核內(nèi)解離后與DNA結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)GC發(fā)揮作用[6]。因此有學(xué)者提出細(xì)胞內(nèi)HSP90表達(dá)改變會(huì)影響GR活性，并間接影響GC作用，其表達(dá)降低可能為GC抵抗的原因。本次我們對(duì)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行觀察，有研究表明此細(xì)胞主要成分為淋巴細(xì)胞及少數(shù)單核細(xì)胞，其中T細(xì)胞占約80%以上，T細(xì)胞為機(jī)體免疫調(diào)節(jié)對(duì)象，同時(shí)也是機(jī)體免疫應(yīng)答的承擔(dān)者，因此能有效觀察HSP90表達(dá)對(duì)GC作用的影響[7]。

在本次研究中哮喘者HSP 90、GR mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)比組正常者，P<0.05，我們推測(cè)這可能由于在炎癥等病理狀態(tài)下HSP90出現(xiàn)應(yīng)激性增加，同時(shí)不同反應(yīng)組中以抵抗組HSP 90mRNA水平顯著高于其他組，結(jié)果提示HSP 90高水平表達(dá)可能與機(jī)體糖皮質(zhì)激素抵抗有關(guān)，過量HSP 90可能使有效GC數(shù)目減少，從而導(dǎo)致機(jī)體GC抵抗。有研究表明HSP 90不僅能改變GR活性、決定GC作用的特異性和敏感性，同時(shí)HSP 90水平升高能夠負(fù)性調(diào)節(jié)GC反應(yīng)，其同樣在GR解離、GC循環(huán)方面起重要作用[8]。本次研究結(jié)果顯示僅抵抗組細(xì)胞中HSP 90與GR相比時(shí),表達(dá)程度是相對(duì)降低的，其他組細(xì)胞中GR表達(dá)上升時(shí)HSP90表達(dá)也呈上升。我們推測(cè)HSP90可在一定程度上決定GC作用的敏感度,由此我們推測(cè)糖皮質(zhì)激素抵抗型患者出現(xiàn)抵抗反應(yīng)可能是由于細(xì)胞中HSP 90表達(dá)相對(duì)不足造成。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在哮喘患者支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)IL-2和IL-4呈高表達(dá)，因此我們推測(cè)IL-4、IL-2在哮喘形成過程中起重要作用，同時(shí)有研究表明體外IL-2、IL-4聯(lián)合刺激可誘導(dǎo)PBMC中GR受體數(shù)量增加而GR與GC結(jié)合力降低[9]。本次研究顯示PBMC在以IL-2、IL-4刺激后，各組受檢者細(xì)胞中GR、HSP90 mRNA表達(dá)有升高,但對(duì)比組和哮喘不同反應(yīng)組表達(dá)升高有一定差異。我們推測(cè)這是由于IL-2、IL-4在促進(jìn)T細(xì)胞分化中不同作用以及PBMC激活狀態(tài)不同有關(guān)，同時(shí)在IL-2、IL-4聯(lián)合刺激下抵抗型、敏感型、依賴型患者中HSP 90 mRNA不同表達(dá),可能是造成HSP 90/GR比例失調(diào)的原因。

[1] 關(guān)艷春,張艷敏,方美云,等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者糖皮質(zhì)激素受體αmRNA、熱休克蛋白90 mRNA和巨噬細(xì)胞游走抑制因子蛋白表達(dá)及其與糖皮質(zhì)激素抵抗的關(guān)系[J].中華內(nèi)科雜志,2015,54(11):922～926.

[2] 錢小順,朱元玨,許文兵,等.熱休克蛋白90和糖皮質(zhì)激素受體比例失衡對(duì)哮喘患者T淋巴細(xì)胞凋亡的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2001,81(24):1496～1499.

[3] 馬亮亮,梁燕,方美云,等.原發(fā)免疫性血小板減少癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞熱休克蛋白90的表達(dá)及與激素療效相關(guān)性分析[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2012,06(6):1396～1400.

[4] 錢小順,朱元玨,許文兵,等.糖皮質(zhì)激素敏感型、依賴型和抵抗型哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素受體和熱休克蛋白90 mRNA表達(dá)的研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志(英文版),2001,114(10):1051～1054.

[5] 錢小順,朱元玨,許文兵,等.哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中熱休克蛋白90和糖皮質(zhì)激素受體mRNA的表達(dá)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2001,24(7):425～428.

[6] 馬亮亮,梁燕,方美云,等.糖皮質(zhì)激素受體和熱休克蛋白90與原發(fā)免疫性血小板減少癥患者糖皮質(zhì)激素抵抗關(guān)系的研究[J].中華血液學(xué)雜志,2012,33(9):733～737.

[7] 李穎,劉冀衡,劉競(jìng),等.熱休克蛋白70、熱休克蛋白90基因在急性淋巴細(xì)胞白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)及其與糖皮質(zhì)激素抵抗的關(guān)系[J].中國(guó)醫(yī)師雜志,2013,15(4):486～489.

[8] 黃瑩,趙重波,朱雯華,等.重癥肌無力患者外周血白細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體α、βmRNA表達(dá)與激素療效的關(guān)系[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012,39(1):31～35.

[9] 張育才,左文瓊,龔小慧,等.內(nèi)毒素性休克大鼠肺組織糖皮質(zhì)激素受體mRNA的表達(dá)[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2010,19(2):136～139.

1006-6233(2017)06-0968-04

廣東省中醫(yī)藥局科研課題，(編號(hào)：20141174)

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10.3969/j.issn.1006-6233.2017.06.026