荊 嬌， 張永忠， 閆文升， 馬海玲， 張玉清， 焦宗偉

(石家莊醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校, 河北 石家莊 050000)

辛伐他汀對腎缺血再灌注損傷大鼠腦組織OFR NO和NOS的影響*

荊 嬌， 張永忠， 閆文升， 馬海玲， 張玉清， 焦宗偉

(石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校, 河北 石家莊 050000)

目的：觀察辛伐他汀對腎缺血再灌注損傷后對腦組織的影響及影響機(jī)制。方法：復(fù)制腎缺血再灌注損傷(RIRI)模型(10%水合氯醛腹腔麻醉,打開腹腔，暴露雙側(cè)腎動靜脈,用動脈夾夾閉雙側(cè)腎動靜脈,45min后去除動脈夾恢復(fù)血流,然后再逐層縫合腹壁)。隨機(jī)將36只大鼠分為3組:假手術(shù)組;腎缺血再灌注組;辛伐他汀組。每組12只。檢測血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量,檢測腦組織丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性以及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:與假手術(shù)組比,缺血組血清Scr、BUN水平升高(P<0.05)腦組織MDA、NO含量以及iNOS活性均都升高(P<0.05),而SOD活性明顯下降(P<0.05)。與缺血再灌注組比較,辛伐他汀組血清SCr、BUN水平降低(P<0.05)和腦組織MDA的含量降低(P<0.05),iNOS活性亦降低(P<0.05),SOD活性和NO含量增加(P<0.05)。腎缺血再灌注組eNOS蛋白含量與假手術(shù)組相比增加(P<0.05),與腎缺血再灌注損傷組相比,辛伐他汀組eNOS蛋白含量增加(P<0.05)。結(jié)論:辛伐他汀對腎缺血再灌后腦組織的損傷有一定的保護(hù)作用。其機(jī)制與辛伐他汀可以清除自由基,降低iNOS含量,提高eNOS的表達(dá),同時增加NO含量有關(guān)。

辛伐他汀； 氧自由基； 一氧化氮； 一氧化氮合酶

他汀類(statins) 藥物是三羥基三甲基戊二酰輔酶A (HMG-COA)還原酶抑制劑。自1976 年Endo等[1]于桔霉素提取液中發(fā)現(xiàn)了美伐他汀(mevastatin) ,隨后洛伐他汀(lovastatin ) 等他汀類藥物相繼問世。他汀類藥物通過對該酶特異性抑制作用, 使HMG-CoA不能轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢u戊酸,從而阻斷膽固醇的合成，這一作用目前在臨床上廣泛用于高血脂的治療。近年來有研究發(fā)現(xiàn),普伐他汀預(yù)處理可以通過抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)腎缺血再灌損傷[2]。也有研究指出辛伐他汀可以參與腦血管的再生和組織的修復(fù)[3]。但辛伐他汀對腎缺血再灌后腦組織的影響少有報道。我們就此進(jìn)行了初步研究，通過建立腎缺血再灌注損傷模型，并用辛伐他汀干預(yù)，檢測血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量,檢測腦組織丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性以及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的蛋白表達(dá)水平。探討辛伐他汀對腎缺血再灌后腦組織的作用，結(jié)果如下:

1 材料與方法

1.1 實驗動物：健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只,體重160～230g,購自河北省實驗動物中心。

1.2 藥品與試劑：辛伐他汀，杭州上虞京新藥業(yè)有限公司提供；血清肌酐(SCr)、血清尿素氮(BUN)測試盒，購自北化康泰臨床試劑有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)試劑盒均購自南京建成生物制品公司；β-actin、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)購自Santa cruz biotechnology。

1.3 儀器：HW1電熱恒溫水溫箱；LXJ-Ⅱ離心機(jī)；GPR低溫低速離心機(jī)；EW-3000A電子天平；分析天平；721分光光度計；SN-682B全自動γ記數(shù)儀；DYY-Ⅲ型電泳儀；酶標(biāo)分析儀；超低溫冰箱；凝膠分析系統(tǒng)；X線攝影暗匣；塑料薄膜封口機(jī)；電熱保溫干燥箱；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.4 分組與模型建立：將大鼠在20～26℃實驗室喂養(yǎng)兩天,然后隨機(jī)分成3組:①假手術(shù)組(Sham);②腎缺血再灌注組(IR);③辛伐他汀組(Sim)。每組12只。完全隨機(jī)分組方法如下：先將動物按1，2，3，4……36編號，在隨機(jī)數(shù)字表中第三行第一個數(shù)16為開始數(shù)，取數(shù)取36個隨機(jī)數(shù)，將對應(yīng)的隨機(jī)數(shù)放在鼠號下面，用隨機(jī)數(shù)除以組數(shù)3，余數(shù)為1歸為假手術(shù)組，余數(shù)為2歸腎缺血再灌注組，余數(shù)為3歸為辛伐他汀組，再進(jìn)行隨機(jī)分組調(diào)整完成分組。分組后,辛伐他汀組20mg·kg-1·d-1灌胃,持續(xù)2周。假手術(shù)和缺血組組每天給同量的自來水灌胃。2周之后復(fù)制模型。

復(fù)制模型，采用河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院的以往方法[4]，10%水合氯醛腹腔麻醉,剖腹手術(shù),雙側(cè)腎動靜脈暴露。IR組和Sim組夾夾閉雙側(cè)腎動靜脈,45min后去除動脈夾再恢復(fù)血流灌注,然后逐層縫合腹壁。Sham組開腹但不夾閉血管,其余相同。再灌后24h各組分別腹主動脈取血4～5mL，分離留取血清于冰箱中低溫保存，待測定血清Scr、BUN含量。

斷頭取腦[5]用大鼠斷頭器迅速斷頭并將其置預(yù)先準(zhǔn)備的冰盤內(nèi)降低溫度，在冰浴中快速開顱，剪掉顱骨表面的皮膚和肌肉組織，用咬骨鉗咬開枕骨大孔及枕骨，暴露腦干和小腦以及頂骨后緣，用鉗夾每側(cè)頂骨后緣向兩側(cè)搬開頂骨，暴露兩側(cè)大腦半球，然后用咬骨鉗咬掉兩側(cè)顳骨及部分額骨大部分，露出腦組織。用眼科剪將腦干小腦側(cè)顱神經(jīng)剪斷并剪開硬腦膜，輕輕撬起腦干再剪斷顱底三叉神經(jīng)和視神經(jīng)將整個腦與顱底結(jié)構(gòu)分離，最后剝離嗅腦并取出完整腦，制備勻漿待檢測MDA,NO含量,SOD,iNOS的活力,以及eNOS的表達(dá)水平。

1.5 檢測方法：生化檢查:用苦味酸不除蛋白法完成血清Scr測定;BUN含量測定采用OPA法;采用nitrate reductase法測定NO含量,Thiopentone法測定MDA含量;xanthine oxidase法測定SOD活性;測定NO與親和性物質(zhì)生成有色化合物的吸光度,據(jù)其計算NOS活性; 各項指標(biāo)檢測方法嚴(yán)格按說明書操作。

腦組織勻漿制備 制備勻漿前除去組織血液，用濾紙吸干，準(zhǔn)確稱重。將干凈、干燥的勻漿管置于冰水混合物中，將組織塊放于勻漿管中，盡快剪碎組織，然后按1: 9(W/V)加入冰生理鹽水，將組織勻漿。而后將勻漿移入干燥的試管中，置于4℃離心機(jī)中，以3000r/min的速度離心10min。取上清液儲存待測。

Western blot 法檢測eNOS的表達(dá) 提取蛋白后灌膠上樣(30μg)，加樣后先用恒流(10 mA)，再用恒壓 (100 V) 電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。待電泳停止后，將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，轉(zhuǎn)移電壓為 100 V，時間120 min。然后將 PVDF膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下?lián)u床上搖動封閉2h。取出PVDF膜，加入稀釋后的一抗冰箱里4℃過夜。再用TBST室溫下脫色搖床上洗3次，每次10min。然后加入1:1000稀釋的辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體室溫孵育1h，用TBST室溫下脫色搖床上洗5次，每次10min。將顯色劑滴加于晾干的PVDF膜上，顯色照相。最后用quantity one軟件對條帶進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計分析：應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析和SNK檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 辛伐他汀對血清尿素氮和血清肌酐含量的影響(見表1)：與sham組比較，IR組腎功能受損,肌酐和尿素氮含量增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與IR組比較Sim組肌酐和尿素氮含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 辛伐他汀對腦組織SOD活性、MDA含量的影響(見表2)：與Sham組比較,IR組SOD活性降低(P<0.05),MDA含量升高(P<0.05)差異都有統(tǒng)計學(xué)意義。與IR組相比,Sim組SOD活性升高(P<0.0),MDA含量則降低(P<0.05)，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 辛伐他汀NO及iNOS的影響(Table2)：IR組NO含量和iNOS活力較Sham組比升高，兩組比較有差異(P<0.05);與IR組比較,Sim組NO含量升高,iNOS活力降低，差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)。

2.4 辛伐他汀對腎缺血再灌注后腦組織eNOS蛋白含量的影響：IR組eNOS蛋白含量較Sham組增加,與IR組比較,Sim 組eNOS蛋白含量明顯增加。

表1 辛伐他汀對血清尿素氮和血清肌酐含量的影響 ( ±s，n=12)

注：與辛伐他汀組比較△P<0.05 ； 與腎缺血*P<0.05vs腎缺血再灌注組

表2 辛伐他汀對腦組織活性的影響±s,n=12)

注：與辛伐他汀組比較△P<0.05；與腎缺血 *P<0.05vs腎缺血再灌注組

3 討 論

腎缺血再灌注損傷涉及多種因素,如自由基損傷、白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的作用、胞內(nèi)鈣的超載、NO等[6]。以往的研究指出[7],缺血缺氧可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和脂質(zhì)過氧化物增多,這是引起腎缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素之一。氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)氧自由基生成和去除失衡,或者由于外源性氧化劑超量攝入,導(dǎo)致活性氧(Reactive oxygen ROS)的積累而引起的毒性過程。在生理狀態(tài)下,機(jī)體產(chǎn)生超氧化物歧化酶能快速清除氧自由基等,防止氧自由基的過量積累。Laude K研究報道缺血再灌注期間可以產(chǎn)生的大量的OFR，這些過量的自由基經(jīng)過血液循環(huán)到達(dá)相應(yīng)的靶器官造成器官的損傷[8],雖然經(jīng)過循環(huán)后的OFR濃度有所降低,但產(chǎn)生的各種損失因子也可引起相關(guān)器官處OFR相對增加,而引起器官損傷。

本次實驗采用河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院的以往方法[4],復(fù)制腎缺血再灌注損傷模型(夾閉大鼠雙側(cè)腎動脈靜脈45min后去夾再灌注)，觀察再灌后24h各項指標(biāo)變化。結(jié)果表明,缺血再灌組腎功能明顯受損,肌酐和尿素氮高于假手術(shù)組(P<0.05)。辛伐他汀組肌酐和尿素氮含量明顯低于缺血再灌注組(P<0.05),動物模型復(fù)制成功。缺血再灌注后,腦組織中丙二醛含量增加,超氧化物歧化酶活性降低(P<0.05),而給予辛伐他汀后,丙二醛含量降低,超氧化物歧化酶活性顯著提高(P<0.05)。這說明辛伐他汀對腎缺血再灌注遠(yuǎn)程器官腦組織有一定的保護(hù)作用。

NO有內(nèi)外源性兩方面。前者主要來自NO的供體;后者由精氨酸和氧在NOS的作用下合成的。NOS有原生型和誘生型兩種。原生型NOS又包含內(nèi)皮細(xì)胞NOS(eNOS)和神經(jīng)源性NOS(nNOS)。內(nèi)皮細(xì)胞生成的eNOS 在正常生理情況下, 維持體內(nèi)一定量的NO產(chǎn)生,對機(jī)體調(diào)節(jié)血管緊張度和血壓、松弛支氣管平滑肌、抑制血小板聚集起重要作用[6～8]。一些研究表明他汀類藥使NO合成增加、活性增強[9,10]。Laufs U也指出NO則可能通過舒張血管,對抗內(nèi)皮素的作用,從而在腎缺血再灌注中發(fā)揮有益作用[11]。iNOS具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用,它可促進(jìn)NO的合成,后者可通過氧化應(yīng)激、損傷線粒體、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及胞內(nèi)鈣超載等途徑發(fā)揮作用,從而使組織受損。也有研究表明在生理情況下,機(jī)體內(nèi)NO和OFR處于動態(tài)平衡并無損傷作用,當(dāng)平衡破壞時,NO合成過多,NO與OFR生成羥自由基和過氧硝基陰離子,后者的細(xì)胞毒性比OFR更強,損傷作用也更強。 本實驗結(jié)果,腎缺血再灌注后腦組織明顯受損,iNOS 的表達(dá)上調(diào),產(chǎn)生過量的NO,生成的NO可能通過氧化應(yīng)激、損傷線粒體、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等途徑參與各種組織損傷的過程。辛伐他汀組eNOS 表達(dá),NO大量產(chǎn)生, 此時產(chǎn)生 NO 對則可能通過調(diào)節(jié)血管緊張度和血壓、松弛支氣管平滑肌等途徑改善受損的腦組織功能，具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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Effects of Simvastatin on OFR, NO and NOS in Brain Tissue of Rats with Renal Ischemia Reperfusion Injury

JINGJiao,ZHANGYongzhong,YANWensheng,etal

(ShijiazhuangMedicalCollege,HebeiShijiazhuang050000,China)

Objective:To observe the effect of simvastatin on brain tissue after renal ischemia reperfusion injury and its mechanism. Methods: A rat model of renal ischemia reperfusion injury (RIRI) was prepared by clamping the bilateral renal arteries for 45 minutes(10% chloral hydrate intraperitoneal anesthesia, open the abdominal cavity, exposed bilateral renal artery and vein, clamping the bilateral renal artery and vein with artery clamp, 45min after removal of the artery clamp to restore blood flow, and then suture the abdominal wall). 36 rats were randomly divided into the following groups, 12 rats in each group: sham operation group; renal ischemia reperfusion group; simvastatin group. Detection of serum creatinine (Scr), urea nitrogen (BUN), brain tissue malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) content, superoxide dismutase (SOD) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) activity in brain tissue was detected in endothelial nitric oxide synthase (eNOS) protein expression level. Results: Compared with the sham operation group, the contents of Scr, BUN, MDA, NO and iNOS activity in the ischemic group increased (P<0.05), while the activity of SOD decreased (P<0.05). Compared with the ischemia reperfusion group, the content of SCr, BUN and MDA decreased, iNOS activity was decreased (P<0.05), but the activity of SOD and the content of NO increased (P<0.05). The content of eNOS protein in renal ischemia reperfusion group was higher than that in sham operation group (P<0.05), and the content of eNOS protein in simvastatin group was higher than that in the renal ischemia reperfusion injury group (P<0.05). Conclusion:Simvastatin can protect the brain from ischemia reperfusion injury. It may be related to decreased the activity of iNOS, and increase the expression of eNOS protein and the content of NO.

Simvastatin; Oxygen free radical; Nitric oxide; Nitric oxide synthase

1006-6233(2017)06-0941-04

河北省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)指導(dǎo)性研究項目,(編號：Z2014020)

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.06.018