戚 挺， 蹤佳鵬， 閆洪超

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院， 江蘇 徐州 221000 2.江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科， 江蘇 徐州 221000 3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科， 江蘇 徐州 221000)

轉(zhuǎn)染ELF5mRNA對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡及周期的影響

戚 挺1， 蹤佳鵬2， 閆洪超3*

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院， 江蘇 徐州 221000 2.江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科， 江蘇 徐州 221000 3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科， 江蘇 徐州 221000)

目的：檢測(cè)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ELF5+EGFP后ELF5基因的表達(dá)，并觀察其對(duì)Ishikawa細(xì)胞凋亡情況及周期變化的影響。方法:通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細(xì)胞表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，設(shè)立實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核載體)、空質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP空載體)、空白對(duì)照組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞)。體外實(shí)驗(yàn)：用qRT-PCR法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中ELF5mRNA的表達(dá)情況，MTT法檢測(cè)ELF5mRNA對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞周期及凋亡情況，Western blot法檢測(cè)三組腫瘤組織的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P21及凋亡調(diào)控因子Caspase-3表達(dá)情況的變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：將三組細(xì)胞分別接種于NOD/SCID雌性裸鼠，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及測(cè)定成瘤能力，應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)三組腫瘤組織細(xì)胞凋亡的情況，采用蛋白印跡法檢測(cè)三組腫瘤組織的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P21及凋亡調(diào)控因子Caspase-3表達(dá)情況的變化。結(jié)果:重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ELF5+EGFP成功轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞；重組質(zhì)粒組細(xì)胞ELF5mRNA的表達(dá)明顯高于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重組質(zhì)粒組各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖能力較較其他兩組明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重組質(zhì)粒組G0/G1期的細(xì)胞比例均高于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重組質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率分別與空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重組質(zhì)粒組細(xì)胞中P21及Caspase-3的表達(dá)明顯高于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)的成瘤能力(瘤組織最大直徑、重量)明顯低于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)瘤組織細(xì)胞凋亡率分別與空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(9)重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)瘤組織P21及Caspase-3的表達(dá)明顯高于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:ELF5基因可抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖，將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與P21及Caspase-3有關(guān)。

ELF5基因； 卵巢癌細(xì)胞； 轉(zhuǎn) 染； 細(xì)胞周期； P21； Caspase-3； 細(xì)胞凋亡

子宮內(nèi)膜癌(Endometrial Cancer)是全球最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，在中國(guó)近年也有明顯的上升趨勢(shì)[1]。作為子宮內(nèi)膜癌的癌前病變，EIN(子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤樣病變)的級(jí)別越高，發(fā)展為子宮內(nèi)膜癌的機(jī)會(huì)越多。大約80%子宮內(nèi)膜癌早期手術(shù)治療是有效的，與其它腫瘤相比預(yù)后較好。但由于缺乏有效的早期診斷方法，許多患者錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī)。因此，積極尋求各種與子宮內(nèi)膜癌、EIN相關(guān)的指標(biāo)，以用于子宮內(nèi)膜癌及EIN的早期診斷和治療，已成為有關(guān)子宮內(nèi)膜疾病研究的熱點(diǎn)。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生涉及多基因、多步驟的復(fù)雜過(guò)程[2]，深入研究控制子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中關(guān)鍵基因的作用，對(duì)子宮內(nèi)膜癌的早期診斷、早期治療及預(yù)后有重要意義。近年來(lái)研究表明，ELF5是一個(gè)潛在腫瘤抑制因子，ELF5在乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著抑癌基因的作用[3]。而關(guān)于ELF5基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞周期與凋亡的影響及其可能的機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。本課題組前期研究成功構(gòu)建了含有ELF5基因的pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細(xì)胞表達(dá)載體[4,5]，并在預(yù)實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)：ELF5蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)明顯低于在子宮內(nèi)膜不典型增生組織及正常子宮內(nèi)膜組織。為了探討ELF5基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞周期與凋亡的影響和作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料:子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞由徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院提供；pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細(xì)胞表達(dá)載體由本課題組構(gòu)建并保存；Liptapfector脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物合成由日本TaKaRa公司提供；MTT試劑、AnnexinV-FITC流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技公司；ELF5一抗購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)換液，待細(xì)胞鋪板70%～80%時(shí)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染及分組:采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細(xì)胞表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞(重組質(zhì)粒組)，具體操作按Liptapfector 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性Ishikawa細(xì)胞并擴(kuò)增培養(yǎng)；同時(shí)以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP(空質(zhì)粒組)及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞(空白對(duì)照組)作為對(duì)照。

1.2.3 體外實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞ELF5mRNA的表達(dá)情況:轉(zhuǎn)染72h后收集3組細(xì)胞，按RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取總RNA，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。1μg總RNA加1μL DNase I去除DNA雜質(zhì)。取提純后RNA 2 μg按試劑盒說(shuō)明在冰上將各種反應(yīng)物混合形成20μL反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用delta-delta Ct法，再通過(guò)β-Actin的校正，最后對(duì)各組RNA中的ELF5mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ishikawa細(xì)胞，25%胰蛋白酶消化，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每組樣本設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h后每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，培養(yǎng)箱孵育4h，小心吸棄上清，每孔加入150μL DMSO，平板床搖勻(避光)，置酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光值(A490)，計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況:收集三組細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，加入2mL完全培養(yǎng)液終止消化，置于離心機(jī)1000rpm離心5min，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次(1000rpm，5min)，收集細(xì)胞于流式管中，加入500μL 的Binding Buffer 重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，混勻后室溫避光反應(yīng)5～15min，1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期:收集三組細(xì)胞，PBS洗滌、離心后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，70%乙醇固定，PBS洗滌后每管加入100μL RNAase A 37℃水浴30min，再加入400μL PI染液混勻，4℃避光30min，上機(jī)檢測(cè)，用Flow Jo軟件分析各組細(xì)胞周期的比例。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.5 Western免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá):取生長(zhǎng)期的三組細(xì)胞，分別于細(xì)胞裂解液(200μL)中冰上裂解，采用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳分離蛋白后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)，用封閉液進(jìn)行封閉實(shí)驗(yàn)后，加入1∶1000的ELF5一抗(兔抗人)，4℃過(guò)夜，與1∶10000的羊抗兔二抗室溫下反應(yīng)，加入化學(xué)發(fā)光試劑ECL，最后進(jìn)行曝光、顯影劑掃描。用Image J圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行掃描，各組細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)水平以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參(β-Actin)的灰度值的比值表示。

1.2.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：①動(dòng)物分組NOD/SCID雌性裸鼠(鼠齡4～6周)15只，隨機(jī)分為重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，每組各5只；飼養(yǎng)于恒溫(25～27℃)、恒濕(45%～50%)、新鮮空氣、高度除塵除菌及無(wú)特殊病原體的環(huán)境中，用滅菌處理的水和飼料供小鼠自由攝入。②動(dòng)物接種及處理:取生長(zhǎng)期的三組細(xì)胞懸液，按2×104/mL濃度分別接種于裸鼠右腋窩皮下，每周兩次觀察腫瘤生長(zhǎng)情況；待成瘤后取腫瘤組織，并測(cè)定其最大直徑及重量。并對(duì)瘤組織進(jìn)行HE染色觀察移植瘤組織的病理學(xué)特點(diǎn)。③TUNEL法檢測(cè)裸鼠體內(nèi)瘤組織細(xì)胞凋亡的情況:取三組細(xì)胞裸鼠體內(nèi)的瘤組織切片，常規(guī)脫蠟水合，0.3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，0.1mg/mL蛋白酶K消化40min，TdT反應(yīng)液、鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶(SP-HRP)37℃各作用1h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。具體操作按TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞并計(jì)算凋亡率。④Western blotting法檢測(cè)裸鼠體內(nèi)瘤組織P21、Caspase-3蛋白的表達(dá):取三組細(xì)胞裸鼠體內(nèi)的瘤組織，分別勻漿后提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)，用封閉液封閉后，加入1∶1000的ELF5一抗(兔抗人)，4度C孵育過(guò)夜，與1∶10000的羊抗兔二抗室溫下反應(yīng)，加入化學(xué)發(fā)光試劑ECL，最后進(jìn)行曝光、掃描。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ELF5+EGFP至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞:采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA3.1-ELF5+EGFP轉(zhuǎn)染至人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，感染48h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)較強(qiáng)，通過(guò)比較同一區(qū)域熒光視野和明視野下細(xì)胞熒光表達(dá)情況，可知細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率在80%以上。見(jiàn)圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染ELF5基因后Ishikawa細(xì)胞ELF5 mRNA表達(dá)的變化:實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)顯示，重組質(zhì)粒組細(xì)胞ELF5 mRNA的表達(dá)均高于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 pcDNA3.1-ELF5+EGFP轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞48h后熒光圖

A:對(duì)照組綠色熒光表達(dá);B:對(duì)照組細(xì)胞形態(tài);C:實(shí)驗(yàn)組綠色熒光表達(dá);D:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)

圖2 ELF5mRNA的表達(dá)情況

1.重組質(zhì)粒組；2.空質(zhì)粒組；3.空白對(duì)照組

2.3 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖的影響:MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間(24h、48h、72h)的增加，重組質(zhì)粒組細(xì)胞增殖抑制率較其他兩組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而空質(zhì)粒組與空白對(duì)照組比較，差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞增殖的影響±s)

*與重組質(zhì)粒組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

2.4 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后Ishikawa細(xì)胞周期的變化:流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組中(60.86±0.52)%的細(xì)胞阻滯于G0/G1期，分別與空質(zhì)粒組(33.78±0.34)%及空白對(duì)照組(32.37±0.47)%比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而空質(zhì)粒組與空白對(duì)照組比較，差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3，圖3。

表3 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期的影響

*與重組質(zhì)粒組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

圖3 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期的影響

A組：空白對(duì)照組；B組：空質(zhì)粒組；C組：重組質(zhì)粒組

2.6 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后Ishikawa細(xì)胞凋亡率的變化:流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒組凋亡率(38.03±1.40)%，較空質(zhì)粒組(17.07±0.28)%和空白對(duì)照組(19.27±0.55)%明顯增高(P<0.05)，而空質(zhì)粒組與空白對(duì)照組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后細(xì)胞凋亡的變化

注：A組：空白對(duì)照組；B組：空質(zhì)粒組；C組：重組質(zhì)粒組

2.6 轉(zhuǎn)染ELF5基因后Ishikawa細(xì)胞中P21、Caspase-3蛋白表達(dá)的變化:Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，P21、Caspase-3蛋白在重組質(zhì)粒組的表達(dá)均高于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 蛋白印跡法檢測(cè)三組細(xì)胞中P21、Caspase-3蛋白的表達(dá)

2.7 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的變化:裸鼠體內(nèi)瘤組織HE染色病理切片證實(shí)了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的致瘤性。裸鼠剖檢結(jié)果亦表明，重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)的成瘤能力(瘤組織最大直徑、重量)明顯低于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而空質(zhì)粒組與空白對(duì)照組比較，差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖6，表4。

圖6 子宮內(nèi)膜癌移植瘤HE染色病理切片(×20)

表4 各組瘤組織最大直徑、重量的比較±s，n=5)

*與重組質(zhì)粒組比較，P<0.05；*兩組間比較，P>0.05

2.8 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后各組移植細(xì)胞凋亡情況:TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率明顯高于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而空質(zhì)粒組與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖7、表5。

圖7 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后各組移植瘤細(xì)胞凋亡病理染色圖片(×200)

表5 TUNEL法檢測(cè)各組移植瘤細(xì)胞凋亡的比較

2.9 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后移植瘤組織中P21、Caspase-3蛋白表達(dá)的變化:Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組移植瘤組織中蛋白P21及Caspase-3的表達(dá)明顯高于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖8。

圖8 蛋白印跡法檢測(cè)各組移植瘤組織中P21、Caspase-3蛋白的表達(dá)

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌(EC)是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，是世界癌癥死亡的主要原因之一[6]，占婦科惡性腫瘤總數(shù)的7%，且發(fā)病率及死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)。早期患者以手術(shù)為主，術(shù)后根據(jù)高危因素選擇輔助治療。然而對(duì)于早期有生育要求的年輕患者來(lái)說(shuō)，手術(shù)并不是治療子宮內(nèi)膜癌的最佳選擇。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生涉及多基因、多步驟的復(fù)雜過(guò)程[7]，深入研究控制子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中關(guān)鍵基因的作用，對(duì)子宮內(nèi)膜癌的早期診斷、早期治療及預(yù)后有重要意義。

ELF5屬于Ets家族成員之一，ELF5位于人11號(hào)染色體短臂13-15區(qū)，這個(gè)區(qū)域在癌癥中易發(fā)生雜合性丟失，Elf5含有兩個(gè)可識(shí)別結(jié)構(gòu)域，一個(gè)所有ETS轉(zhuǎn)錄因子都包含的能夠與TTCC核心序列結(jié)合的基序和一個(gè)參與蛋白間相互作用的點(diǎn)結(jié)構(gòu)域，ELF5的完整結(jié)構(gòu)域包含參與蛋白間相互作用的結(jié)構(gòu)域、與蘇氨酸/半胱氨酸核心序列結(jié)合的基序及兩個(gè)共性結(jié)構(gòu)域。

本研究將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細(xì)胞表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染至人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，同時(shí)以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的人卵巢癌細(xì)胞作為對(duì)照，進(jìn)一步從多方面研究ELF5基因干預(yù)對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期及凋亡的影響，并探討其抑制癌細(xì)胞增殖及周期阻滯的可能機(jī)制。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，ELF5基因具有明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，ELF5基因可將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。在蛋白水平，重組質(zhì)粒組細(xì)胞P21及Caspase-3的表達(dá)明顯高于其它兩組，表明ELF5基因可能通過(guò)上調(diào)人子宮內(nèi)膜癌干細(xì)胞P21及Caspase-3的表達(dá)而影響細(xì)胞周期及凋亡。本研究裸鼠移植瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討了ELF5基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞周期及凋亡的影響。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)的成瘤能力明顯低于其它兩組，表明ELF5mRNA在體內(nèi)也可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)的細(xì)胞凋亡率高于其它兩組，表明ELF5基因在體內(nèi)也具有明顯的促腫瘤細(xì)胞凋亡作用。蛋白水平顯示，重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)瘤組織P21及Caspase-3的表達(dá)明顯高于其它兩組，表明ELF5基因在體內(nèi)也可通過(guò)上調(diào)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞P21及Caspase-3的表達(dá)而影響細(xì)胞周期及凋亡。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，ELF5mRNA對(duì)子宮內(nèi)膜癌增殖及周期有明顯影響，其機(jī)制可能與P21及Caspase-3有關(guān)。ELF5mRNA在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，這使得ELF5mRNA今后可能成為子宮內(nèi)膜癌基因治療的新靶點(diǎn)，這對(duì)降低子宮內(nèi)膜癌的病死率有著極其重要的意義。

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Effect of Transfection of ELF5 mRNA on Apoptosis and Cycle of Endometrial Carcinoma Cells

QITing,etal

(GraduateSchoolofXuzhouMedicalUniversity,JiangsuXuzhou221000,China)

Objective:To study the effects of ELF5 gene on cycles and apoptosis of human endometria cancer cells and its probable mechanism. Methods: The eukaryotic expression vectedical or pcDNA3.1-ELF5+EGFP was transfected into human endometria cancer cells in vitro (recombinant plasmid group), and positive cell clones were selected by G418 and amplified. Transfected pcDNA3.1-EGFP cells (empty plasmid group) and untransfected cells (blank control group) were served as control groups. In vitro, the cell prolifetraion ability of three groups was analyzed by MTT; the cycle and apoptosis was analyzed by flow cytometry; the expression of protein P21 and Caspase-3 was detected by Western blot. In vivo, three groups of cells were transplanted into NOD/SCID nude mice, and observed the growth ability of tumors; the apoptosis of tumors was determined by TUNEL; the expression of protein P21 and Caspase-3 in tumors was detected by Western blot. Results: The recombinant plasmid pcDNA3.1- ELF5+EGFP was successfully transfected into human endometria cancer cells; The expression of ELF5 mRNA in the recombinant plasmid group was higher than that in the empty plasmid group and blank control group (P<0.05); At each time point, the cell proliferation ability of the recombinant plasmid group was significantly decreased than that of the empty plasmid group and blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); The number of cells arrested in G0/G1phase of the recombinant plasmid group was higher than that of the empty plasmid group and blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); The apoptosis rate of the recombinant plasmid group was compared with the empty plasmid group and the blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); The expression of protein P21 and Caspase-3 in the recombinant plasmid group was higher than that in the empty plasmid group and blank control group (P<0.05). In vivo, the growth ability of tumors (maximum diameter, weight) in recombinant plasmid group was lower than that in the empty plasmid group and blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); In vivo, the apoptosis rate of the recombinant plasmid group was compared with the empty plasmid group and the blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); In vivo, the expression of protein P21 and Caspase-3 in the recombinant plasmid group was higher than that in the empty plasmid group and blank control group (P<0.05). Conclusions: ELF5 gene has obvious effects on cycles and apoptosis of human endometria cancer cells and its mechanism connected with the protein P21 and Caspase-3.

ELF5 gene; Endometria cancer cells; Transfection; Cell cycles; P21; Caspase-3; Apoptosis

1006-6233(2017)06-0889-06

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.06.04

*【通訊作者】閆洪超