魯統(tǒng)斌，高存良，郭璟璟

（山東省莒南縣人民醫(yī)院，山東 臨沂 276600）

白色念珠菌對(duì)人口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞凋亡和增殖的影響探討

魯統(tǒng)斌，高存良，郭璟璟

（山東省莒南縣人民醫(yī)院，山東 臨沂 276600）

目的探討分析白色念珠菌對(duì)人口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞（HOK，human oral keratinocytes）凋亡和增殖的影響。方法選取2015年8月-2016年8月期間我院66例體檢健康者頰黏膜，對(duì)HOK進(jìn)行培養(yǎng)，于菌絲型和孢子型白色念珠菌中加入制備的HOK，并分組，前者作為菌絲組，后者作為孢子組，而對(duì)照組則為單純HOK，通過(guò)對(duì)比研究的方式，探討白色念珠菌對(duì)HOK產(chǎn)生的影響。結(jié)果菌絲組凋亡率、G0/G1期、S期、G2/M期、PI與對(duì)照組、孢子組對(duì)比（P<0.05），而孢子組與對(duì)照組在凋亡率、G0/G1期、S期、G2/M期、PI方面對(duì)比，差異不明顯（P>0.05）。結(jié)論HOK的增殖和凋亡與白色念珠菌有著密切關(guān)系，其能夠引起HOK在調(diào)往率方面表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，改變HOK增殖周期。

人口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞；白色念珠菌；凋亡；增殖

0 引言

白色念珠菌（Monilia albican），存在于健康者時(shí)，并不會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生疾病，但是，存在于菌群之間的制約性失調(diào)或者免疫能力降低的人體，可誘發(fā)相應(yīng)疾病，有較強(qiáng)的致病性[1]，而對(duì)于口腔念珠菌病而言，病原菌中最為主要的則是白色念珠菌，同時(shí)，疾病具有反復(fù)不愈的特點(diǎn)，對(duì)人類健康生活造成影響，而HOK作為白色念珠菌侵襲的防御點(diǎn)[2]，目前臨床上對(duì)白色念珠菌對(duì)于HOK產(chǎn)生的作用研究報(bào)道較少，因此，本文則通過(guò)探討白色念珠菌對(duì)HOK增殖與凋亡造成的影響，內(nèi)容匯報(bào)如下：

1 材料與方法

1.1 材料

由中科院微生物研究所提供白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 11006）、HOK（體檢健康者，均為自愿提供，提取前未服用過(guò)藥品）、廣州市齊云生物技術(shù)有效公司生產(chǎn)的SDA（沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）、FBS（胎牛血清）、YPD固定培養(yǎng)基（沙堡瓊脂培養(yǎng)基干粉）、YPD液體培養(yǎng)基（沙堡液體培養(yǎng)基干粉），其余材料由我院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

（1）白色念珠菌[3]：于SDA中完成對(duì)ATCC 11006的培養(yǎng)，進(jìn)行三次轉(zhuǎn)種，根據(jù)0.5麥?zhǔn)綕岫?106CFU/ml的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)致病菌配置為懸浮液，而配置濃度則為3×105CFU/ml。（2）菌絲型白色念珠菌：將配置的白色念珠菌置于RPMI 1640培養(yǎng)基（pH：7.0、10%FBS）中進(jìn)行培養(yǎng)，于溫度為37℃的情況下，以靜止的方式，進(jìn)行3小時(shí)的培養(yǎng)，從而將菌絲型白色念珠菌誘導(dǎo)出。（3）孢子型白色念珠菌[4]：應(yīng)用劃線法的方式，將配置的白色念珠菌接種于YPD固體培養(yǎng)基，于37℃的溫度下，將乳白色奶油狀菌落，于離心管（15ml）中裝入YPD液體培養(yǎng)基，再將菌落轉(zhuǎn)種于離心管（轉(zhuǎn)速：200r/min、時(shí)間：18h、溫度：37℃），從而完成得到孢子型白色念珠菌的操作。（4）HOK[5]：嚴(yán)格按照無(wú)菌操作，對(duì)體檢健康者頰粘膜進(jìn)行切取，清洗則應(yīng)用PBS，實(shí)施11-12h的消化操作，從而得到上皮層，之后對(duì)其進(jìn)行3次漂洗操作后，混合消化液（0.02%EDTA:0.05%胰蛋白酶=1:1），進(jìn)行離心操作，置于培養(yǎng)箱（5%、37%二氧化碳飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱），待細(xì)胞生長(zhǎng)融合情況，達(dá)到80%培養(yǎng)皿時(shí)，實(shí)施傳代的培養(yǎng)操作，而本文實(shí)驗(yàn)應(yīng)用第二代細(xì)胞。（5）實(shí)驗(yàn)分組：選取2015年8月-2016年8月期間我院66例體檢健康者頰黏膜，對(duì)HOK進(jìn)行培養(yǎng)，其中男性34例、女性32例；年齡18-42歲、平均年齡（30.2±5.1）歲；HOK培養(yǎng)2d后，將培養(yǎng)液去掉，細(xì)胞貼壁，實(shí)施PBS3次清洗后，分為對(duì)照組、菌絲組、孢子組。

1.3 觀察指標(biāo)

周期細(xì)胞：G2/M期、S期、G0/G1期；PI（細(xì)胞增殖指數(shù)）：PI=[（S+G2/M）/G0/G1+S+G2/ M]×100%[6]；細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

菌絲組凋亡率、G0/G1期、S期、G2/M期、PI與對(duì)照組、孢子組對(duì)比（P<0.05），而孢子組與對(duì)照組在凋亡率、G0/G1期、S期、G2/M期、PI方面對(duì)比（P>0.05），詳見(jiàn)表1：

表1 三組觀察指標(biāo)結(jié)果對(duì)比

表1 三組觀察指標(biāo)結(jié)果對(duì)比

注釋：^與對(duì)照組、孢子組對(duì)比，^P<0.05，*與對(duì)照組對(duì)比，*P>0.05。

組別凋亡率（%）周期細(xì)胞PI G0/G1期S期G2/M期菌絲組3.88±0.37^35.01±5.22^9.25±2.03^19.85±2.16^45.98±2.86^孢子組2.15±0.52*47.35±6.30*6.37±1.45*13.49±2.39*25.52±3.16*對(duì)照組1.75±0.1350.31±5.255.78±1.1911.39±2.1622.50±2.79

3 討論

白色念珠菌是臨床上的一種真菌，常常于陰道、上呼吸道、口腔等中存在，可通過(guò)大量的繁殖、將生長(zhǎng)形式改變?yōu)檠可z相，從而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行侵襲，引發(fā)疾病，而菌絲型、孢子型是白色念珠菌的兩種形態(tài)，后面一種形態(tài)可向菌絲型轉(zhuǎn)化，可通過(guò)對(duì)口腔黏膜上皮的黏附、侵襲及破壞作用，損傷HOK，最終導(dǎo)致患者發(fā)生口腔念珠菌病。細(xì)胞凋亡在臨床上又被稱之為細(xì)胞程序化死亡，與細(xì)胞壞死相反，過(guò)程具有主動(dòng)性，常常于腫瘤發(fā)展、組織退化等中存在，對(duì)基因可發(fā)揮調(diào)控、表達(dá)、激活等作用，而在口腔黏膜一些病損組織中有膠樣小體，因此，口腔病變、細(xì)胞凋亡，兩者之間有著相關(guān)性，細(xì)胞增殖的方式為分裂，是生物體發(fā)育、生長(zhǎng)、遺傳、繁殖基礎(chǔ)，而口腔黏膜癌前病變與口腔黏膜上皮出現(xiàn)異常增生現(xiàn)象有著關(guān)聯(lián)性。細(xì)胞周期可分為M期、G1期、S期、G2期、G0期，其中S期表示DNA的合成期，通過(guò)情況下，G2/M期比例比較高，而S期細(xì)胞繁殖比較旺盛，而PI表明細(xì)胞增殖情況，反應(yīng)出細(xì)胞繁殖能力[7-8]，而從本文表1研究結(jié)果可知，在HOK細(xì)胞增殖中，菌絲型白色念珠菌具有促進(jìn)的作用，分析其中的機(jī)制可能是由于細(xì)胞從G1期轉(zhuǎn)變?yōu)镾期，從而使DNA合成方面加速，最終導(dǎo)致S期、G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表現(xiàn)出顯著增高的情況，從而也就有菌絲組PI顯著高于對(duì)照組和孢子組（P<0.05）的結(jié)果，而菌絲組細(xì)胞凋亡率明顯比對(duì)照組和孢子組高（P<0.05），提示，在HOK毒性方面，菌絲性白色念珠菌優(yōu)于孢子型，能夠?qū)OK凋亡加快。

綜上所述，菌絲型白色念珠菌對(duì)HOKG0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的下降、S期、G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的升高具有誘導(dǎo)作用，能夠使HOK周期細(xì)胞發(fā)生改變，因而，菌絲型白色念珠菌能夠使細(xì)胞增殖指數(shù)增高，同時(shí)，對(duì)HOK凋亡率上升具有誘導(dǎo)的作用，因此，臨床針對(duì)口腔念珠病患者進(jìn)行治療時(shí)，可通過(guò)對(duì)菌絲型白色念珠菌的控制，選取治療方案和判斷療效。

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Effects of Candida albicans on apoptosis and proliferation of human oral mucosal epithelial cells

LU Tong-bin,Gao Cun-liang,GUO Jing-jing
(The People's Hospital of Junan County , Linyi, Shandong, China)

Objective:To study the analysis of candida albicans to human oral mucosal epithelial keratinocytes (HOK, human oral keratinocytes) apoptosis and proliferation. SelectionMethodsAugust 2015 - August 2016 during physical examination in 66 cases healthy buccal mucosa, to cultivate HOK, the hyphae and spores add preparation HOK, candida albicans and grouping, the former as hyphae group, the latter as the spore group, while the control group for pure HOK, through the way of comparative study, discusses the impact of candida albicans to HOK.ResultsApoptosis rate of mycelia group, G0 / G1 phase and S phase and G2 / M phase, PI, spore group compared with control group (P<0.05), while the spore group and control group in the apoptosis rate, G0 / G1 phase and S phase and G2 / M phase contrast, PI, no significant difference (P>0.05).ConclusionThe proliferation and apoptosis of HOK has close relationship with candida albicans, it can cause HOK in transferred to rate showed a rising trend, change the HOK proliferation cycle.

Oral mucosa epithelial keratinocytes; Candida albicans. Apoptosis; Proliferation

10.19335/j.cnki.2096-1219.2017.05.71