陶義華

摘 要：目的：建立一種用HPLC法測(cè)定注射用甲硫氨酸維B1中甲硫氨酸和維B1含量的新方法。方法：采用Kromasil氨基鍵合硅膠柱（250mm×4.6mm；5μm），以（0.02mol·L-1）磷酸二氫鉀溶液-乙腈（22：78）為流動(dòng)相，流速為1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，以外標(biāo)法測(cè)定。結(jié)果：在甲硫氨酸濃度20?g·mL-1～4mg·mL-1范圍內(nèi)，呈良好線性關(guān)系（r=1.0000），平均回收率（n=9）為99.7%；在維生素B1濃度2?g·mL-1～0.4mg·mL-1范圍內(nèi)，呈良好線性關(guān)系（r=0.9999），平均回收率（n=9）為99.8%。結(jié)論：方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于注射用甲硫氨酸維B1中兩組分的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法 甲硫氨酸 維生素B1 含量測(cè)定

注射用甲硫氨酸維B1是一種復(fù)方制劑，本品主要成分為甲硫氨酸和維生素B1。其中甲硫氨酸是人體必需氨基酸，但是人體內(nèi)又無(wú)法自行制造，需由飲食攝取。甲硫氨酸能輔助脂肪分解，幫助肝臟脂肪的代謝，預(yù)防肝臟及動(dòng)脈的脂肪堆積，而脂肪會(huì)阻礙血流到腦部、心臟及腎臟，還能組成抗脂肪肝形成的化合物⑴。保持血液流順通暢至腎臟、心臟、大腦等，抵抗人體內(nèi)臟受到自由基地侵害。維生素B1是人體能量代謝，特別是糖代謝所必需的。當(dāng)人體的能量主要來(lái)源于糖類(lèi)時(shí)，維生素B1的需要量最大。維生素B1還是維持心臟，神經(jīng)及消化系統(tǒng)正常功能所必需的⑵。

本品能改善肝臟功能，對(duì)多數(shù)的肝臟疾病，特別是急慢性肝炎、肝硬化，尤其對(duì)脂肪肝有特別的療效；并可用作肝內(nèi)膽積，酒精、巴比妥類(lèi)、磺胺類(lèi)藥物中毒時(shí)的輔助治療；還可以清除心腦血管的脂肪，治療動(dòng)脈硬化引起的各種疾病，并可作為治療神經(jīng)炎和心肌炎的輔助藥物。

WS-10001-（HD-1387）-2003甲硫氨酸維B1注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)⑶中含量測(cè)定項(xiàng)下維B1含量為重量法，甲硫氨酸含量為非水滴定法，考慮到實(shí)際操作中分別對(duì)兩組分進(jìn)行測(cè)定，耗時(shí)較長(zhǎng)，且維B1含量測(cè)定法用于定量重現(xiàn)性較差，為保證實(shí)際分析中的準(zhǔn)確方便，本文采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定甲硫氨酸維B1注射液中2種有效成分的含量，所用色譜條件可使2組分分離度符合規(guī)定。理論板數(shù)按維生素B1峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性較好。

1、儀器與試藥

Shimadzu LC-10Atvp型高效液相色譜儀及CLASS-VP色譜工作站，METTLER AE240型電子分析天平，維生素B1對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），甲硫氨酸對(duì)照品（購(gòu)買(mǎi)自晉州冀榮氨基酸有限公司），純度為99.8%；甲硫氨酸維B1注射液為自制（規(guī)格：5mL：甲硫氨酸100mg與維生素B1 10mg）（批號(hào)：050604，050605，050603）；磷酸二氫鉀為分析純；乙腈為色譜純；水為重蒸水。

2、色譜條件

色譜柱：Kromasil氨基鍵合硅膠柱（250mm×4.6mm；5μm）；流動(dòng)相：0.02mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-乙腈（22：78）；流速為1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，進(jìn)樣量10?l。用外標(biāo)法測(cè)定。

3、線性關(guān)系

分別精密稱取甲硫氨酸及維生素B1對(duì)照品各適量，加流動(dòng)相溶解并制成每1ml中含甲硫氨酸4mg、維生素B1 0.4mg的溶液，作為線性貯備液。精密量取貯備液0.5，5ml分別置100ml量瓶中，另量取2.5，5ml分別置10ml量瓶中，分別加流動(dòng)相稀釋并定容，加上貯備液得到5個(gè)線性溶液。取各線性溶液各10?l注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以兩次測(cè)定的峰面積平均值（A）對(duì)對(duì)照品濃度（C）進(jìn)行線性回歸，甲硫氨酸、維生素B1回歸方程分別為：

A = 7691.1C + 47097 r=0.9998

A= 34581C – 24647 r=0.9999

以上兩種成分的濃度分別在20?g·mL-1～4mg·mL-1和2?g·mL-1～0.4mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

4、穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述線性關(guān)系中甲硫氨酸濃度為2mg·mL-1和維生素B1濃度為0.2mg·mL-1的溶液，在放置0、2、4、8小時(shí)測(cè)定進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。甲硫氨酸峰面積的RSD為0.41%，維生素B1峰面積的RSD為0.70%，結(jié)果見(jiàn)下表：

結(jié)果表明溶液在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

5、儀器精密度試驗(yàn)

取上述線性關(guān)系中甲硫氨酸濃度為2mg·mL-1和維生素B1濃度為0.2mg·mL-1的溶液，重復(fù)5次，測(cè)定峰面積，甲硫氨酸峰面積的RSD為0.64%，維生素B1峰面積的RSD為0.53%（n=5），表明進(jìn)樣精密度良好。

6、日間精密度試驗(yàn)

取050604批樣品5瓶，精密稱定內(nèi)容物，混勻，精密稱取適量（約相當(dāng)于甲硫氨酸100mg），置50mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋并制成每1mL含甲硫氨酸2mg、維生素B1 0.2mg的溶液，平行2份，作為供試品溶液，照樣品含量測(cè)定項(xiàng)方法分別與第1、2、3、4、5d測(cè)定含量，5次測(cè)定含量的甲硫氨酸RSD為0.94%，維生素B1 0.78%。

7、回收率試驗(yàn)

精密稱取甲硫氨酸80，100，120mg（相當(dāng)于處方量的80%，100%，120%）各3份，分別精密加入維生素B1 8，10，12mg（相當(dāng)于處方量的80%，100%，120%）各3份，分別置50mL量瓶中，按照處方比例加入各種輔料，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，制成每1mL約含甲硫氨酸1.6，2.0，2.4mg和維生素B1 0.16，0.20，0.24mg的溶液，各精密量取10?l注入液相色譜儀，計(jì)算回收率。結(jié)果甲硫氨酸、維生素B1高、中、低3個(gè)濃度的回收率分別為100.09%、99.30%、99.81%；99.79%、99.55%、100.05%。RSD分別為0.53%、0.97%、1.07%；0.57%、0.73%、0.17%?？偟钠骄厥章剩╪=9）分別為99.7%，99.8%。

8、重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取050604批樣品適量（約相當(dāng)于甲硫氨酸100mg），置50mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并制成每1ml含甲硫氨酸2mg、維生素B1 0.2mg的溶液，平行測(cè)定5次含量，甲硫氨酸和維生素B1的平均標(biāo)示量的百分含量分別為101.3%，100.8%；RSD分別為0.50%，0.42%（n=5）。

9、樣品測(cè)定

分別取三批樣品各5瓶，精密稱定內(nèi)容物，混勻，各精密稱取適量（約相當(dāng)于甲硫氨酸100mg），置50mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋并制成每1mL含甲硫氨酸2mg、維生素B1 0.2mg的溶液，各平行2份，作為供試品溶液，另取甲硫氨酸對(duì)照品與維生素B1對(duì)照品適量，同法配制成每1mL中約含甲硫氨酸2mg和維生素B1 0.2mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。各精密量取10?l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。3批樣品的含量結(jié)果見(jiàn)表1。

10、討論

10.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

我們研制的樣品為凍干劑型，為更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量，我們對(duì)含量測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)。含量測(cè)定參考注射用水溶性維生素部版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)⑷中維生素B1含量測(cè)定的波長(zhǎng)214nm，我們對(duì)此波長(zhǎng)進(jìn)行驗(yàn)證，分別取甲硫氨酸和維生素B1對(duì)照品各適量，加流動(dòng)相溶解制成每1mL中含甲硫氨酸2mg和維生素B10.2mg的混合溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，并由二極管陣列檢測(cè)器得到2種成分的紫外光譜圖（圖2），根據(jù)兩組分的紫外光譜圖，考慮到兩組分均能有較強(qiáng)的響應(yīng)，因此確定本品含量測(cè)定波長(zhǎng)為214nm。從兩組分的HPLC圖中可看出（圖1），甲硫氨酸有較強(qiáng)的響應(yīng)，峰形良好，維生素B1也有較強(qiáng)的吸收，峰形良好，兩組分的分離度大于3.0，柱效均大于5000，系統(tǒng)適用性良好。

10.2 流動(dòng)相的選擇

注射用水溶性維生素部版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中維生素B1含量測(cè)定的色譜條件為：[以（0.02mol·L-1）磷酸二氫鉀溶液-乙腈（27：73），用10%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為5.3的溶液為流動(dòng)相，經(jīng)試驗(yàn)此色譜條件甲硫氨酸和維B1未完全分開(kāi)，分離度小于1.5，調(diào)節(jié)水相為（0.02 mol·L-1）磷酸二氫鉀溶液，不用調(diào)節(jié)水相的pH值，調(diào)節(jié)比例為水相：乙腈（22：78），在此條件下甲硫氨酸和維B1分離度大于3.0，兩主成分峰形較好，柱效均大于5000（見(jiàn)圖1）。

因此確定流動(dòng)相為：以（0.02 mol·L-1）磷酸二氫鉀溶液-乙腈（22：78）。

10.3 方法學(xué)考察及實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果顯示，本方法操作簡(jiǎn)便，快捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，一次進(jìn)樣即可得到2種成分的含量測(cè)定結(jié)果，且流動(dòng)相經(jīng)濟(jì)易得，便于在實(shí)際生產(chǎn)及檢驗(yàn)中使用，提高了工作效率。

參考文獻(xiàn)

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