陳鵬，江長青，申麗，陳國飛，尤田，江小成，李偉，

（1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 運動醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518036；2.深圳市坪山區(qū)婦幼保健院 檢驗科，廣東 深圳 518000；3.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院 骨科，廣東 深圳 518000）

肌腱損傷及肌腱缺損是臨床上常見的創(chuàng)傷性疾病[1]，肌腱移植是其主要的修復(fù)手段。自體肌腱不存在排斥反應(yīng)，是修復(fù)肌腱缺損的最好方法，也是臨床中最常用的肌腱移植替代物。但由于自體肌腱來源有限，很多情況下無法滿足臨床需要，尤其是多發(fā)韌帶損傷的患者。組織工程肌腱目前仍處于試驗階段，因其生物相容性及力學(xué)強度等難題仍未克服，尚無法大規(guī)模應(yīng)用于臨床[2]。同種異體肌腱來源相對比較充足，應(yīng)用方便，而且不對患者造成二次損傷，又可以根據(jù)患者的具體傷情選擇相應(yīng)長短、粗細(xì)的肌腱，所以同種異體肌腱移植是目前肌腱修復(fù)或重建的主要方法。

尋求生物活性好、力學(xué)強度高且免疫原性低的同種異體肌腱是目前需要解決的重點和難點問題。目前同種異體肌腱的制備方法主要有深低溫凍存法、深低溫凍存干燥法、乙醇浸泡法等[3]，但上述方法不能從根本上解決免疫原性和肌腱力學(xué)強度等問題。化學(xué)萃取是利用陰離子表面活性劑磷酸三丁酯(TBP)對肌腱組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理。本實驗深入探討不同次數(shù)化學(xué)萃取法在同種異體肌腱制備中的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

新西蘭大白兔，體重2.5～3.0 kg，雄性，共16只，由北京華阜康生物科技股份有限責(zé)任公司提供。將實驗動物平均分為四組：A組：萃取一遍；B組：萃取兩遍；C組：萃取三遍；D組：不經(jīng)任何處理。

1.2 實驗步驟

1.2.1 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)

動物房12 h晝夜交替，保持新西蘭大白兔自由飲水、進(jìn)食，溫度23℃～25℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)入實驗。

1.2.2 跟腱取材

新西蘭大白兔7%水合氯醛耳緣靜脈注射麻醉，后腿備皮，剪開腿部皮膚，暴露肌肉組織以及肌腱，分離肌肉充分暴露肌腱，剪下肌腱，注意避免操作過程中夾取或牽拉肌腱。

1.2.3 跟腱萃取

萃取方法：⑴肌腱于200 mL無菌蒸餾水中水平振蕩6h，無菌蒸餾水沖洗3遍；⑵4%Triton X-100約200 mL中水平振蕩12 h，無菌蒸餾水再次沖洗3遍；⑶重復(fù)第一步；⑷4%脫氧膽酸鈉液約200 mL中振蕩12 h，無菌蒸餾水沖洗3遍；⑸最后在無菌蒸餾水200 mL中水平振蕩12 h。

1.2.4 萃取頻率

A組：按方法萃取一遍；B組：按方法萃取兩遍；C組：按方法萃取三遍；D組：將未經(jīng)任何處理的去除結(jié)締組織的肌腱作為對照組。

1.2.5 肌腱組織HE染色

標(biāo)本經(jīng)固定及石蠟包埋后做成石蠟切片，行蘇木精-伊紅染色，再脫水封片，光鏡下觀察。

1.2.6 樣品導(dǎo)電處理及電鏡觀察

標(biāo)本用戊二醛固定及梯度酒精脫水后，浸入50%的乙腈溶液中，然后依次更換70%，80%，90%，95%、100%的乙腈溶液，每次浸泡 1 5～20 min，最后更換100%乙腈溶液。進(jìn)行真空干燥，靜置30 min。待樣品干燥，溫度升至室溫后，取出樣品。用真空噴鍍法。所用的儀器為真空噴鍍儀，樣品進(jìn)行旋轉(zhuǎn)活動，先噴碳，后噴金，噴鍍均勻，完成后電鏡下觀察。

1.2.7 生物力學(xué)檢測

肌腱拉伸斷裂強度檢測中，肌腱兩端用紗布包裹，然后將其固定在檢測儀兩端，檢測時用生理鹽水不斷噴濕肌腱，防止風(fēng)干對實驗結(jié)果造成影響。將肌腱拉伸至完全斷裂，拉伸速度為10 mm/min，在肌腱拉伸斷裂檢測過程中，用相應(yīng)軟件詳細(xì)記錄結(jié)果；在檢測肌腱拉伸斷裂延伸率過程中，延伸率計算方法為（拉伸斷裂長度-初始長度）/初始長度×100%[4]。

1.2.8 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)測定

用含0.2%膠原酶RPM I 1640液將四組肌腱標(biāo)本切碎后分別消化，分離獲得其中的細(xì)胞成分，將濃度調(diào)整為1×106/mL，作為刺激細(xì)胞；采取受體兔靜脈血，分離獲取其淋巴細(xì)胞，將濃度調(diào)整為1×106/mL，作為反應(yīng)細(xì)胞。將刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞分別等量混合培養(yǎng)，各組做6個復(fù)孔，混合培養(yǎng)7 d后，獲取細(xì)胞懸液，離心后將沉淀制片，行瑞姬氏染色，光鏡下計數(shù)總淋巴細(xì)胞數(shù) (約500個)及轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)化率計算方法如下：

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 =轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞數(shù)/計數(shù)的淋巴細(xì)胞總數(shù)×100%。

計算各組6個復(fù)孔轉(zhuǎn)化率并計算其均值，作為此組轉(zhuǎn)化率。分別取4只供體兔肌腱標(biāo)本及4只受體兔靜脈血試驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以（±s）形式表示，以SPSS 13.0統(tǒng)計軟件（SPSS公司，美國）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)

2.1.1 大體觀察

D組肌腱為表面光滑的長條狀乳白色組織，縱截面長徑3.6～4.7 mm，短徑1.0～1.6 mm，質(zhì)地較柔軟，彈性、韌性良好，肌腱完整無損；A組外觀與D組基本相同；B組肌腱為表面光滑的長條狀瓷白色組織，彈性及韌性稍遜于D組肌腱，基本完好無損；C組肌腱為無光澤的長條狀瓷白色組織，表面較粗糙，彈性及韌性明顯較D組肌腱差，部分肌腱纖維松散。

2.1.2 HE染色

A組肌腱束間可見疏松結(jié)締組織，膠原纖維平行排列成束；B組肌腱束間可見疏松結(jié)締組織，膠原纖維平行排列成束，偶可見膠原纖維中斷；C組肌腱束間隔不清，膠原纖維排列較混亂；D組肌腱束間可見疏松結(jié)締組織，膠原纖維平行排列成束，其間可見散在腱細(xì)胞（圖1）。

圖1 四組HE染色后肌腱束比較（×400）

2.1.3 電鏡觀察

A組肌腱：有少許殘留細(xì)胞，細(xì)胞無明顯腫脹，膠原纖維排列較規(guī)則，呈波浪形，部分肌腱纖維輕度腫脹，纖維間隙稍增大（圖2-A）。B組肌腱：無殘留細(xì)胞，膠原纖維排列較規(guī)則，大多呈波浪形，肌腱纖維之間相互交聯(lián)，部分纖維較腫脹（圖2-B）。C組肌腱：無殘留細(xì)胞，膠原纖維之間排列較紊亂，無規(guī)則形狀，纖維間相互交織，纖維腫脹明顯（圖2-C）。D組肌腱：細(xì)胞無腫脹，膠原纖維排列較規(guī)則、緊密，纖維粗細(xì)均勻，呈波浪形，纖維之間相互交織（圖2-D）。

圖2 四組掃描電鏡下肌腱比較（×1000）。

2.2 生物力學(xué)檢測

檢測結(jié)果見表1，肌腱拉伸斷裂強度(Pmax)、功耗(Wmax)、延伸率(＆max)各實驗組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)測定

C組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（1.21±0.19）%，顯著低于A組（5.36±0.54）%、B 組（3.84±0.36）%及D組（P＜0.05）；B組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率也低于A組（P＜0.05）（表2）。說明化學(xué)萃取法幾乎消除了肌腱的免疫源性，萃取次數(shù)越多，肌腱的免疫原性越低。

表1 四組肌腱生物力學(xué)檢測結(jié)果(n=4，±s)

表1 四組肌腱生物力學(xué)檢測結(jié)果(n=4，±s)

組別 Pmax(N) Wmax(J) ＆max(%)A 組 173±36 0.68±0.09 21.15±1.65 B 組 168±31 0.62±0.07 20.32±1.28 C 組 159±35 0.53±0.10 18.86±1.37 D 組 176±23 0.73±0.08 22.04±1.31 F值 0.379 0.957 2.844 P值 0.594 0.143 0.095

表2 四組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率結(jié)果(n=4，±s)

表2 四組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率結(jié)果(n=4，±s)

組別 轉(zhuǎn)化率（%）A組 5.36±0.54 B組 3.84±0.36 C組 1.21±0.19 D組 10.59±0.67 F值 0.247 P值 ＜0.001

3 討論

臨床中，肌腱移植在外科重建與修復(fù)中應(yīng)用廣泛，無論是運動醫(yī)學(xué)科還是手外科，對肌腱移植材料的需求都很大[3]。目前，肌腱移植材料主要分為自體肌腱、同種異體肌腱、組織工程肌腱以及人工肌腱等[6，7]。自體肌腱移植雖排斥反應(yīng)較小，但因其來源有限且有創(chuàng)，無法滿足臨床需要。同種異體肌腱來源廣泛，且不會造成新的創(chuàng)傷，近年來一直是組織工程研究中的熱點。

目前來說，限制同種異體肌腱應(yīng)用主要有兩方面因素。一是肌腱本身的免疫原性。若未經(jīng)免疫原性處理的肌腱植入受體內(nèi)，將會引起嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，導(dǎo)致手術(shù)失敗甚至危及受體生命安全。二是經(jīng)處理后肌腱的強度變化。本質(zhì)上說，肌腱在體內(nèi)就是起到力量傳遞作用，所以肌腱本身必須保持一定的抗拉伸強度及韌度，若肌腱經(jīng)處理后強度下降較大，也將直接導(dǎo)致手術(shù)的失敗[4]。

本實驗中，A組及B組均與D組有相似的形態(tài)、色澤及拉伸斷裂強度。實驗組在很大程度上保留了肌腱纖維強度的同時，去除了肌腱的免疫原性，使其能夠被異體接受。HE染色及電鏡下觀察，C組肌腱纖維組織破壞較嚴(yán)重，肌腱纖維排列紊亂，而萃取一遍及二遍組肌腱的纖維可以得到較完整的保留。

肌腱移植材料最重要的是要具備良好的生物力學(xué)性能，這樣才可以減少手術(shù)過程中縫合時的撕裂程度[3]，進(jìn)而減少術(shù)后再斷裂的概率，降低手術(shù)失敗率[8,9]。本實驗中通過力學(xué)實驗測試來探討經(jīng)不同萃取次數(shù)制備的肌腱對其生物力學(xué)性能有無影響，四組肌腱的Pmax、Wmax和＆max的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，表明四組間力學(xué)強度未見明顯差異，化學(xué)萃取法制備的肌腱能夠較好地保留肌腱的生物力學(xué)性能。但萃取三遍組的各項數(shù)據(jù)均明顯低于其他組，可能由于樣本量不夠大或測試條件等因素，導(dǎo)致結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。

有研究表明CD 4+T，CD 8+T兩個淋巴細(xì)胞亞群參與機體免疫排斥反應(yīng)主要是通過細(xì)胞免疫和體液免疫兩個過程協(xié)同作用[10]，臨床上二者比值的變化常作為檢測移植物引起的排斥反應(yīng)的指標(biāo)[11]。本實驗中，混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，四組之間淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均有明顯差異，空白組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率最大，萃取三遍組轉(zhuǎn)化率明顯低于其他各組（P＜0.05），萃取二遍組轉(zhuǎn)化率明顯低于萃取一遍組。說明萃取次數(shù)越多，肌腱的免疫原性降低越明顯。

綜上所述，肌腱經(jīng)化學(xué)萃取法萃取二遍后，在保留了原有的肌腱纖維和良好的生物力學(xué)性能的同時，也明顯降低了其免疫原性，是一種相對較好的肌腱制備方法，為同種異體肌腱制備的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

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