張 強，韓素芹，王 瑞

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024）

四逆湯HPLC指紋圖譜研究

張 強，韓素芹，王 瑞

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024）

目的：建立四逆湯HPLC指紋圖譜，為科學(xué)評價四逆湯的質(zhì)量穩(wěn)定性和均一性及其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法：以傳統(tǒng)水提法制備的水煎液，采用HPLC色譜法，Waters-XTerra MS C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脫，檢測波長為260 nm，分析時間為70 min，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL。并采用“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件”對10批樣品進行相似度評價。結(jié)果：建立了四逆湯指紋圖譜，10批藥材的相似度均大于0.8。結(jié)論：建立的四逆湯HPLC指紋圖譜測定方法簡單，重復(fù)性較高，精密度良好，可用于控制四逆湯質(zhì)量的均一和穩(wěn)定。

四逆湯；高效液相色譜法；指紋圖譜

四逆湯出自《傷寒論》，由附子、炙甘草和干姜組成，作為回陽救逆的代表方劑［1］，用于少陰病陽衰陰盛，四肢厥逆，脈沉微細，神疲欲寐，惡寒倦臥，腹痛下利，嘔吐不渴，舌苔白滑等。其配伍精簡，收載于歷版中國藥典。在現(xiàn)代臨床中應(yīng)用廣泛，多用于救治急性腸胃炎吐瀉過度、心肌梗死、心力衰竭，或因誤汗、過汗所致休克等陽衰陰盛者［2］。近年來亦有相關(guān)文獻報道其質(zhì)量研究［3］。四逆湯作為中藥復(fù)方，其所含化學(xué)成分復(fù)雜、藥材質(zhì)量參差不齊、實際煎煮方法不同等諸多因素導(dǎo)致臨床應(yīng)用療效存在很大的差異［4］。為確保其質(zhì)量均一穩(wěn)定和臨床用藥安全有效，需建立可靠的質(zhì)量及療效評價方法［5］。中藥指紋圖譜在一定條件下能基本反映中藥化學(xué)成分的全貌，使其質(zhì)控標準提升，由對單一成分含量測定變?yōu)閷φ麄€中藥供試品內(nèi)在品質(zhì)的控制，實現(xiàn)對中藥內(nèi)在的質(zhì)量綜合評價和整體物質(zhì)的全面控制［6］。HPLC色譜法高效快速的分離能力有利于四逆湯指紋圖譜的建立和研究，有助于系統(tǒng)地表征四逆湯的質(zhì)量［7］。本文通過HPLC色譜法建立四逆湯的指紋圖譜，并比較10批樣品的相似度，為科學(xué)評價四逆湯質(zhì)量的均一穩(wěn)定以及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

戴安U-3000高效液相色譜儀（自動進樣器，三元泵，DAD檢測器）；國家藥典委員會推薦“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”（2004版）；FA224型號電子分析天平（上海舜宇恒平儀器有限公司）；SY-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ5200V型超聲波清洗機（昆明市超聲儀器有限公司）。

1.2 試 劑

甘草苷對照品（批號：111610-201106，中國藥品生物制品檢定所）；甘草酸對照品（批號：150419，上海融合醫(yī)藥科技有限公司）；甘草素對照品（批號：150510，上海融合醫(yī)藥科技有限公司）；甲酸、甲醇、鹽酸、醋酸銨均為分析純（天津市科歐密化學(xué)試劑有限公司），乙腈為色譜純（OCEANPAK公司），水為純凈水。

1.3 藥 材

四逆湯藥材（炮附子、干姜、炙甘草），炮附子經(jīng)山西中醫(yī)學(xué)院裴香萍副教授鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.子根的加工品，干姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖，炙甘草為豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖。供試藥材來源見表1，均符合2015版中國藥典要求。

表1 不同來源的四逆湯藥材

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters-XTerra MS C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫程序為5%：95%（0 min）→83%：17% （70 min）；檢測波長為260 nm，分析時間為70 min，進樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min，柱溫25℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取甘草苷、甘草素、甘草酸對照品適量，精密稱定后甲醇溶解配制成濃度為0.5 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取黑附片15 g，炙甘草6 g，干姜6 g，加10倍量水先浸泡30 min，煎煮30 min后倒出藥液，再加入8倍量水，煎煮20 min，合并水煎液，用紗布過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至250 mL，待藥液冷卻后定容于250 mL容量瓶中，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 對照試驗 取10 μL混合對照品溶液，注入高效液相色譜儀，色譜圖見圖1。

圖1 對照品HPLC色譜圖

2.3.2 精密度試驗 按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液1份，精密移取10 μL，按照“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰圖譜，并以10號峰（甘草素）作為內(nèi)參峰，進行對比分析。結(jié)果表明：其共有峰的相對保留時間RSD值均小于1.72%，相對峰面積RSD值均小于4.94%。

2.3.3 重復(fù)性試驗 按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，各精密移取供試品溶液10 μL，按照“2.1”項下色譜條件，分別進樣1次，記錄色譜峰圖譜，并以10號峰（甘草素）作為內(nèi)參峰，進行對比分析。結(jié)果表明：其共有峰的相對保留時間RSD值均小于1.96%，相對峰面積RSD值均小于4.88%。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液1份，精密移取四逆湯供試品溶液10 μL，按照“2.1”項下色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h時分別進樣分析，記錄色譜峰圖譜，并以10號峰（甘草素）為內(nèi)參峰，進行對比分析。結(jié)果表明：其共有峰的相對保留時間RSD值均小于2.71%，其相對峰面積RSD值均小于4.87%，說明四逆湯供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與相似度的分析

2.4.1 參照峰的選擇 甘草素為四逆湯中藥理活性成分之一，并且其含量較大，峰面積穩(wěn)定，易于辨認，分離度較好，因此選定甘草素峰作為HPLC指紋圖譜參照峰。

2.4.2 特征峰的確定 以10個不同來源的四逆湯為對象進行指紋圖譜研究。通過比較其紫外吸收光譜與保留時間的方法，確認其共有指紋峰包括甘草素（10號峰）在內(nèi)的15個共有色譜峰。通過比對其保留時間、比較紫外吸收光譜以及對照品加入法，指認了其中3個色譜峰，分別為甘草苷（9號峰）、甘草素（10號峰）、甘草酸（14號峰），色譜圖見圖2。

圖2 四逆湯對照指紋圖譜

2.4.3 指紋圖譜相似度評價 取10批樣品，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，分別進樣進行檢測分析，記錄指紋圖譜。將10批四逆湯的數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，生成對照指紋圖譜后對10批四逆湯對照分析，結(jié)果如圖3和表2所示，10批四逆湯樣品的相似度均大于0.8。

圖3 10批四逆湯指紋圖譜的相似度對比

3 討 論

3.1 流動相體系的選擇

在四逆湯HPLC指紋圖譜的建立過程中，首先選用流動相體系為0.1%醋酸銨溶液（pH=10）-乙腈進行分析，色譜峰較少，且醋酸銨溶液是緩沖鹽溶液，在有機溶劑比例較大時溶液易析出細小結(jié)晶，導(dǎo)致色譜柱堵塞。改用流動相體系0.1%甲酸水溶液-乙腈后，雖然色譜峰較多，但分離度不好，調(diào)整洗脫梯度也得不到改善。最終選用流動相體系為0.1%甲酸水溶液-甲醇，基線相對平穩(wěn)，色譜峰的數(shù)目較多，分離度良好，峰形較好，同時色譜峰的對稱性良好。

3.2 測定波長的選擇

實驗過程中，在波長250 nm下色譜峰的峰高和峰形相對較好，但是在波長250 nm下基線漂移嚴重。綜合考慮在波長260 nm下，基線較為平穩(wěn)，各色譜峰的峰形大小合適且分布均勻，可以較完全表達四逆湯中各類成分的出峰情況，因此選擇測定波長為260 nm。

3.3 試樣處理方法的選擇

四逆湯按照傳統(tǒng)煎煮方法得到的水煎液，采用了以下3種方法進行預(yù)處理：①水煎液直接進樣；②水煎液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，甲醇超聲溶解；③水煎液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，0.5%鹽酸甲醇超聲溶解。在甲醇和0.5%鹽酸甲醇液的指紋圖譜中，色譜峰較多，但分離度差；而四逆湯水煎液的峰形較好，基線平穩(wěn)，且臨床應(yīng)用為傳統(tǒng)水提法制得的水煎液，更加接近臨床應(yīng)用，可為臨床應(yīng)用以及質(zhì)量控制提供依據(jù)，所以選用水煎液直接進樣。

表2 10批四逆湯指紋圖譜的相似度對比

3.4 相似度的對比

在相似度對比過程中，購自10個不同藥店的10批四逆湯樣品的相似度均大于0.8。說明通過控制加水量和煎煮時間可以得到質(zhì)量穩(wěn)定均一的四逆湯，為臨床療效的穩(wěn)定提供依據(jù)。

［1］鄧中甲.方劑學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2011：138.

［2］謝鳴，周然.方劑學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：160.

［3］王躍生，李欣晴，饒毅，等.高效液相色譜法測定四逆泡騰片中甘草黃酮含量［J］.藥物分析，2012，32（12）：2 168-2 171.

［4］蘆葦，梁光義，楊玉琴，等.四逆湯HPLC指紋圖譜研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2013，24（3）：661-663.

［5］高志祥，姜寒笑，王巖，等.HPLC法同時測定四逆湯中3種有效成分的含量［J］.中國醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，40（7）：662-664.

［6］蔡寶昌.中藥分析學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：110.

［7］王海燕，周嚴嚴，容蓉，等.HPLC-MS聯(lián)用分析不同制法四逆湯中化學(xué)成分［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（22）：103-107.

（編輯：梁葆朱）

Study on fingerprint of Sini decoction

Zhang Qiang，Han Suqin，Wang Rui
（Shanxi College of TCM，Taiyuan Shanxi 030024）

Objective：To develop fingerprint of Sini decoction and provide basis for evaluating stability and homogeneity of Sini decoction and its clinical application.Method：Sini decoction was prepared by traditional water extraction.Waters-XTerra MS C18column（4.6 mm×150 mm，5 μm）was taken with methanol（A）-0.1%formic acid water solution（B）as mobile phase.The detection wavelength was set at 260 nm and analysis time was 70 minites.The flow rate was at 1.0 mL/ min and the sample size was 10 μL.10 batches of samples were carried similarity evaluation by computer aided similarity evaluation software for fingerprint of traditional Chinese medicine.Results：Fingerprint of Sini decoction was established and the similarity of 10 batches of medicinal materials was more than 0.8.Conclusion：The method is simple，good repeatability and precision，and can be used for the quality control of stability and homogeneity of Sini decoction.

Sini decoction；HPLC；fingerprint

R284.1

A

1671-0258（2017）02-0030-04

山西省科技廳項目（2015011103）；山西中醫(yī)學(xué)院博士基金項目

張強，在讀碩士研究生，E-mail：zhangfaith518@163.com

王瑞，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：wrgreentea@163.com