徐 通，張琰圖，張 緒

(延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,陜西 延安 716000)

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實(shí)驗(yàn)技術(shù)

流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定利福噴丁

徐 通，張琰圖*，張 緒

(延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,陜西 延安 716000)

基于堿性介質(zhì)中利福噴丁能增敏魯米諾-鐵氰化鉀體系的化學(xué)發(fā)光這一現(xiàn)象，結(jié)合流動(dòng)注射分析技術(shù)，建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定利福噴丁的新方法。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，利福噴丁檢測(cè)濃度的線性范圍為0.008～0.88 mg/L，檢出限(3σ)為1.2×10-3mg/L。對(duì)6.0×10-2mg/L的利福噴丁進(jìn)行平行測(cè)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=11)為1.9%。該方法已用于測(cè)定膠囊和血漿中利福噴丁的含量，結(jié)果滿意。

流動(dòng)注射；化學(xué)發(fā)光；魯米諾；鐵氰化鉀；利福噴丁

利福噴丁(Rifapentine，RFT)是一種利福霉素衍生物，在血液中具有較長(zhǎng)的半衰期，與利福平相比，其抗結(jié)核分枝桿菌性更強(qiáng)[1-2]，加之用藥頻率少且療效顯著，在臨床上廣泛用于結(jié)核病的治療，在動(dòng)物模型中也顯示出良好的治療潛伏性結(jié)核病的前景[3-5]。但該藥具有肝腎毒性，尤其損害肝功能，過(guò)量或長(zhǎng)期服用還可能導(dǎo)致貧血、脫發(fā)等癥狀[6]，故建立此藥品含量的簡(jiǎn)單、快速、靈敏的檢測(cè)方法十分必要。

目前測(cè)定RFT的主要方法有高效液相色譜(HPLC)法[7]、反相高效液相色譜(R-HPLC)法[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法[9]以及薄層色譜-紫外分光(TLC-UV)法[10]等。其中，HPLC法樣品處理復(fù)雜且儀器價(jià)格昂貴，且其流動(dòng)相中的非揮發(fā)性緩沖鹽很難去除，導(dǎo)致LC-MS 聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用受到限制；TLC-UV法雖儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果較為準(zhǔn)確，但靈敏度低，操作繁瑣[11]。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法(FI-CL)作為流動(dòng)注射技術(shù)與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的一種新的分析方法[12]，因分析成本低、分析速度快、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥[13]、環(huán)境[14]、食品[15]等各個(gè)領(lǐng)域。

研究發(fā)現(xiàn)，在堿性介質(zhì)中，RFT的加入能明顯增強(qiáng)魯米諾-鐵氰化鉀體系的化學(xué)發(fā)光，且RFT在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系。本文結(jié)合流動(dòng)注射分析技術(shù)，建立了一種測(cè)定利福噴丁含量的新方法。本方法線性范圍寬，檢出限較文獻(xiàn) [7]降低了1 000倍，已成功應(yīng)用于藥物膠囊和人血漿中RFT含量的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

IFFM-E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁公司)；AUY220分析天平(日本島津公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(上海精密儀器儀表有限公司)；H1650臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；F-4500熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；8453型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司)。

RFT(中國(guó)藥品生物制品檢定所)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 g/L)：準(zhǔn)確稱(chēng)量10.0 mg RFT標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，加適量甲醇溶解后用水定容至100 mL容量瓶中，搖勻后置于冰箱中4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)逐級(jí)稀釋至所需濃度。

Luminol儲(chǔ)備液(0.01 mol/L )：稱(chēng)取0.443 0 g魯米諾固體，用0.1 mol/L NaOH溶解后加水定容至250 mL棕色容量瓶中，置于冰箱中4 ℃下保存，避光放置1周后使用。

K3Fe(CN)6儲(chǔ)備液(0.01 mol/L)：稱(chēng)取0.329 3 g鐵氰化鉀固體，用水溶解并定容至100 mL 棕色容量瓶中，使用時(shí)逐級(jí)稀釋。

本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析法測(cè)定RFT流路圖Fig.1 Schematic diagram of the flow injection chemilumine-scence determination of RFTP1,P2:peristaltic pump;V:sample valve;F：flow cell;PMT： photomultiplier;PC：computer;W：waste;a：carrier(water); b：K3Fe(CN)6;c：luminol;d：NaOH

圖2 化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Kinetic curves of CL reactions c(luminol)=1.0×10-4 mol/L;c[K3Fe(CN)6]=5.0×10-5 mol/L;c(NaOH)=0.4 mol/L;ρ(RFT)=1.0 mg/L

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

啟動(dòng)流動(dòng)注射分析系統(tǒng)，將各溶液按圖1所示分別泵入相應(yīng)管道，待基線穩(wěn)定后，注入樣品溶液。溶液經(jīng)六通閥(V)混合，在流通池(F)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生的化學(xué)信號(hào)經(jīng)光電倍增管(PMT)放大檢測(cè)，以相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(ΔI=IS-I0)進(jìn)行定量分析。其中I0為未加入樣品時(shí)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，IS為加入樣品后的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線

圖2為L(zhǎng)uminol-K3Fe(CN)6和Luminol-K3Fe(CN)6-RFT混合液的化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線。從圖中可以看出，RFT的加入可使Luminol-K3Fe(CN)6體系的發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)3倍左右。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.2.1 反應(yīng)物混合方式的選擇 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)物的混合方式會(huì)對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度產(chǎn)生一定影響，為了使RFT對(duì)Luminol-K3Fe(CN)6體系的增敏程度最大，考察了以下3種進(jìn)樣方式的影響：①[RFT+K3Fe(CN)6]+(Luminol+NaOH)；②(RFT+NaOH)+[Luminol+K3Fe(CN)6]；③(RFT+Luminol)+[NaOH+K3Fe(CN)6]。結(jié)果表明，第1種進(jìn)樣方式獲得的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度最大，因此實(shí)驗(yàn)選擇第1種混合進(jìn)樣方式。

2.2.2 試劑濃度及流速的選擇 對(duì)該體系所用試劑的濃度及流速進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)于NaOH溶液，固定K3Fe(CN)6濃度為5.0×10-5mol/L，Luminol濃度為4.0×10-4mol/L，配制0.2～0.5 mol/L范圍內(nèi)的一系列NaOH溶液，觀察ΔI的變化。發(fā)現(xiàn)隨著NaOH濃度的增大，ΔI也增大，當(dāng)NaOH濃度達(dá)到0.4 mol/L時(shí)，ΔI最大。此后，ΔI隨NaOH濃度的繼續(xù)增大而減小(圖3A)。因此實(shí)驗(yàn)選擇NaOH的最佳濃度為0.4 mol/L。

K3Fe(CN)6作為本反應(yīng)的氧化劑，其濃度會(huì)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度產(chǎn)生一定影響。考察了K3Fe(CN)6濃度為1.0×10-5～1.5×10-4mol/L時(shí)ΔI的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ΔI隨K3Fe(CN)6濃度的增大而增大，當(dāng)K3Fe(CN)6濃度超過(guò)5.0×10-5mol/L時(shí)，ΔI迅速減小，見(jiàn)圖3B。這可能是由于鐵氰化鉀本身有顏色，會(huì)吸收光輻射[16]所致。因此選擇K3Fe(CN)6濃度為5.0×10-5mol/L。

Luminol作為應(yīng)用最廣泛的化學(xué)發(fā)光試劑[17]，其濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度具有很大影響。實(shí)驗(yàn)考察了Luminol濃度在1.0×10-5～1.4×10-4mol/L范圍時(shí)對(duì)ΔI的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Luminol濃度增大到1.0×10-4mol/L時(shí)，ΔI也增至最大，繼續(xù)增大其濃度ΔI反而減小。因此選擇Luminol的最佳濃度為1.0×10-4mol/L。

由于試劑流速?zèng)Q定溶液中發(fā)光部分在光電倍增管的停留時(shí)間和擴(kuò)散情況[18]，因此改變?cè)噭┑牧魉僖矔?huì)對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度產(chǎn)生一定的影響?？疾炝嗽噭┝魉僭?.8～3.2 mL/min 范圍內(nèi)時(shí)ΔI的變化，結(jié)果顯示當(dāng)流速低于2.4 mL/min時(shí)，ΔI隨著流速的增大而增大，當(dāng)流速高于2.4 mL/min時(shí)，ΔI開(kāi)始減小，因此選擇最佳流速為2.4 mL/min。

2.3 線性范圍、精密度與檢出限

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，配制了一系列不同濃度的RFT溶液，發(fā)現(xiàn)RFT的質(zhì)量濃度(ρ，mg/L)在0.008～0.88 mg/L范圍內(nèi)與相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(ΔI)呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為ΔI=752.94ρ+81.01，r=0.992 4。對(duì)6.0×10-2mg/L的RFT標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)平行測(cè)定11次，計(jì)算得到其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.9%。根據(jù)IUPAC建議，計(jì)算得本法的檢出限(3σ)為1.2×10-3mg/L。

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

2.5 樣品的測(cè)定

取同一批次的利福噴丁膠囊10粒，于研缽中研磨混勻后，準(zhǔn)確稱(chēng)取相當(dāng)于0.15 g的利福噴丁藥粉，加適量甲醇溶解后定容至100 mL容量瓶中，充分搖勻并過(guò)濾，得到一定濃度的樣品溶液。按照“1.2”方法，將其稀釋至線性范圍內(nèi)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)以檢測(cè)該方法的準(zhǔn)確性。計(jì)算表明：膠囊中的回收率為98.6%～103.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%～2.8%(表1)。

表1 膠囊中RFT的測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)所用健康志愿者血漿購(gòu)于延安大學(xué)附屬醫(yī)院，吸取高、中、低3個(gè)不同濃度的RFT標(biāo)準(zhǔn)溶液加入3個(gè)等量的血漿樣品中，均加入2 mL乙腈沉淀蛋白，振搖，放入離心機(jī)離心10 min(3 000 r/min)后，取上清液用N2流吹干，復(fù)溶后用水稀釋到線性范圍內(nèi)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，血漿中利福噴丁的回收率為99.6%～102.0%，表明此法可用于血漿中利福噴丁的測(cè)定。

表2 血漿中RFT的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié) 論

本文基于堿性介質(zhì)中利福噴丁能增敏魯米諾-鐵氰化鉀體系的化學(xué)發(fā)光，利用流動(dòng)注射技術(shù)，提出了一種簡(jiǎn)單、快速測(cè)定利福噴丁的新方法。通過(guò)測(cè)定膠囊及人血漿中利福噴丁的含量，表明該方法準(zhǔn)確、靈敏度高，有望進(jìn)一步應(yīng)用于臨床上利福噴丁的血藥濃度監(jiān)測(cè)。

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Determination of Rifapentine by Flow Injection Chemiluminescence Method

XU Tong,ZHANG Yan-tu*,ZHANG Xu

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Yan′an University,Yan′an 716000,China)

A novel method of flow injection chemiluminescence for the determination of rifapentine was proposed based on the phenomenon that the chemiluminescence intensity of the luminol-K3Fe(CN)6system could be enhanced by rifapentine in alkaline medium,combined with flow injection analysis technique.Under the optimal experimental conditions,the linear range of rifapentine's detection concentration was 0.008-0.88 mg/L,the detection limit(3σ) was 1.2×10-3mg/L,and the relative standard deviation(RSD,n=11) was 1.9% for rifapentine at 6.0×10-2mg/L.The method was applied in the determination of rifapentine in both capsules and plasma with satisfactory results.

flow injection;chemiluminescence;luminol;potassium ferricyanide;rifapentine

2017-01-07；

2017-01-21

陜西省高水平大學(xué)建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金(2013SXTS03)；陜西省重大基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2016ZDJC-19)；延安市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2015CHTD-04)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.018

O657.3;TQ460.72

A

1004-4957(2017)06-0805-04

*通訊作者：張琰圖，博士，教授，研究方向：化學(xué)發(fā)光分析，Tel:0911-2333193，E-mail:zhyt1969@163.com