李小琴，袁 芳，曹根霞，王光麗

(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

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基于碳量子點(diǎn)光活性模擬酶性能靈敏檢測(cè)焦磷酸根離子

李小琴，袁 芳，曹根霞，王光麗*

(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

利用簡(jiǎn)單的水熱法合成了具有良好水溶性、優(yōu)良光活性模擬酶性質(zhì)的碳量子點(diǎn)(CDs)，該量子點(diǎn)在可見(jiàn)光照(λ≥400 nm)下可以催化氧化辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的特征底物 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯(TMB)，生成與HRP催化氧化相同的產(chǎn)物。銅離子可與CDs發(fā)生配位作用，使CDs聚集光誘導(dǎo)模擬酶的活性降低；焦磷酸根(ppi)存在時(shí)，銅離子與ppi配位生成Cu2+-ppi復(fù)合物，從而使CDs分散模擬酶活性恢復(fù)。利用這一現(xiàn)象建立了一種比色檢測(cè)ppi的方法，在最佳條件下，檢測(cè)信號(hào)與ppi的濃度之間存在良好的線性關(guān)系，其線性范圍為1.0×10-6～5.0×10-3mol/L，檢出限為2.5×10-7mol/L。將該方法應(yīng)用于健康人血漿中ppi的檢測(cè)，ppi的回收率為97.4%～104.8%，研究表明該比色傳感器可用于人血漿中ppi的檢測(cè)。

碳量子點(diǎn)；模擬酶；比色法；焦磷酸根離子

焦磷酸根(ppi)在許多生命活動(dòng)過(guò)程如細(xì)胞新陳代謝、DNA聚合和一些酶促反應(yīng)中扮演關(guān)鍵角色[1]。研究表明，ppi在關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程中起著很重要的作用，可以作為一個(gè)潛在的生物標(biāo)記物用于關(guān)節(jié)炎疾病的臨床診斷和治療[2]。此外，ppi還用于食品添加劑中[3]。因此，建立快速、簡(jiǎn)便、選擇性好的ppi測(cè)定方法具有十分重要的意義。目前，檢測(cè)ppi的方法有熒光光度法[4]、電化學(xué)方法[5]、比色法[6]等。其中電化學(xué)方法準(zhǔn)確度高、選擇性好,但重現(xiàn)性較差；而熒光光度法需使用較復(fù)雜的儀器。與其他方法相比,比色分析法因簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性好而在化學(xué)分析中得到廣泛應(yīng)用[6]。但當(dāng)前的比色法存在靈敏度低以及干擾嚴(yán)重等現(xiàn)象。所以，發(fā)展簡(jiǎn)便、靈敏地檢測(cè)ppi的方法仍具有重要意義。

天然酶具有底物特異性好、催化活性高等顯著優(yōu)點(diǎn)，但其提取成本較高，易變性失活，價(jià)格昂貴，這些因素極大地限制了其應(yīng)用。因此，以納米材料為模擬酶的研究引起了越來(lái)越多的關(guān)注。與天然酶相比，基于納米結(jié)構(gòu)的模擬酶成本低、催化活性高且耐受更苛刻的環(huán)境，具有很好的應(yīng)用前景[7]。但是大部分基于納米材料的過(guò)氧化物模擬酶均需使用大量具有破壞性的過(guò)氧化氫(H2O2)，這使其在生物分析領(lǐng)域受到較大限制。本課題組研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)光照可使納米材料表現(xiàn)模擬酶活性，從而為模擬酶的應(yīng)用提供了一種新的方法[8-9]。

碳量子點(diǎn)(CDs)是一種新型的納米材料，具有較高的光穩(wěn)定性、低毒性、良好的生物相容性，在生物成像、傳感器及等方面具有潛在的應(yīng)用前景[10-11]。本文采用簡(jiǎn)單的水熱法合成了粒徑為2～3 nm的CDs，發(fā)現(xiàn)其在可見(jiàn)光(λ≥400 nm)下有較強(qiáng)的模擬酶活性，可以催化氧化典型底物 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯(TMB)顯色；銅離子與CDs發(fā)生配位作用[12]使其光催化模擬酶活性減弱；在ppi存在下，銅離子與ppi發(fā)生配位作用形成Cu2+-ppi復(fù)合物[13-14]使得CDs的模擬酶活性恢復(fù)?；诖耍⒘艘环Nppi的檢測(cè)方法。該方法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安有限公司)，TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，JEOL JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，D8型X射線衍射儀(德國(guó)布魯克AXS有限公司)，F(xiàn)TLA 2000-104型紅外光譜儀(加拿大ABB Bomem有限公司)，CEL-S5001350氙燈光源(北京中教金源科技有限公司)，CHI 800C型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)。

3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯(TMB)、碘化鉀、乙二胺四乙酸(EDTA)、 抗壞血酸(AA)、異丙醇(IPA)、叔丁醇(TBA)、乙醇、色氨酸(L-Try)、半胱氨酸(L-Cys)、醋酸鈉、醋酸、焦磷酸鈉(Na4P2O7·10H2O)、硫酸銅、二氯甲烷、溴化鈉、氟化鈉、硫酸鈉、亞硫酸鈉等均購(gòu)于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。人血漿(江南大學(xué)醫(yī)務(wù)室)。超氧化物歧化酶(SOD)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)購(gòu)自Aladdin公司。氧化銦錫(ITO)導(dǎo)電玻璃購(gòu)自深圳南玻顯示器件有限公司。所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用緩沖液為0.2 mol/L的醋酸緩沖溶液，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 碳點(diǎn)的制備

參照文獻(xiàn)[15]采用水熱法合成CDs,在100 mL燒杯中，加入25 mL水、1.1 g AA以及25 mL乙醇，在不斷攪拌下形成均勻溶液。取25 mL混合物加至反應(yīng)釜中，在180 ℃下加熱4 h，自然冷卻至室溫，得深褐色溶液，用二氯甲烷(CH2Cl2)萃取后，透析袋透析2 d，得到黃色水溶性的CDs。

1.3 光誘導(dǎo)CDs模擬酶性質(zhì)研究及其比色法檢測(cè)ppi離子

可見(jiàn)光誘導(dǎo)CDs 模擬酶活性的研究：在離心管中加入200 μL pH 3.0 的HAc-NaAc緩沖、50 μL CDs，然后加入100 μL 0.5 mmol/L TMB溶液，并加水稀釋至 1.0 mL，溶液混合均勻后置于氙燈(λ≥400 nm)下照射15 min，在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定 652 nm處的吸光度。

可見(jiàn)光誘導(dǎo)CDs模擬酶動(dòng)力學(xué)的研究：在離心管內(nèi)加入 200 μL的HAc-NaAc緩沖(pH 3.0)、50 μL CDs和不同濃度的TMB(20～500 μmol/L)，加水稀釋至 1.0 mL。溶液混合均勻后置于氙燈(λ≥400 nm)下照射，于 652 nm 處每隔 1 min 測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度值。通過(guò)米氏方程計(jì)算反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

ppi的檢測(cè)：在離心管中加入200 μL的HAc-NaAc(pH 3.0)緩沖溶液，50 μL CDs，1.0×10-5mol/L的銅離子,反應(yīng)10 min后加入不同濃度的ppi以及100 μL 0.5 mmol/L 的TMB，并加水稀釋至1.0 mL，在40 ℃下氙燈(λ≥400 nm)照射15 min后，于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定 652 nm 處的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 CDs的表征

圖2 不同溶液的紫外可見(jiàn)吸收?qǐng)DFig.2 UV-Vis spectra of different solutionsa.CDs+TMB+visible light,b.TMB+visible light,c.CDs+TMB;inset image is the corresponding color of the above solutions

2.2 光誘導(dǎo)CDs的模擬酶活性

為了探究 CDs的模擬酶活性，選擇TMB 為顯色底物，這種底物通常作為研究模擬酶活性的特征底物。為了避免紫外光直接光氧化TMB，選擇可見(jiàn)光研究CDs的催化活性。如圖2曲線b所示，單獨(dú)可見(jiàn)光(λ≥400 nm)的光照不會(huì)引起TMB 的氧化，而在無(wú)光照的條件下，CDs也不會(huì)催化氧化TMB(如圖2曲線c)，但在光照條件下，CDs氧化TMB 的效果大大提升(圖2曲線a)。CDs加入TMB 溶液，用可見(jiàn)光光照 15 min后溶液變?yōu)樗{(lán)色，氧化的TMB在652 nm處和370 nm處有特征吸收峰出現(xiàn)。證明了CDs具有類(lèi)似天然辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的活性。HRP可以催化 H2O2氧化TMB的反應(yīng)。光誘導(dǎo)CDs模擬酶不需要 H2O2，表明光誘導(dǎo)CDs比天然酶和其他納米材料模擬酶更加環(huán)保和更具生物兼容性。

圖3 pH值(A)和溫度(B)對(duì)CDs 光活性模擬酶的影響Fig.3 Relative catalytic activity of CDs under visible light irradiation with pH value(A) and temperature(B)

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

與天然酶HRP類(lèi)似，光誘導(dǎo) CDs的模擬酶催化活性受溶液 pH值和溫度的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)分別在溫度 10～90 ℃和 pH 2.0～12.0范圍內(nèi)測(cè)量其相對(duì)催化活性。由圖3可看出，CDs在較寬的溫度和pH值范圍內(nèi)均具有較高的催化活性，其中以在pH 3.0、溫度為 40 ℃時(shí)的催化活性效果最佳。此最優(yōu)條件和其它納米材料和天然酶催化的最優(yōu)條件類(lèi)似[8]。而CDs模擬酶在低pH值和高溫度時(shí)的活性較好，也表明該CDs的模擬酶性質(zhì)比較穩(wěn)定。

2.4 光誘導(dǎo)CDs模擬酶活性的動(dòng)力學(xué)研究

為進(jìn)一步了解CDs光催化模擬酶的活性，探究了CDs模擬酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。米氏動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Km)表示酶對(duì)于底物的親和能力，Km值越小，說(shuō)明酶和底物的結(jié)合能力越強(qiáng)。Km可以通過(guò) Lineweaver-Burk 曲線：1/υ=Km/υmax×1/[S]+1/υmax獲得，其中，υ，υmax，[S]和Km分別代表反應(yīng)速率、最大反應(yīng)速率、底物濃度和米氏常數(shù)。以TMB為底物，研究了CDs對(duì)其的親和能力。通過(guò)CDs在不同濃度TMB下的吸光度變化得到 Michaelis-Menten曲線。在最優(yōu)條件下，得到CDs對(duì)底物TMB的υmax=137.7 nmol/L·s-1,Km=76.1 μmol/L。與天然酶HRP相比，CDs的Km值比HRP(Km=434 μmol/L)[19]的低很多，表明光誘導(dǎo)CDs與TMB的親和力比HRP強(qiáng)。CDs 的υmax值較 HRP(10 nmol/L·s-1)的值更大，說(shuō)明 CDs 的催化反應(yīng)速度比天然酶更快，催化所需的時(shí)間更短、效率更高，CDs模擬酶在反應(yīng)速度及親和性上比天然酶有更大的優(yōu)勢(shì)。

2.5 光誘導(dǎo)CDs模擬酶的產(chǎn)生機(jī)理

2.6 比色法檢測(cè)焦磷酸根(ppi)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，銅離子可以抑制CDs光催化模擬酶的活性，加入ppi后模擬酶的活性恢復(fù)如圖5A所示。因?yàn)殂~離子與CDs發(fā)生配位作用，使得CDs聚集模擬酶的活性降低，ppi存在時(shí)，銅離子與ppi發(fā)生配位作用生成Cu2+-ppi復(fù)合物，CDs分散模擬酶的活性恢復(fù)。在最優(yōu)條件下，對(duì)不同濃度的ppi進(jìn)行了測(cè)定。由圖5B可知，隨著ppi濃度的增加，吸光度增強(qiáng)。吸光度A0為加入銅離子后CDs光照射下催化氧化TMB的吸光度，吸光度A為加入ppi后CDs光催化模擬酶活性恢復(fù)后催化氧化TMB后的吸光度。吸光度差值與ppi濃度在1.0×10-6～5.0×10-3mol/L范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，其檢出限(S/N=3)為 2.5×10-7mol/L。本文建立的比色方法簡(jiǎn)便快捷，無(wú)需復(fù)雜儀器，耗時(shí)短，碳材料無(wú)毒，且具有良好的生物相容性，所需要的催化條件比HRP和其他過(guò)氧化物模擬酶更加溫和(即不需要破壞性的過(guò)氧化氫)[25]。由于目前檢測(cè)ppi 的方法中，電化學(xué)法重現(xiàn)性較差[5]，熒光光度法需復(fù)雜的儀器[4]，指示劑置換比色法的檢出限高[26]，拉曼光譜法需復(fù)雜儀器且檢出限高[27]。因此，本方法具有較好的優(yōu)勢(shì)。

2.7 方法的選擇性

表1 人血漿樣品中ppi的分析結(jié)果

2.8 人血漿中焦磷酸根離子的測(cè)定

采用本方法測(cè)定健康人血漿中ppi含量。通過(guò)離心(10 000 r/min,20 min)血漿樣品除去血漿中可能存在的蛋白質(zhì)對(duì)焦磷酸根測(cè)定的影響。測(cè)定結(jié)果如表1所示，健康人血漿中的ppi濃度為1.33～5.01 μmol/L，ppi的回收率為97.4%～104.8%，檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的血漿中ppi含量結(jié)果(1.4～4.7 μmol/L)一致[28]，表明方法具有可行性，可用于檢測(cè)人血漿中的ppi。

3 結(jié) 論

本文采用一種簡(jiǎn)單的水熱法合成了在可見(jiàn)光照下具有模擬酶催化活性的CDs，利用銅離子與ppi的配位作用比銅離子與CDs的作用強(qiáng)，使得CDs的光催化模擬酶活性先抑制后恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)了ppi的快速、靈敏、選擇性檢測(cè)。該比色法具有檢出限低、線性范圍寬、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

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Sensitive Detection of Pyrophosphate Using a Novel Colorimetric Sensor Based on Carbon Quantum Dots Photocatalytic Mimic Enzyme Activity

LI Xiao-qin,YUAN Fang,CAO Gen-xia,WANG Guang-li*

(College of Chemistry and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122，China)

The highly solubile and photocatalytic carbon quantum dots(CDs) were prepared by a one-pot hydrothermal method.The CDs could oxidize the typical substrate of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine(TMB) of the horseradish peroxidase(HRP) under visible light(λ≥400 nm) irradiation causing the color signal.In this assay,the interaction between copper ion and CDs will suppress the oxidase mimicking activity of CDs.Upon introduction of target pyrophosphate ions(ppi) into the detection system,the Cu2+-ppi complexes were forming on the basis of the coordination reaction between copper ion and inorganic pyrophosphate ions,thus the oxidase mimicking activity of released CDs was recovered.Based on this characteristic,a colorimetric sensor for the ppi detection was designed.Under the optimal conditions,the obtained colorimetric signal showed a linear response to ppi within a dynamic range of 1.0×10-6-5.0×10-3mol/L with a detection limit(LOD) of 2.5×10-7mol/L.The method was applied in the determination of ppi in human plasma samples,with recoveries of 97.4%-104.8%.The results showed that the colorimetric sensor could be used to detect ppi in human plasma samples.

carbon quantum dots;enzyme mimetics;colorimetry;pyrophosphate ion

2016-12-04；

2017-02-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21275065，21575052)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.016

O657.3;P578.92

A

1004-4957(2017)06-0794-06

*通訊作者：王光麗，博士，副教授，研究方向：納米分析化學(xué)，Tel:0510-85917090,E-mail：glwang@jiangnan.edu.cn