李 麗，黎 睿，謝 剛,葉 金，王松雪

(國家糧食局科學研究院，北京 100037)

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全自動免疫親和在線凈化/高效液相色譜法快速高通量測定飼料中黃曲霉毒素

李 麗，黎 睿，謝 剛*,葉 金，王松雪

(國家糧食局科學研究院，北京 100037)

建立了全自動免疫親和在線凈化/高效液相色譜快速高通量測定飼料中黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)的分析方法。飼料樣品經(jīng)乙腈-水(80∶20，體積比)提取，3 g/L Triton X-100水溶液10倍稀釋后，用自動進樣器注入RIDA?CREST在線固相萃取系統(tǒng)并流經(jīng)黃曲霉毒素免疫親和小柱，以甲醇-水(45∶55，體積比)為流動相，流速為1.0 mL/min，C18色譜柱(150 mm×3.5 mm，5 μm)分離，光化學衍生，熒光檢測器測定。根據(jù)3倍信噪比的峰響應(yīng)值，確定黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的檢出限分別為0.08，0.05，0.18，0.08 μg/kg，分別在1～100，0.24～24，0.56～56，0.24～24 μg/kg 范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.999 4，0.999 7，0.999 8 和0.999 8；AFT在豬飼料、雞飼料、寵物飼料和飼料原料4類樣品中的加標回收率為72.6%～103%，相對標準偏差為2.5%～4.9%。該方法一次裝柱可檢測60個樣品，液相色譜分析一個樣品總的運行時間為15 min，所以1 d可檢測70～80個樣品，滿足飼料中黃曲霉毒素快速高通量準確定量檢測的需要。

飼料;黃曲霉毒素;在線免疫親和柱凈化;高效液相色譜

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)是黃曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)和模式曲霉(A.nomius)等在合適的溫度和濕度條件下產(chǎn)生的真菌毒素，對人畜有強烈的致病性、致癌性，是危害最嚴重的真菌毒素之一，在自然界中廣泛存在[1-3]。污染飼料的黃曲霉毒素主要有B1，B2，G1和G2。國內(nèi)外非常重視黃曲霉毒素的防控，為減少黃曲霉毒素的危害，我國在2001年頒布了《飼料衛(wèi)生標準》，規(guī)定了各類飼料中黃曲霉毒素B1的限量值[4]。

目前AFT的檢測方法主要有薄層色譜法[5]、膠體金試紙條法[6]、酶聯(lián)免疫法或免疫傳感器[7]、液相色譜法或液質(zhì)聯(lián)用[8-12]等方法。膠體金和酶聯(lián)免疫方法主要用于快速篩查，液質(zhì)聯(lián)用法主要用于多種真菌毒素的同時監(jiān)測。免疫親和柱/液相色譜法是目前國際上普遍采用的黃曲霉毒素準確定量和確認方法，針對此方法凈化過程操作繁瑣、費時費力的問題，已有相關(guān)研究提出了離線或在線自動固相萃取的解決方案。1991年Sharman等建立了基于離線免疫親和柱自動固相萃取裝置進行樣品凈化的食品和飼料中黃曲霉毒素[13]和赭曲霉毒素A[14]的高效液相色譜檢測方法，Eskola等[15]建立了離線自動固相萃取高效液相色譜測定谷物中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A的分析方法，Niedwetzki等[16]建立了基于離線自動前處理工作站的谷物和花生醬中黃曲霉毒素的高效液相色譜檢測方法。這些離線自動凈化方法，提高了檢測結(jié)果的可比性，節(jié)省了時間和人力成本，但樣品前處理步驟較為繁瑣，免疫親和柱只能使用一次，離線凈化檢測耗材成本較高，檢測效率仍然較低[17]。2012年，Jinap等嘗試通過特殊處理的免疫親和預(yù)柱(2.1 mm I.D.×50 mm)在線凈化-柱后溴衍生/高效液相色譜法進行了花生、無花果干、紅辣椒粉等樣品中4種黃曲霉毒素檢測方法驗證[18-19]，發(fā)現(xiàn)在線自動化凈化樣品顯著提高了方法的分析效率和重現(xiàn)性，降低了檢測成本。本研究采用全自動在線凈化技術(shù)，將抗體偶合到耐壓聚合物的免疫親和柱(1 mm I.D.×10 mm)，結(jié)合RIDA?CREST ICE在線固相萃取裝置，建立了在線凈化-光化學衍生液相色譜檢測飼料中黃曲霉毒素的方法，增加了免疫親和柱的使用次數(shù)，提高了檢測的自動化水平，降低了檢測成本，并提高了檢測效率，可滿足大規(guī)模樣品準確定量的需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Spark通用全自動高效液相色譜(荷蘭Spark Holland公司)，配RIDA?CREST 在線固相萃取系統(tǒng)、熒光檢測器;AflaTest在線固相萃取柱(Immunoprep?Online Aflatoxin，德國拜發(fā)公司);光化學衍生器;PL403IC型電子分析天平(梅特勒上海有限公司);Pulverisette14 高速旋轉(zhuǎn)粉碎機(德國Fritsch 公司);離心機;振蕩器。

黃曲霉毒素標準品(純度≥99%，以色列Fermentek 公司)，甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)，實驗用水為Milli-Q超純水(美國Millipore公司)，乙酸銨、曲拉通X-100(Triton X-100)、氫氧化鈉、氯化鈉、濃硝酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 黃曲霉毒素標準溶液的配制

分別準確稱取1 mg(精確至0.01 mg)黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2標準品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成100 mg/L的黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2標準儲備液，于-20 ℃保存。臨用前，用儲備液稀釋成1，5，10，50，100 μg/kg(以B1計，其余3種毒素濃度按B1∶B2∶G1∶G2為25∶6∶14∶6混配)的工作液，備用?？紤]到黃曲霉毒素的毒性，建議購買標準母液來稀釋配制標準工作溶液。

1.3 樣品制備

將豬飼料、雞飼料、寵物飼料和魚飼料樣品及過夜后的加標樣品加5.0 g氯化鈉、100 mL提取液，高速振蕩提取30 min，靜置3～5 min 后，取適量提取液于8 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至試管，用3 g/L Tritox-100稀釋10倍后，將稀釋液置于進樣瓶中以備進樣。

1.4 在線固相萃取/高效液相色譜測定條件

色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);進樣量1 000 μL ;流速1.0 mL/min;柱溫35 ℃;熒光檢測器：激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm；流動相為甲醇-水(45∶55)。

在線固相萃取條件：活化液：20 mmol/L 乙酸銨，調(diào)至pH 6.8～7.0；淋洗液：含20 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨基丁三醇的水-甲醇-乙腈溶液(90∶6∶4，體積比)，調(diào)節(jié)pH值至8.3～8.5；洗脫液：含50 mmol/L乙酸銨的水-甲醇-乙腈(62∶26∶12，體積比)；黃曲霉毒素免疫親和柱的活化和平衡體積均為1 000 μL；上樣體積為1 000 μL；淋洗體積為6 000 μL；洗脫體積為1 000 μL；在線免疫親和柱采用活化液進行再生，體積為2 000 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取液的優(yōu)化

由于飼料成分較為復(fù)雜，考察了甲醇-水(70∶30)、甲醇-水(80∶20)、乙腈-水(80∶20) 3種提取液對飼料中黃曲霉毒素提取效果的影響。采用加標回收方式進行驗證，添加20 ng/g標準溶液(以AFB1的量計，其余3種毒素濃度按B1∶B2∶G1∶G2為25∶6∶14∶6混配)于豬飼料、雞飼料、寵物飼料陽性樣品中，分別用3種提取試劑提取，每種提取試劑做6個平行，檢測結(jié)果見表1。從外觀看，乙腈-水混合提取液的顏色較深，經(jīng)稀釋液稀釋后顏色變淺；而甲醇-水混合提取液雖然顏色較淺，但在使用0.22 μm PTFE濾膜過濾時有較大的阻力，這可能是由于甲醇-水提取液中含有較多大分子蛋白。從回收率結(jié)果來看，4種黃曲霉毒素的回收率均在73.3%～106%之間，且以乙腈-水(80∶20)的提取效果最穩(wěn)定，回收率最高。因此，選擇乙腈-水(80∶20)作為飼料中黃曲霉毒素的提取試劑。

表1 不同提取溶劑的回收率結(jié)果(n=6)

圖1 含3 g/L Triton X-100的常用淋洗液條件下飼料樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of common feed using wash buffer of 3 g/L Triton X-1001,2,7:impurity;3:AFG2;4:AFG1;5:AFB2;6:AFB1

2.2 在線固相萃取系統(tǒng)中淋洗液的優(yōu)化

RIDA?CREST 在線固相萃取系統(tǒng)常用的淋洗液為20 mmol/L 乙酸銨-甲醇-乙腈溶液(90∶6∶4)?？紤]到飼料成分較為復(fù)雜，比較了20 mmol/L 乙酸銨-甲醇-乙腈溶液(90∶6∶4)和含3 g/L Triton X-100的20 mmol/L 乙酸銨-甲醇-乙腈溶液(90∶6∶4)兩種淋洗液的效果。結(jié)果表明，采用不添加Triton X-100的淋洗液，在黃曲霉毒素B1出峰附近有雜質(zhì)干擾，分離度差，影響定量。而添加表面活化劑Triton X-100后可消除干擾，獲得的基線平穩(wěn)，峰形較好(圖1)，且添加Triton X-100后不影響對黃曲霉毒素的回收率。因此，本實驗選用含3 g/L Triton X-100的20 mmol/L 乙酸銨-甲醇-乙腈溶液(90∶6∶4)作為淋洗液。

2.3 免疫親和柱重復(fù)使用次數(shù)的確定

通過陰性飼料樣品的加標回收率檢測免疫親和柱的重復(fù)使用次數(shù)，黃曲霉毒素總加標量為40.8 μg/kg，其濃度比為AFB1∶AFB2∶AFG1∶AFG2=25∶6∶14∶6,經(jīng)在線黃曲霉毒素免疫親和柱凈化，光化學衍生器衍生后，熒光法檢測。進樣次數(shù)60次。結(jié)果顯示，4種黃曲霉毒素的回收率均在90%以上，且柱子使用60次后重復(fù)性依然滿足要求，RSD值均不大于12.1%。同時，該柱在無保護液的情況下，可以連續(xù)使用24 h，簡化了操作步驟，節(jié)省了時間和人力成本。此外，RIDA?CREST在線固相萃取儀可以同步進行兩根柱子凈化和分析，與常規(guī)離線凈化每人1 d處理20～30個樣品相比，本方法1 d可凈化并檢測70～80個樣品，顯著提高了檢測效率。

2.4 線性范圍與檢出限

在上述色譜條件下，分別測定AFB1，AFG1，AFB2和AFG2的系列標準溶液，經(jīng)在線黃曲霉毒素免疫親和柱處理，以HPLC測得的峰面積(Y)為縱坐標，相應(yīng)的質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標繪制標準曲線，根據(jù)3倍信噪比的峰響應(yīng)值計算方法檢出限；根據(jù)10倍信噪比的峰響應(yīng)值計算方法定量下限。結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2分別在1～100，0.24～24，0.56～56，0.24～24 μg/kg范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.999 4，0.999 7，0.999 8 和0.999 8，檢出限分別為0.08，0.05，0.18，0.08 μg/kg，定量下限分別為0.24，0.15，0.54，0.24 μg/kg。

2.5 精密度與回收率

采用本方法對添加了黃曲霉毒素的豬飼料、雞飼料和寵物飼料樣品進行檢測。加標量為20 ng/g(以B1計，其余3種毒素濃度按B1∶B2∶G1∶G2為25∶6∶14∶6混配)的同一批樣品重復(fù)測7 d，每天測7次，每個濃度做5 個平行樣。黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的日內(nèi)相對標準偏差(RSD)為2.5%～4.9%，日間RSD為3.4%～7.5%，加標回收率為72.6%～103%(表2)。

2.6 在線凈化液相色譜法與穩(wěn)定同位素稀釋LC-MS/MS法比較

樣品選用FAPAS能力驗證的玉米粉，經(jīng)振蕩提取后，一部分濾液用同位素稀釋LC-MS/MS法檢測；一部分濾液稀釋10倍，用在線凈化/液相色譜法進行分析，平行測定2次。同位素稀釋LC-MS/MS的測定平均值為3 μg/kg，在線凈化/液相色譜法的測定平均值為3.03 μg/kg，2種方法的測定結(jié)果一致。同時，通過黃曲霉毒素B1定性離子可以判斷提取液中目標毒素為黃曲霉毒素B1，說明使用的在線免疫親和柱專一性符合要求。

2.7 在線凈化液相色譜法與離線凈化液相色譜法的比較

2.7.1 實際樣品檢測的比較 為了比較在線IAC凈化液相色譜法的準確性，通過在線凈化和離線凈化兩種方法對國家有證標準物質(zhì)進行提取研究，標準物質(zhì)的證書編號為GBW(E)100386，AFB1量值為(27±3) μg/kg。3次測定結(jié)果取平均值，在線凈化法為26.5 μg/kg，離線凈化法為27.2 μg/kg，相對標準偏差(RSD)分別為4.7%和3.1%。兩種方法測定結(jié)果均在量值范圍內(nèi)，且在中值附近，通過t檢驗，發(fā)現(xiàn)兩組結(jié)果無顯著性差異。說明在線凈化/液相色譜法準確可靠，可用于飼料樣品的檢測。

2.7.2 加標回收結(jié)果的比較 樣品經(jīng)振蕩提取后，一部分濾液采用離線凈化/液相色譜法檢測；一部分濾液稀釋10倍后，采用在線凈化/液相色譜法進行分析。采用添加AFT的空白豬飼料樣品進行檢測，加標量為20 ng/g(以B1計，其余3種毒素濃度按B1∶B2∶G1∶G2為25∶6∶14∶6混配)。重復(fù)測定3次，結(jié)果見表3。

表3 在線凈化與離線凈化結(jié)果比較

從表3可知，黃曲霉毒素免疫親和在線凈化法除了AFG2的回收率低于離線凈化的回收率外，其他3種黃曲霉毒素的回收率結(jié)果相當，滿足GB/T 27404-2008[20]的檢測要求。

3 結(jié) 論

本文建立了快速測定飼料中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的在線免疫親和凈化/液相色譜法。黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的檢出限分別為0.08，0.05，0.18，0.08 μg/kg，在豬飼料、雞飼料、寵物飼料和飼料原料4類樣品中的加標回收率為72.6%～103%，RSD為2.5%～4.9%。本方法操作簡單，靈敏度、準確度、精密度和回收率等均符合檢測需要，一次裝柱可以檢測60個樣品，一天可以凈化并檢測70～80個樣品，優(yōu)于常規(guī)離線凈化檢測方法，檢測效率高，適于大批量樣品的處理。

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Rapid and High Throughput Analysis of Aflatoxins in Feed Matrix Using On-line Immunoaffinity Column Clean-up and High Performance Liquid Chromatography

LI Li,LI Rui,XIE Gang*,YE Jin,WANG Song-xue

(Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037，China)

A rapid analytical method using on-line immunoaffinity column clean-up and high performance liquid chromatography(HPLC) was developed for the determination of aflatoxins(B1，B2，G1，G2) in feed samples.The samples were extracted with acetonitrile-water solution(80∶20,by volumn).The extraction solution was diluted by 10 times using 3 g/L triton X-100 water solution,then injected into the RIDA?CREST on-line immunoaffinity column clean-up system,and washed out with methanol-water(45∶55,by volume) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.Aflatoxins were analyzed by HPLC/FLD with post-column photochemical derivatizaton.The detection limits of AFB1,AFB2,AFG1and AFG2were 0.08,0.05,0.18,0.08 μg/kg,respectively.The linear ranges for AFB1,AFB2,AFG1and AFG2were 1-100,0.24-24,0.56-56,0.24-24 μg/kg,with their correlation coefficients(r2) of 0.999 4,0.999 7,0.999 8 and 0.999 8,respectively.The recoveries for four kinds of feed samples spiked with aflatoxins were in the range of 72.6%-103%,with relative standard deviations of 2.5%-4.9%.Each immunoaffinity colomn could be used for 60 samples cleanup,and the total running time for each HPLC analysis is 15 min,thus 70-80 samples could be detected per day.This method could satisfy the demands for rapid and accurate analysis of aflatoxin in feed.

feed;aflatoxins;on-line immunoaffinity column clean-up;high performance liquid chromatography(HPLC)

2016-12-07；

2017-02-22

糧食公益性行業(yè)科研專項(201313005)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.017

O657.72；S852.44

A

1004-4957(2017)06-0800-05

*通訊作者：謝 剛，碩士，副研究員，研究方向：糧油質(zhì)量安全檢測與控制，Tel：010-58523613，E-mail:xg@chinagrain.org