崔飛云,徐 溢,趙 斌,車玉蘭，劉露露

(1.重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400044；2.重慶大學(xué) 光電工程學(xué)院微系統(tǒng)研究中心，重慶 400044；3.重慶大學(xué) 新型微納器件與系統(tǒng)技術(shù)國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044；4.重慶大學(xué) 微納系統(tǒng)及新材料技術(shù)國際研發(fā)中心，重慶 400044)

?

綜 述

致病菌與糖的特異性識(shí)別及其分析應(yīng)用研究

崔飛云1,3,4,徐 溢1,2,3,4*,趙 斌1,3,4,車玉蘭1,3,4，劉露露1,3,4

(1.重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400044；2.重慶大學(xué) 光電工程學(xué)院微系統(tǒng)研究中心，重慶 400044；3.重慶大學(xué) 新型微納器件與系統(tǒng)技術(shù)國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044；4.重慶大學(xué) 微納系統(tǒng)及新材料技術(shù)國際研發(fā)中心，重慶 400044)

致病菌往往通過凝集素-糖特異性識(shí)別來實(shí)現(xiàn)對宿主細(xì)胞的粘附，進(jìn)而感染宿主組織，引起病變。 因此，研究致病菌與糖的特異性識(shí)別有利于進(jìn)一步了解感染性疾病的致病機(jī)制，為致病菌的特異性檢測和感染性疾病的治療提供新的策略。該文總結(jié)了致病菌-糖特異性識(shí)別的相關(guān)機(jī)制機(jī)理；介紹了目前主要的研究方法和技術(shù)，特別評述了熒光光譜、表面等離子體共振、電化學(xué)阻抗譜及石英晶體微天平等技術(shù)在該研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并對這4種技術(shù)與微流控芯片平臺(tái)的結(jié)合進(jìn)行了探討；針對致病菌檢測特異性差、耐藥性嚴(yán)重等難題，重點(diǎn)綜述了致病菌-糖的特異性識(shí)別在細(xì)菌分離、富集、檢測、鑒別、生物膜抑制及抗菌糖類藥物篩選方面的應(yīng)用。最后對致病菌-糖特異性識(shí)別基礎(chǔ)和應(yīng)用研究進(jìn)行了展望。

糖-凝集素相互作用；多效價(jià)相互作用；細(xì)菌粘附；細(xì)菌檢測；綜述

糖類是生物體進(jìn)行新陳代謝所需能量的主要來源，同時(shí)，它還調(diào)節(jié)著一系列生命活動(dòng)，具有重要的生物學(xué)功能[1]。糖的生物學(xué)功能主要是通過與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性識(shí)別來實(shí)現(xiàn)?？商禺愋宰R(shí)別糖的蛋白質(zhì)主要包括單克隆抗體、酶、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和凝集素[2]。其中，糖-凝集素特異性識(shí)別相關(guān)的生理學(xué)及病理學(xué)過程有致病菌或病毒感染、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、受精、癌癥轉(zhuǎn)移以及免疫調(diào)節(jié)等[3]。致病菌感染研究在感染性疾病治療和細(xì)菌特異性檢測方面具有重要的意義。所以，本文重點(diǎn)綜述了致病菌表面凝集素與宿主細(xì)胞表面聚糖特異性識(shí)別相關(guān)的機(jī)制機(jī)理、分析檢測技術(shù)和實(shí)際應(yīng)用，并結(jié)合本課題組的工作特色[4-5]，著重總結(jié)其在細(xì)菌檢測方面的最新應(yīng)用進(jìn)展。最后對致病菌-糖特異性識(shí)別基礎(chǔ)與應(yīng)用研究進(jìn)行展望。

1 致病菌-糖特異性識(shí)別的相關(guān)機(jī)制

1.1 致病菌的粘附機(jī)制

圖1 細(xì)菌粘附過程原理示意圖Fig.1 The principle of bacterial adhesion as a prelude to infection

細(xì)菌粘附是細(xì)菌感染人畜的先決條件，它受到多種理化因素和生物因素的制約，是多種粘附素和受體共同作用的結(jié)果，具有宿主特異性、組織特異性和細(xì)胞特異性[6-7]。作為毒力因子之一的菌毛，一般會(huì)參與致病菌對宿主細(xì)胞的特異性粘附過程[8]，其主要途徑是多個(gè)菌毛凝集素與宿主細(xì)胞表面多個(gè)聚糖發(fā)生特異性相互作用(圖1)。

與細(xì)菌凝集素特異性結(jié)合的聚糖(Glycan)是宿主細(xì)胞膜表面糖復(fù)合物的糖基部分。聚糖一般分為3大類：連接脂質(zhì)的聚糖、通過氮原子與蛋白質(zhì)連接的聚糖(N-連接聚糖)以及通過氧原子與蛋白質(zhì)連接的聚糖(O-連接聚糖)。聚糖中最常見的組分是己糖。正常情況下，己糖通過5-羥基與1-醛基反應(yīng)形成半縮醛，以六元環(huán)吡喃糖構(gòu)型形式出現(xiàn)。聚糖中常出現(xiàn)的己糖包括D-半乳糖(Gal)、D-葡萄糖(Glc)、D-甘露糖(Man)、N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰-D-葡糖胺(GalNAc)等。此外，還有其他一些單糖，如葡糖醛酸(GlcA)、木糖(Xyl)、巖藻糖(Fuc)和N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)。

圖2 銅綠假單胞菌粘附人體肺部上皮細(xì)胞過程示意圖 [9]Fig.2 Schematic description of adhesion and lung infection by P.aeruginosa[9]

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)又稱綠膿桿菌，是目前研究較多的一種革蘭氏陰性菌，會(huì)引起菌血癥、慢性肺部感染、尿道感染以及急性潰瘍性角膜炎等多種疾病。該菌表面有兩種凝集素LecA(PA-IL)和LecB(PA-IIL)，它們均為四聚物單體。LecA主要與人體肺部上皮細(xì)胞表面糖脂的α-Gal殘基特異性結(jié)合，LecB則與多種組織上皮細(xì)胞表面的巖藻糖基、甘露糖基以及路易斯酸結(jié)合[9]。通過這兩類特異性結(jié)合，銅綠假單胞菌粘附到宿主細(xì)胞表面，進(jìn)而感染細(xì)胞和組織，引發(fā)病變(圖2)。

微需氧型的革蘭氏陰性菌幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)能引起胃炎、胃潰瘍以及胃癌。目前發(fā)現(xiàn)，其表面具有BabA(特異性識(shí)別Lewis b)、LabA(特異性識(shí)別N,N-二乙?；被樘擒?，LacdiNAc)和SabA(即H-1型，特異性識(shí)別唾液酸化的Lewis a和Lewis x) 3種凝集素[8,10-12]。這3種凝集素-糖相互作用介導(dǎo)了H.pylori對胃粘膜的粘附。Magalh?es等[13]證明了缺乏巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的小鼠受H.pylori侵染的幾率大大降低，其原因是巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的缺失導(dǎo)致了BabA特異性識(shí)別的Lewis a和Lewis x生物合成受阻。

革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)是常見的腸道、尿道致病菌，其粘附過程主要由菌毛凝集素與腸道上皮細(xì)胞表面聚糖的特異性相互作用來介導(dǎo)。大腸桿菌菌毛凝集素主要分為1型、P型、S型及F1C型[14]。在1型菌毛末端，具有可與α-Man特異性識(shí)別的FimH凝集素。在P型菌毛上，具有與Galα1-4Gal(Galabiose)特異性識(shí)別的PapG凝集素。具有P型菌毛的大腸桿菌，如E.coliO157∶H7能引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥，甚至死亡。S型和F1C型凝集素分別與唾液酸化的半乳糖和GalNAcβ1-4Gal發(fā)生特異性識(shí)別。正是由于這些菌毛凝集素的存在，才使大腸桿菌特異性粘附人體的不同組織，從而引發(fā)不同程度的疾病。

以上3種致病菌均為革蘭氏陰性菌，也有研究發(fā)現(xiàn)，一些革蘭氏陽性菌也可通過其表面的凝集素來粘附宿主細(xì)胞，如豬鏈球菌(Streptococcussuis)通過識(shí)別半乳二糖來粘附豬的肺組織、腦組織等，從而引發(fā)腦膜炎、敗血癥及肺部感染。 表1總結(jié)了文獻(xiàn)[15-17]中細(xì)菌凝集素-糖特異性作用的例子。

表1 以糖為識(shí)別受體的致病菌[15-17]

1.2 凝集素-糖的特異性識(shí)別機(jī)制

從分子水平來看，致病菌與糖的特異性識(shí)別實(shí)質(zhì)為凝集素與糖的相互作用。凝集素與糖之間的相互作用包括氫鍵、金屬配位鍵、范德華力和疏水性作用力等。有研究指出，糖分子上的 CH 基團(tuán)與凝集素分子中芳環(huán)類殘基之間的 CH- π 作用也扮演著重要角色[18]。

圖3 凝集素-糖結(jié)合方式示意圖Fig.3 Contact points between carbohydrate and lectin

由于糖分子具有多個(gè)羥基，凝集素分子存在多個(gè)氨基和羧基，所以氫鍵廣泛存在。Ca2+，Mn2+等二價(jià)陽離子通過形成配位健來直接或間接地參與糖與凝集素的相互作用過程。例如，伴刀豆凝集素ConA(與α-D-甘露糖和α-D-葡萄糖發(fā)生特異性識(shí)別)的單體含有1個(gè)過渡金屬離子結(jié)合位點(diǎn)S1(一般為Mn2+)，1個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)S2以及1個(gè)糖類結(jié)合位點(diǎn)[19]。P.aeruginosa表面的凝集素PA-IL和PA-IIL也需要在Ca2+調(diào)節(jié)下分別與Gal和Fuc特異性識(shí)別[20]。除了以上兩種與親水性相關(guān)的作用力外，疏水作用力在糖-凝集素識(shí)別中起著重要的作用，如Gal與凝集素的芳香烴殘基之間的作用(圖3)。

為了在分子水平上深入理解凝集素-糖相互作用，越來越多的學(xué)者從晶體結(jié)構(gòu)學(xué)的角度來闡明其結(jié)合機(jī)制。Hung等[21]從晶體結(jié)構(gòu)學(xué)的角度解釋了大腸桿菌凝集素FimH與D-甘露糖的相互作用，分析結(jié)果表明，F(xiàn)imH表面的糖結(jié)合域可與單糖Man完美緊密的結(jié)合。甘露三糖與甘露戊糖等寡糖與它的結(jié)合親和力之所以增強(qiáng)，是多余糖鏈的疏水面與FimH的“疏水脊”重疊的結(jié)果。在糖鏈上修飾上其它疏水性基團(tuán)(如苯環(huán))也可以增加其結(jié)合親和力。沙門氏菌1型菌毛凝集素也可與Man特異性識(shí)別，但甘露寡糖或疏水基團(tuán)修飾的甘露糖并不能增加其結(jié)合親和力，可能是因?yàn)槠淠乇砻娌痪哂小笆杷埂眳^(qū)域[22]。

1.3 多效價(jià)相互作用機(jī)制

一個(gè)粒子(小分子、寡糖、蛋白質(zhì)、核酸或一些分子的集合體、細(xì)胞膜、細(xì)胞器、病毒、細(xì)菌或細(xì)胞)與其它粒子相互作用時(shí)，獨(dú)立結(jié)合點(diǎn)的個(gè)數(shù)稱為效價(jià)(Valent)[23-24]。凝集素與糖單效價(jià)相互作用的結(jié)合親和常數(shù)Ka一般為103～104L/mol，多效價(jià)相互作用的結(jié)合親和常數(shù)Ka一般大于106L/mol[25-26]。生物體中，一般由多個(gè)糖配體與多個(gè)凝集素受體或一個(gè)凝集素的多個(gè)結(jié)合域進(jìn)行結(jié)合，通過這種多效價(jià)相互作用的方式增加結(jié)合親和力和結(jié)合特異性，這種效應(yīng)稱為“多效價(jià)效應(yīng)”或“簇集效應(yīng)”[27-28]。例如：流感病毒與單個(gè)唾液酸結(jié)合的Kd在mmol/L數(shù)量級，然而在生理?xiàng)l件下流感病毒與宿主細(xì)胞受體(唾液酸)的Kd卻達(dá)到nmol/L數(shù)量級[29]，這是多效價(jià)相互作用的結(jié)果。

圖4 受體-配體單多效價(jià)相互作用的模式圖Fig.4 Mechanisms diagram of interaction between multivalent ligands and multivalent receptors

在致病菌-糖特異性識(shí)別的過程中，一個(gè)致病菌往往由多個(gè)菌毛同時(shí)參與粘附，同一個(gè)菌毛上的凝集素往往會(huì)與多個(gè)糖配體進(jìn)行結(jié)合，以增加結(jié)合親和力和結(jié)合特異性[15,30]。正是由于多個(gè)糖-凝集素的單效價(jià)相互作用同時(shí)發(fā)生，才表現(xiàn)出整體較強(qiáng)的多效價(jià)相互作用，但多效價(jià)相互作用不等于單效價(jià)相互作用的疊加。 研究表明，多效價(jià)相互作用的機(jī)制比較復(fù)雜，其主要有4種結(jié)合模式(圖4)，即螯合結(jié)合(Chelate binding)、受體簇集結(jié)合(Receptor clustering)、亞位點(diǎn)結(jié)合(Subsite binding)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)上的重新結(jié)合(Statistical reassociation)[31]。不同的相互作用模式產(chǎn)生不同的生物響應(yīng)。螯合結(jié)合模式是指1個(gè)同源多聚體凝集素的n個(gè)結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)與1個(gè)多糖基分子的m個(gè)配體發(fā)生相互作用。這種結(jié)合模式可以大大增強(qiáng)受體-配體之間的結(jié)合親和力。Zhu等[32]在研究E.coli與Man的相互作用時(shí)，揭示了E.coliORN178可同時(shí)與10～11個(gè)Man分子通過螯合結(jié)合模式發(fā)生多效價(jià)相互作用，與之前文獻(xiàn)提到的通過亞位點(diǎn)結(jié)合模式提高結(jié)合親和力不同。受體簇集模式是指當(dāng)多效價(jià)的配體存在時(shí)，細(xì)胞膜表面的單效價(jià)受體通過在脂質(zhì)雙分子層中的擴(kuò)散作用聚集，使其發(fā)生多效價(jià)相互作用。亞位點(diǎn)結(jié)合模式是指1個(gè)非均勻二效價(jià)配體與單效價(jià)受體結(jié)合后，其另外1個(gè)亞識(shí)別位點(diǎn)與受體以不同的結(jié)合親和力和特異性發(fā)生的相互作用，亞單位相互作用力主要為疏水作用力，一般特異性很弱。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上重新結(jié)合概率大的模式主要是指，一個(gè)配體周圍有高密度的受體，一旦一個(gè)受體與配體解離，則周圍其它的受體會(huì)很快會(huì)再與配體結(jié)合，維持了受體-配體動(dòng)態(tài)的結(jié)合，從而增加了結(jié)合親和力。

2 致病菌-糖特異性識(shí)別的研究方法與技術(shù)

目前，研究凝集素-糖或細(xì)菌-糖特異性識(shí)別的方法和技術(shù)有很多，高分辨率核磁共振、X射線晶體衍射和計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)通常用來研究凝集素-糖特異性結(jié)合的分子機(jī)制[2]；親和色譜、親和毛細(xì)管電泳、等溫滴定量熱是經(jīng)典的檢測生物分子之間相互作用的方法，通常用來計(jì)算細(xì)菌/凝集素-糖結(jié)合親和力[26]；質(zhì)譜、原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡、激光共聚焦成像、紫外-可見光譜、熒光光譜、循環(huán)伏安法、方波伏安法和差分脈沖伏安法等主要用于以糖為識(shí)別受體的細(xì)菌檢測研究。

近年來，基于熒光光譜、表面等離子體共振、石英晶體微天平和電化學(xué)阻抗等檢測技術(shù)的生物傳感在研究細(xì)菌/凝集素-糖特異性識(shí)別方面展現(xiàn)出優(yōu)異的性能，它們既可用來計(jì)算細(xì)菌/凝集素-糖結(jié)合親和力常數(shù)，也可應(yīng)用到細(xì)菌檢測、糖類抗粘附藥物篩選等研究領(lǐng)域，得到研究者的廣泛關(guān)注，且該類生物傳感與微陣列芯片、微流控芯片結(jié)合的研究更是該領(lǐng)域的前沿與熱點(diǎn)。

2.1 熒光光譜

熒光光譜是研究生物分子相互作用的重要手段。在溶液體系中，利用熒光光譜研究細(xì)菌-糖的特異性識(shí)別主要采用熒光競爭性結(jié)合試驗(yàn)(Fluorescence competition binding assay)或熒光猝滅試驗(yàn)。Abdelhamid等[33]將殼聚糖(Chitosan)固定在CdS QDs上，得到CdS@CTS，并選擇能與殼聚糖特異性識(shí)別的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌作為CdS@CTS的猝滅劑。當(dāng)CdS@CTS與細(xì)菌結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度降低，基于熒光強(qiáng)度的變化值，利用Stern-Volmer方程計(jì)算得到CdS@CTS與兩種細(xì)菌的結(jié)合常數(shù)均在105數(shù)量級。

糖芯片(Carbohydrate microarray)是將多個(gè)不同的糖分子通過共價(jià)或非共價(jià)方式固定在基質(zhì)(玻璃、硅片等)上，進(jìn)而對凝集素或細(xì)菌等待測樣品進(jìn)行測試、分析的手段，其檢測技術(shù)一般為熒光光譜[34]。糖芯片最鮮明的特征是樣品用量少和通量高。Gade等[35]將Man和Fuc修飾的β-環(huán)糊精-二茂鐵化合物固定在玻璃上，用于E.coliORN 178和P.aeruginosa檢測。Flannery等[36]評述了糖芯片用于探索細(xì)菌-糖相互作用的現(xiàn)狀，并指出糖芯片是目前未充分利用但獲得較大關(guān)注的一種檢測技術(shù)，它在細(xì)菌種類鑒別、細(xì)菌感染治療方面將得到更廣闊的應(yīng)用。

當(dāng)然，糖芯片存在一定的局限。一方面，糖芯片表面固定的糖分子缺乏移動(dòng)性，而這種移動(dòng)性對于細(xì)菌與糖的多效價(jià)相互作用至關(guān)重要。在細(xì)胞表面，糖一般以糖脂或糖蛋白的形式存在，它們所處的環(huán)境是可以移動(dòng)的脂質(zhì)雙分子層；另一方面，在基質(zhì)表面糖的固定密度難以控制。而糖的固定密度決定了細(xì)菌-糖之間發(fā)生單效價(jià)相互作用還是多效價(jià)相互作用。針對這兩個(gè)問題，Zhu等[32]將含有甘露糖的微小單層囊泡(Small unilamellar vesicle，SUV)固定在修飾有膽固醇-聚乙二醇(cholesteryl-PEG)的玻璃基底上，形成支撐脂質(zhì)雙分子層(Supported lipid bilayers，SLBs)。通過該方法制備的糖芯片充分模擬了細(xì)胞表面的微環(huán)境，使得Man具有移動(dòng)性，同時(shí)，可以通過控制SUV中Man的量來控制Man在SLBs上的密度。將E.coliORN178在該糖芯片上進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn)，利用顯微鏡觀察Man不同密度區(qū)域細(xì)菌粘附的數(shù)量，然后利用Langmuir等溫吸附模型計(jì)算它們的解離常數(shù)，當(dāng)Man的界面密度θM=0.2 nm-2時(shí)，E.coliORN178與Man的單效價(jià)親和結(jié)合常數(shù)為KD1=(1.0±0.2)×10-22mol/L，多效價(jià)親和結(jié)合常數(shù)KD2=(1.3±0.3)×10-27mol/L，此時(shí)多效價(jià)相互作用占主導(dǎo)；當(dāng)Man的界面密度θM=0.02 nm-2時(shí)，E.coliORN178與Man的單效價(jià)親和結(jié)合常數(shù)為KD1=1.0×10-21mol/L，多效價(jià)親和結(jié)合常數(shù)KD2=5.2×10-17mol/L，此時(shí)單效價(jià)相互作用占主導(dǎo)。由此，揭示了一種新的E.coli粘附機(jī)制，即隨著可移動(dòng)性Man密度的增加，凝集素FimH與Man的相互作用由單效價(jià)轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘈r(jià)，這種多效價(jià)相互作用進(jìn)一步激發(fā)了E.coli的多菌毛粘附，顯著增強(qiáng)了它們之間的結(jié)合力。

2.2 表面等離子體共振

表面等離子體共振(Surface plasmon resonance，SPR)是一種可以實(shí)時(shí)跟蹤生物分子相互作用的光學(xué)檢測技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是響應(yīng)快、免標(biāo)記。首先，將糖共價(jià)鍵合在金膜表面構(gòu)建生物傳感界面，然后將凝集素、細(xì)菌等分析物溶液以恒定流速流過傳感界面，當(dāng)兩者發(fā)生親和作用時(shí)，會(huì)引起生物傳感界面上質(zhì)量增加，從而導(dǎo)致界面折射率變化，并通過共振角信號(hào)的改變來顯示。反射率的變化(RI)與結(jié)合在金屬表面的生物大分子質(zhì)量成正相關(guān)，1 000 RU的變化表示傳感界面上1 ng/mm2的質(zhì)量變化[37-38]。目前，利用該方法研究糖-凝集素結(jié)合親和力的較多[39-41]，而用來研究糖-細(xì)菌結(jié)合親和力的較少。Bulard等[42]在金表面固定了巖藻糖(Fuc)、唾液酸(Neu5Ac)等7種糖，利用SPR來檢測這7種糖與大腸桿菌不同血清型K-12/O157∶H7/O157∶H7-/O55∶H7/O145∶H28-相互作用力的大小，依據(jù)親和力大小差異鑒別出E.coliO157∶H7，E.coliO157∶H7-和E.coliO145∶H28-這3種不同的菌株。

表面等離子體共振成像(SPR imaging)利用電荷耦合器件(Charge coupled device，CCD)記錄樣品反射光的圖像，從而進(jìn)行生物分子相互作用的動(dòng)態(tài)或靜態(tài)分析[43]。Smith等[44]以SPRi為檢測技術(shù)，并依據(jù)弗魯姆基等溫吸附方程(Frumkin isotherm)，計(jì)算了凝集素jacalin在Gal界面上的吸附系數(shù)KADS=(2.2±0.8)×107L/mol和凝集素ConA在Man界面上的吸附系數(shù)KADS=(5.6±1.7)×106L/mol。與SPR相比，SPRi最大的優(yōu)勢是易于與微陣列芯片結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)大量無需標(biāo)記樣品的原位、實(shí)時(shí)檢測。

2.3 電化學(xué)阻抗譜

電化學(xué)阻抗譜(Electrochemical impedance spectroscopy，EIS)技術(shù)可以通過測量多個(gè)參數(shù)對電極表面生物分子間的相互作用過程和動(dòng)力學(xué)機(jī)制加以分析。在檢測凝集素-糖相互作用方面,EIS展現(xiàn)出較高的靈敏度，Tkac等[45]利用阻抗糖生物傳感檢測流感病毒血凝素，檢測限可達(dá)amol/L數(shù)量級。此外，阻抗檢測具有無需標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，且越來越多的研究表明，基于阻抗檢測的生物傳感器件更易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、便攜化及高通量檢測。在國內(nèi)，鞠熀先課題組和朱俊杰課題組在該領(lǐng)域做了很出色的工作[46-48]。他們將不同的凝集素固定在電極表面，用EIS來檢測癌細(xì)胞表面糖基的動(dòng)態(tài)表達(dá)。近年來，EIS開始應(yīng)用到細(xì)菌-糖特異性識(shí)別相關(guān)的研究中。Guo等[49]將巰基化的甘露糖分子通過自組裝單分子層(SAMs)的方式固定在金電極表面，用電化學(xué)阻抗譜法來特異性檢測E.coliORN 178(特異性表達(dá)野生1型菌毛)，檢測限為102CFU/mL，但其構(gòu)建的甘露糖傳感界面在含有0.1 mol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)的PBS(pH 7.2)檢測液中5 h甚至2 d才能達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，耗時(shí)過長，易使傳感界面失去生物活性，所以，糖傳感界面的研究有待深入，電化學(xué)阻抗檢測液有待優(yōu)化。

由于電分析元件可以與微加工技術(shù)(MEMS)和微流控芯片平臺(tái)很好地融合，這使得它易于制備經(jīng)濟(jì)的現(xiàn)場檢測器件(POCT)[50-53]。La Belle等[54]制備了集成微電極的微流控芯片，利用電化學(xué)阻抗法檢測糖-凝集素的相互作用，取得了良好效果。在微流控芯片檢測單元中，待檢測樣品具有流動(dòng)性的特點(diǎn)，可以更加有效地模擬生理?xiàng)l件，且能縮短檢測時(shí)間。因此，將基于阻抗檢測的糖生物傳感與微流控芯片相結(jié)合，有望成為分析細(xì)菌-糖相互作用的有力工具。

2.4 石英晶體微天平

石英晶體微天平(Quartz crystal microbalance，QCM)是一種可檢測傳感器表面吸附物質(zhì)質(zhì)量變化的技術(shù)。在液相環(huán)境下，QCM 在測定生物樣品如蛋白質(zhì)、核酸、病毒、細(xì)菌及細(xì)胞等方面具有特色，測定共振頻率比較容易達(dá)到較高的精確度，目前已有在細(xì)菌-糖特異性識(shí)別中的應(yīng)用研究。Wang等[55]利用QCM研究了銅綠假單胞菌P.aeruginosaPAO1和大腸桿菌E.coliK-12與4種含有半乳糖(Gal)的高分子聚合物的相互作用，結(jié)果表明含有C-型凝集素的PaeruginosaPAO1在Ca2+的調(diào)節(jié)下可以與含有Gal的高分子較好的特異性識(shí)別。該課題組又在基于石英晶體微天平的生物傳感界面上固定了葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)及疏水性分子功能化的聚N-異丙基丙烯酰胺，通過檢測P.aeruginosaPAO1與不同界面之間的相互作用，證明了凝集素與糖的特異性相互作用在銅綠假單胞菌對宿主細(xì)胞粘附過程中起主導(dǎo)作用[56]。Ma等[57]在金電極表面設(shè)計(jì)了甘露糖(Man)和甘露糖-凝集素ConA(Man/ConA)兩種可以特異性檢測細(xì)菌的傳感界面，通過QCM檢測E.coliW1485，檢測限分別為1.7×104CFU/mL和50 CFU/mL。但QCM不易實(shí)現(xiàn)多組分檢測，且非特異性吸附干擾嚴(yán)重，因此干擾信號(hào)的消除有待進(jìn)一步解決。

3 致病菌-糖特異性識(shí)別的應(yīng)用研究進(jìn)展

3.1 細(xì)菌的分離與富集

細(xì)菌表面凝集素與糖具有較強(qiáng)的特異性識(shí)別親和力，所以利用糖基修飾的磁性納米粒子對細(xì)菌進(jìn)行分離富集有可能得到更佳的效果。El-Boubbou等[58]首次將Man和Gal修飾的二氧化硅包裹的四氧化三鐵磁性納米粒子用于E.coliORN178的分離。Hatch等[59]比較了幾種糖復(fù)合物修飾的磁珠與商業(yè)化多克隆抗體修飾的磁珠對污水中大腸桿菌的分離效率，發(fā)現(xiàn)糖復(fù)合物修飾的磁珠具有更好的選擇特異性和分離效果。Behra等[60]制備了Man修飾的多孔聚乙二醇(PEG)磁性微球，該微球可以選擇性結(jié)合溶液中特定的大腸桿菌菌株。由于PEG具有親水性，大大降低了該磁性微球與細(xì)菌的疏水相互作用，提高了結(jié)合特異性。另外，多孔磁性微球的捕獲效率比無孔磁性微球大3～4倍，當(dāng)細(xì)菌與該磁性微球的濃度比小于30∶1時(shí)，捕獲效率可達(dá)70%。

3.2 細(xì)菌的檢測與鑒別

在細(xì)菌檢測中，選擇穩(wěn)定性好、識(shí)別親和力高、易于固定在傳感界面上或納米粒子表面的特異性識(shí)別受體成為一大研究熱點(diǎn)[61-64]。細(xì)菌特異性識(shí)別受體主要有抗體(Abs)[65]、抗菌肽(AMPs)[66]、核酸適配體[67]、凝集素[68]、噬菌體[69]和分子印跡聚合物(MIP)[70]等。本課題組前期采用抗體檢測了沙門氏菌[71]。首先將第一抗體固定在微流控芯片的檢測區(qū)用于對沙門氏菌的捕獲，然后加入修飾有第二抗體的量子點(diǎn)，利用熒光法得到檢測限為37 CFU/mL。同時(shí)，本課題組設(shè)計(jì)并制備了碳量子點(diǎn)-適配體復(fù)合物納米粒子，利用適配體對鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測[72]，檢測限達(dá)到50 CFU/mL。然而，抗體存在對pH值和溫度的要求較高、不能區(qū)別死活細(xì)菌以及成本高等缺點(diǎn)；而適配體易被核酸酶降解，所以需尋找新的細(xì)菌檢測特異性識(shí)別受體。

由于致病菌表面凝集素與糖可以特異性識(shí)別，且它們之間多效價(jià)相互作用的親和力很高，所以糖成了細(xì)菌檢測領(lǐng)域很有開發(fā)潛力的特異性識(shí)別受體。與抗體相比，糖分子不會(huì)在溫度和pH值改變的情況下因變性而失去活性，且糖分子較抗體分子小，有利于在傳感界面上高密度固定，促進(jìn)多效價(jià)識(shí)別，增加特異性識(shí)別親和力，進(jìn)而提高細(xì)菌檢測靈敏度。Nilsson等[73]首次嘗試以二糖Galα1-4Galβ作為生物傳感器的識(shí)別元件，用來檢測大腸桿菌(表達(dá)P型菌毛),實(shí)驗(yàn)得到S/N=75，充分證明了糖分子可以作為細(xì)菌特異性檢測的識(shí)別受體。Jelinek等[74]在早期綜述了糖生物傳感器(Carbohydrate biosensors)用于致病菌檢測的原理及應(yīng)用，但其綜述的內(nèi)容主要集中在致病菌與糖或糖納米粒子相互作用的研究，真正用于致病菌檢測的較少，針對大腸桿菌的檢測研究檢測限均在104CFU/mL以上。Guo等[49]通過自組裝單分子層(SAMs)的方式，將巰基化的甘露糖分子固定在金電極表面，用電化學(xué)阻抗法來特異性檢測E.coliORN 178(特異性表達(dá)野生1型菌毛)，檢測限達(dá)到102CFU/mL。Ma等[57]將Man通過苯酚-聚噻吩連接鏈分子共價(jià)固定在金表面，通過Man與ConA的相互作用將ConA固定在界面上，得到了SM/TQ/Man/ConA傳感界面，以方波伏安法為檢測方法,E.coliW1485的檢測限達(dá)25 CFU/mL。Yazgan等[75]在Man上修飾了苯基，采用表面等離子體共振生物傳感器(SPR Biosensors)，對E.coliATCC25922的檢測限低至2.5 CFU/mL，這標(biāo)志著以糖為識(shí)別受體的生物傳感體系可以獲得與抗體或適配體相當(dāng)甚至更低的細(xì)菌檢測靈敏度。表2總結(jié)了1994～2015年以糖為識(shí)別受體檢測致病菌的相關(guān)文獻(xiàn)。

表2 以糖為識(shí)別受體的細(xì)菌檢測

(續(xù)表2)

GlycanreceptorPathogenDetectiontechnologyLinearityrangeCFU/mLLODCFU/mLReferenceMan-ConA7 5×102～7 5×1077 5×102Man-CdSquantumdotsE coliORN178E coliORN208CLSM104[85]Man-Poly(amidoamine)sE coliBL21CLSM102[86]Man/GalE coliORN178E coliORN208EIS1 2×102～2 5×103102[49]p?ThiolphenylaminomannoseE coli25922SPR/CV2 5～1 25×1052 5[75]Lewisa/b-NanoparticlesH pyloriJ99H pylori26695CLMS[87]ManE coliDH5αE coliHB101SWV6×102[88]ManE coliW1485QCM5×104～5×1071 7×104[57]SWV2 0×103～1 0×1048 0×102Man-ConAE coliW1485QCM2 5×102～2 5×10850SWV1 0×102～5 0×10325

圖5 MGNP3(Man)和MGNP4(Gal)鑒別3種E.coli 菌株的結(jié)果圖[59]Fig.5 E.coli strain differentiation by MGNP3(Man) and MGNP4(Gal)[59]

在二維空間和三維空間上增加糖密度，可增加有效結(jié)合位點(diǎn)，增大發(fā)生多效價(jià)相互作用的幾率，是提高糖生物傳感檢測靈敏度的主要途徑。Wang等[89]系統(tǒng)綜述了金屬納米材料、碳納米材料、量子點(diǎn)、磁性納米材料及硅納米材料等在糖生物傳感構(gòu)建中的功能，并介紹了其在細(xì)菌檢測方面的應(yīng)用。用糖作為識(shí)別受體來檢測細(xì)菌的主要挑戰(zhàn)之一是糖具有交叉特異性(Cross-specificity)或稱為廣譜特異性(Broad-specificity)，如Man既可與表達(dá)1型菌毛的大腸桿菌特異性識(shí)別，又可與鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯菌特異性識(shí)別，從而影響了糖生物傳感檢測細(xì)菌的特異性。因此，還需要科研工作者進(jìn)一步發(fā)掘與單一細(xì)菌特異性識(shí)別的糖鏈?；瘜W(xué)合成法可以根據(jù)需要在糖鏈上修飾其它功能性基團(tuán)，使得糖的特異性增強(qiáng)。另外，通過定性檢測不同致病菌或同一致病菌不同菌株亞型與幾種不同糖受體的結(jié)合親和力的大小，可以鑒別不同的細(xì)菌菌株[90-91]。El-Boubbou等[58]根據(jù)Man磁性糖納米粒子和Gal磁性納米粒子對E.coliORN178/ORN208/ES 3種菌株的不同捕獲率鑒別了這3種菌株，其結(jié)果如圖5所示。細(xì)菌-糖特異性識(shí)別的定量研究，將進(jìn)一步推動(dòng)糖識(shí)別配體對細(xì)菌特異性檢測和鑒別的研究進(jìn)程。

3.3 細(xì)菌生物膜形成的抑制

細(xì)菌生物膜(Bacterial biofilm)是附著在生物惰性或活性材料表面上的微生物群體。當(dāng)細(xì)菌處于生物膜狀態(tài)時(shí)，內(nèi)部的細(xì)菌能夠逃避抗生素或機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用，造成機(jī)體持續(xù)性感染或免疫性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康，同時(shí)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[92-93]。

圖6 糖納米粒子抑制細(xì)菌生物膜原理示意圖Fig.6 Schematic representation of ND-mannose ability to inhibit of biofilm formation

最近研究表明，糖納米粒子可以通過抑制細(xì)菌粘附來擾亂生物膜的形成(圖6)。Barras等[94]和Khanal等[95]分別合成了Man修飾的金剛石納米粒子ND-Man和ND-Man3，利用吸光度法測試其對E.coli在96孔板聚氯乙烯(PVC)表面上培養(yǎng)24 h后生物膜形成狀況的影響。結(jié)果表明，當(dāng)ND-Man的濃度為80 μmol/L，ND-Man3的濃度為21 μmol/L時(shí)，可以顯著抑制E.coil生物膜的形成。這可能是由于糖納米粒子阻止了菌毛FimH粘附蛋白對PVC的粘附。將細(xì)菌先在96孔板上培養(yǎng)24 h，待生物膜形成后，再加入該糖納米粒子，則不再影響細(xì)菌生物膜的狀態(tài)。

P.aeruginosa生物膜的形成與其表面的凝聚素LecA和LecB相關(guān)。Johansson等[96]篩選出2種針對LecB的巖藻糖多肽樹枝狀大分子FD2(C-Fuc-LysProLeu)4(LysPheLysIle)2LysHisIleNH2和PA8(OFuc -LysAlaAsp)4(LysSerGlyAla)2LysHisIleNH2，其中FD2 可以有效抑制P.aeruginosa生物膜的形成(IC50=10 μmol/L)，并有效驅(qū)散已經(jīng)形成的生物膜。這說明LecB的多效價(jià)糖類抑制劑可以作為抑制和驅(qū)散生物膜的有效試劑。Reymond課題組制備了多種半乳糖苷修飾的多肽樹枝狀大分子，通過抑制LecA來抑制或驅(qū)散P.aeruginosa生物膜[97-99]，發(fā)現(xiàn)多效價(jià)的糖配體對于生物膜形成抑制至關(guān)重要。Boukerb等[9]制備了四效價(jià)的半乳糖苷(Gal)和巖藻糖苷(Fuc)修飾的芳烴硼酸大分子，并利用吸光度法檢測其對P.aeruginosa在96孔板上培養(yǎng)24 h后生物膜形成狀況的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)其濃度為5 mmol/L時(shí)，能明顯減少P.aeruginosaPAO1生物膜的形成，而單效價(jià)的βGalOMe和αFucOMe對生物膜的形成無顯著影響。對照組實(shí)驗(yàn)中，四效價(jià)甘露糖苷和葡糖糖苷卻不能有效抑制生物膜形成，表明糖苷抑制細(xì)菌生物膜形成具有特異性。多效價(jià)糖簇之所以能抑制生物膜的形成，可能是由于細(xì)菌表面的凝集素參與或能促進(jìn)生物膜的形成，但具體的參與機(jī)制以及多效價(jià)糖簇抑制生物膜生成的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

3.4 糖類抗菌藥物的篩選

致病菌對傳統(tǒng)抗生素的耐藥性日益增強(qiáng)，所以研發(fā)新的作用模式或針對細(xì)菌新靶點(diǎn)的抗菌藥物具有巨大意義。天然多糖、糖聚合物、糖簇、糖樹枝狀大分子及糖納米粒子等可以通過抑制細(xì)菌的粘附來預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病，具有取代抗生素的潛能[100]。體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，能特異性識(shí)別細(xì)菌菌毛凝集素的可溶性多糖可以阻止相應(yīng)細(xì)菌對哺乳動(dòng)物細(xì)胞的粘附，且糖類抗粘附藥物并不是殺死細(xì)菌，這使得細(xì)菌的突變速度減慢，耐藥性降低[101]。所以糖類抗粘附藥物在感染性疾病治療方面展現(xiàn)出光明的前景。

擬糖物(Glycomimetic)是人工合成的多效價(jià)糖化合物分子，與天然聚糖相比，具有代謝穩(wěn)定性。同時(shí)，它可與致病菌凝集素發(fā)生高選擇性、高親和力的特異性識(shí)別，是抗粘附藥物篩選的重要對象[102]。擬糖物包括糖樹枝狀大分子、糖復(fù)合物、糖聚合物和糖納米粒子等，其設(shè)計(jì)與合成需要考慮的因素有糖的密度、糖的空間排列、支架、連接鏈以及均勻多效價(jià)還是非均勻多效價(jià)等。關(guān)于這方面的內(nèi)容，已有相關(guān)綜述報(bào)道[103-104]。

針對E.coli引起的尿道感染性疾病，Appeldoorn等[105]合成了系列多效價(jià)的甘露糖化合物，測試了其抗粘附特性，為抗粘附藥物的研究提供了基礎(chǔ)。Hartmann等[106]合成5種帶有不同官能團(tuán)的甘露糖苷，檢測了它們對E.coliPKL1162粘附哺乳動(dòng)物結(jié)腸細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示修飾有苯環(huán)和β-內(nèi)酰胺環(huán)的甘露糖苷具有優(yōu)異的抗粘附特性且細(xì)胞毒性很低。Chaudhary等[107]制備了一系列不同形貌的糖基化金納米粒子并檢測它們的抗粘附和抗感染性能，結(jié)果表明，甘露糖基化的金納米粒子呈棒狀結(jié)構(gòu)時(shí)比球狀或星狀具有更強(qiáng)的抗感染能力。

4 總結(jié)與展望

糖組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后，生物化學(xué)領(lǐng)域的又一大科學(xué)研究前沿。由于糖鏈的結(jié)構(gòu)與功能比核苷酸鏈和多肽鏈更加豐富和復(fù)雜，所以，糖組學(xué)的研究是一個(gè)非常龐大而又繁重的任務(wù)。致病菌-糖特異性識(shí)別是該龐大任務(wù)中很小但很重要的一個(gè)研究點(diǎn)，它可為致病菌的特異性分離、富集、檢測、鑒別、生物膜抑制以及抗生素替代藥物的篩選等提供新的解決方案。

本文總結(jié)了致病菌-糖特異性識(shí)別的機(jī)制機(jī)理及新型的研究方法和技術(shù)，重點(diǎn)歸納總結(jié)了近20年來相關(guān)的應(yīng)用研究進(jìn)展。致病菌之所以能夠粘附宿主細(xì)胞表面進(jìn)而侵染細(xì)胞引起疾病，主要是因?yàn)槠浔砻娴哪嘏c宿主細(xì)胞表面的聚糖發(fā)生多效價(jià)特異性識(shí)別。為了進(jìn)一步闡明致病菌-糖特異性識(shí)別的機(jī)制，并將該類機(jī)制應(yīng)用到細(xì)菌檢測以及相關(guān)疾病的治療中，強(qiáng)有力的研究方法和技術(shù)必不可少。本文重點(diǎn)介紹了既能用于機(jī)制研究、結(jié)合親和力計(jì)算，又能用于細(xì)菌檢測、藥物篩選的4種檢測技術(shù)，即熒光光譜、表面等離子體共振、電化學(xué)阻抗譜和石英晶體微天平。熒光技術(shù)在生物成像、標(biāo)志物追蹤方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。其余3種技術(shù)均具有無需標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，可以盡可能的避免外來物質(zhì)的干擾，使檢測體系變得更加簡單且接近于生物體系本身。同時(shí)，這4種檢測技術(shù)都易于集成到微陣列芯片或微流控芯片平臺(tái)上，通過它們的結(jié)合，研究快速、靈敏、高通量、便攜化的檢測新方法將是目前乃至今后一段時(shí)間的研究熱點(diǎn)。

以糖作為致病菌檢測、鑒別的特異性識(shí)別受體，以糖類化合物或糖納米粒子作為抑制細(xì)菌感染和生物膜形成的替代藥物是基于致病菌-糖特異性識(shí)別機(jī)制研究的具體應(yīng)用，但目前還停留在實(shí)驗(yàn)研究階段，并未進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。主要面臨的挑戰(zhàn)有以糖作為識(shí)別受體具有交叉特異性，使得檢測特異性降低。再者，致病菌的同一條染色體所攜帶的基因會(huì)表達(dá)多種凝集素，當(dāng)其所表達(dá)的凝集素不同時(shí)，糖類藥物抑制其感染的效果會(huì)變差。同時(shí)，單糖對致病菌凝集素的親和力很低，并不能有效抑制其感染，所以了解致病菌凝集素的表達(dá)規(guī)律，設(shè)計(jì)并合成結(jié)合親和力強(qiáng)、生物相容性好的糖化合物或糖微米/納米粒子是目前該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

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Specific Recognition of Pathogenic Bacterium towards Glycan and Its Applications in Analytical Chemistry

CUI Fei-yun1,3,4,XU Yi1,2,3,4*,ZHAO Bin1,3,4,CHE Yu-lan1,3,4,LIU Lu-lu1,3,4

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China;2.Microsystem Research Center,School of Optoelectronic Engineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China; 2.Defense Key Disciplines Lab of Novel Micro-Nano Devices and System Technology,Chongqing University, Chongqing 400044,China;4.International R&D Center of Micro-Nano Systems and New Materials Technology,Chongqing University,Chongqing 400044,China)

Pathogen adhesion to host tissue is a prerequisite for a majority of infectious diseases.A common way for accomplishing adhesion is specific recognition of bacterium cellular lectins towards glycan on the surface of the host cells.Therefore,research on pathogenic bacteria-glycan interactions is beneficial to further understand the pathogenic mechanism of infectious diseases.Meanwhile,it could provide new strategies for specific detection on pathogenic bacteria and treatment of infectious diseases,and the mechanisms related with adhesion of pathogenic bacteria,carbohydrate-lectin interactions and multivalent interactions were summed up.The analysis technologies of pathogenic bacteria-glycan interactions were introduced,especially,the latest development and research of surface plasmon resonance,quartz crystal microbalances,fluorescence spectrum and electrochemical impedance spectroscopy were summarized.Special attention was paid to the combination of those detecting technologies and microfluidic chip platforms.In view of the serious problems of antibiotics resistance and poor specificity of pathogenic bacteria detection,the applications of bacterial isolation,enrichment,detection,identification,biofilm inhibition and the screening of antimicrobial agents were reviewed.Finally,the future development for basic research and application of pathogenic bacteria-glycan interactions were prospected.

carbohydrate-lectin interactions;multivalent interactions;bacterial adhesion;bacterial detection；review

2016-12-15；

2017-02-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21375156)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2015AA021104)；重慶市前沿研究重點(diǎn)項(xiàng)目(cstc2015jcyjBX0010)；重慶市科技惠民項(xiàng)目(cstc2015shmszx00014)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.021

O657.1;R379

A

1004-4957(2017)06-0817-12

*通訊作者：徐 溢，博士，教授，研究方向:微流控芯片生化分析，Tel:023-65111022，E-mail:xuyibbd@sina.com