許淑文，李艷，李繼強(qiáng)，戴雯

（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢430060；2.武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北武漢430022）

·論著·

穩(wěn)定高表達(dá)TGF-β1的大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定

許淑文1，李艷1，李繼強(qiáng)2，戴雯1

（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢430060；2.武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北武漢430022）

目的構(gòu)建及鑒定穩(wěn)定高表達(dá)TGF-β1的大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株。方法利用RNA干擾技術(shù)提取pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒后采用ABI3130基因測序儀進(jìn)行測序鑒定，將鑒定后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株，利用G418篩選轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞，通過RT-PCR和Western blot技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染后的H9c2細(xì)胞進(jìn)行鑒定，本實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染了pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒和pEGFP對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞株分為pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒組和pEGFP對(duì)照質(zhì)粒組。結(jié)果pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒測序結(jié)果包含TGF-β1序列，篩選后的pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒組和pEGFP對(duì)照質(zhì)粒組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分別為85%和93%。RT-PCR結(jié)果顯示，pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量為(2.563±0.198)，與對(duì)照組(1.037±0.022)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.056，P=0.028)；Western blot結(jié)果顯示，pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量為(3.275±0.234)，顯著高于對(duì)照組的(1.011±0.015)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.372，P=0.015)。結(jié)論本研究所構(gòu)建的大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株能穩(wěn)定高表達(dá)TGF-β1，可用于后續(xù)TGF-β1在大鼠心肌細(xì)胞的生物學(xué)作用及相關(guān)信號(hào)通路的研究。

大鼠心肌細(xì)胞；H9c2細(xì)胞株；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；質(zhì)粒

轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是在心衰過程中急劇增加的重要細(xì)胞因子，它是一種調(diào)控細(xì)胞生長的關(guān)鍵細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)免疫、細(xì)胞增殖與凋亡、創(chuàng)傷修復(fù)、胚胎發(fā)生和造血調(diào)控[1]。研究顯示，TGF-β1可促進(jìn)組織纖維化和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同時(shí)使巨噬細(xì)胞失活并抑制炎癥趨化因子的表達(dá)。而壓力負(fù)荷增加的心力衰竭動(dòng)物學(xué)模型表明，在胸主動(dòng)脈縮窄后進(jìn)行TGF-β1抑制可減少纖維化，且可以在不造成心肌肥厚的情況下改善心臟收縮功能[2]。因此，TGF-β1將可能成為治療心衰的新靶點(diǎn)。本研究將利用pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)TGF-β1的大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株，為后續(xù)研究TGF-β1在大鼠心肌細(xì)胞中的生物學(xué)作用及相關(guān)信號(hào)通路提供細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈霉素-青霉素雙抗、G418、β-actin一抗、TGF-β1一抗、Licor熒光二抗、Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、GAPDH引物、TGF-β1引物、奧德賽掃膜儀(購自美國LICOR公司)、正置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、倒置熒光顯微鏡(購自日本OLYMPUS公司)。

1.2 細(xì)菌、質(zhì)粒和細(xì)胞株大腸桿菌DH5α及pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，載體為GV143質(zhì)粒，表達(dá)卡那霉素原核抗性、新霉素真核抗性及綠色熒光蛋白EGFP。大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株購自中科院細(xì)胞庫，H9c2細(xì)胞采用含10%胎牛血清和1%鏈霉素-青霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒的提取及鑒定分別將含有pEGFP-TGF-β1的高表達(dá)質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒的感受態(tài)大腸桿菌DH5α接種在具有卡那霉素抗性的LB平板上培養(yǎng)并挑選單菌落克隆，將挑選出來的單克隆菌落接種到含新霉素的150 mL LB培養(yǎng)基，置于37℃、300 r/min搖床過夜。本實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染了pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒和pEGFP對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞株分為pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒組和pEGFP對(duì)照質(zhì)粒組。采用QIAGEN公司的中量質(zhì)粒抽提試劑盒提取pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒100μL。利用ABI3130基因測序儀對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序引物序列為5'-GATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCACTTCAGACACAGAAATCAAC-3'。

1.4 pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及篩選將大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株接種于六孔板，采用含10%胎牛血清和1%鏈霉素-青霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞增殖到覆蓋培養(yǎng)基底部90%以上面積時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取兩支無菌EP管，加入100μL不含血清及雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，分別向培養(yǎng)基中加入1.2μL高表達(dá)TGF-β1質(zhì)粒和陰性對(duì)照鏈大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株質(zhì)粒，混勻后分別加入5μL Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻后室溫下靜置10～15 min以便轉(zhuǎn)染復(fù)合體的形成，將轉(zhuǎn)染體系分別加入含有2 mL的培養(yǎng)基的H9c2細(xì)胞孔中，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后給細(xì)胞換液，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況(見圖1)。利用G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞增殖到95%以上時(shí)，向培養(yǎng)基中加入G418 1μL，每日觀察細(xì)胞生長情況及綠色熒光表達(dá)情況，當(dāng)存活細(xì)胞剩余10%～20%時(shí)給細(xì)胞換液，重復(fù)篩選步驟4～5次。

1.5 穩(wěn)定高表達(dá)TGF-β1的大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株的鑒定采用RT-PCR和Western blot對(duì)構(gòu)建的穩(wěn)定高表達(dá)TGF-β1的大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株進(jìn)行鑒定。RT-PCR引物：GAPDH(上游引物：5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'；下游引物：5'-GTCCACC ACCCTGTTGCTGTAG-3')，TGF-β1(上游引物：5'-GGA CTACTACGCCAAAGAAG-3'；下游引物5'-TCAAAA GACAGCCACTCAGG-3')。

1.6 TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)定量對(duì)轉(zhuǎn)染pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒后的心肌細(xì)胞H9c2進(jìn)行總RNA提取，對(duì)提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳，利用PCR條帶分析軟件分析條帶灰度值并計(jì)算TGF-β1相對(duì)于內(nèi)參GAPDH的mRNA表達(dá)量(TGF-β1/GAPDH)。并對(duì)轉(zhuǎn)染pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒后的心肌細(xì)胞H9c2進(jìn)行總蛋白提取，將提取的蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳及蛋白印跡分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用Odyssey軟件分析蛋白印跡灰度值并分別計(jì)算相對(duì)于內(nèi)參GAPDH的蛋白表達(dá)量(TGF-β1/GAPDH)。經(jīng)三次以上實(shí)驗(yàn)，條帶灰度值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P?0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒鑒定ABI3130基因測序儀測序結(jié)果顯示質(zhì)粒序列中包含以下堿基序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫TGF-β1基因序列比對(duì)完全一致，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功[3]。

2.2 pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和篩選結(jié)果比較pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒和pEGFP陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。通過細(xì)胞熒光顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染效率為22%，pEGFP對(duì)照組為29%。利用G418篩選4個(gè)周期后，pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率為85%，pEGFP對(duì)照組為93%，見圖1。

圖1pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及篩選結(jié)果注：A，轉(zhuǎn)染前；B，轉(zhuǎn)染48 h；C，G418篩選4個(gè)周期。

2.3 穩(wěn)定高表達(dá)TGF-β1的大鼠心室肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株的鑒定結(jié)果

2.3.1 RT-PCRpEGFP-TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量為(2.563±0.198)，與對(duì)照組的(1.037±0.022)比較顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.056，P=0.028)，表明染pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒明顯增強(qiáng)BAG3基因的轉(zhuǎn)錄，見圖2。

圖2RT-PCR結(jié)果注：A，瓊脂糖凝膠電泳；B，TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量；與對(duì)照組比較，aP?0.05。

2.3.2 Western blotpEGFP-TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量為(3.275±0.234)，顯著高于對(duì)照組的(1.011±0.015)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 4.372，P=0.015)，表明pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒明顯增加TGF-β1蛋白表達(dá)量，見圖3。

圖3Western blot結(jié)果注：A，瓊脂糖凝膠電泳；B，TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量；與對(duì)照組比較，aP?0.05。

3 討論

心力衰竭是由于心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變?cè)斐尚呐K回流和射血功能受損的一種復(fù)雜臨床綜合征。心力衰竭已成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，目前全球約有3 800萬HF患者，近15年來HF發(fā)病率以每年50%的速率增加[4]。TGF-β是在HF過程中急劇增加的重要細(xì)胞因子，它是一種調(diào)控細(xì)胞生長的關(guān)鍵細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)免疫、細(xì)胞增殖與凋亡、創(chuàng)傷修復(fù)、胚胎發(fā)生和造血調(diào)控。TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三種亞型中以TGF-β1為主，廣泛存在于人體多種細(xì)胞，如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，TGF-β1是心血管系統(tǒng)中最主要的亞型[5]。低水平TGF-β1是維持人體正常生理功能所必需，當(dāng)心臟損傷、壓力超負(fù)荷、氧化應(yīng)激、炎癥刺激等多種因素存在時(shí)，TGF-β1明顯上調(diào)，此時(shí)TGF-β1將主要發(fā)揮促炎、促纖維化和促凋亡的作用[1，6]。TGF-β1可刺激CFs增生、膠原合成、心肌細(xì)胞肥大，在心室重構(gòu)中起著極其重要的作用[7]。TGF-β1作為最重要的促M(fèi)F細(xì)胞因子，其表達(dá)的負(fù)調(diào)控可能對(duì)抑制MF發(fā)揮重要的作用，可作為心力衰竭的治療靶點(diǎn)[8]。對(duì)TGF-β1表達(dá)的研究將為心力衰竭的防治提供更多依據(jù)，而本研究通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)TGF-β1的心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株，有利于心力衰竭的基礎(chǔ)研究。

GV143載體是由海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司開發(fā)的高效真核表達(dá)載體，在其載體序列中，含有TGF-β1基因，被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組后，通過轉(zhuǎn)錄、翻譯，能夠獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長，未整合目的質(zhì)粒的細(xì)胞在長期G418的壓力下會(huì)發(fā)生死亡，這樣就可以使用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)TGF-β1的心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞系[9-10]，在本實(shí)驗(yàn)中，我們篩選出的心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞系經(jīng)過多次傳代，仍然能夠穩(wěn)定表達(dá)TGF-β1基因，表達(dá)效率近90%，達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

本研究采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，在基因測序證實(shí)質(zhì)粒包含特定序列后將pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒pEGFP轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株，并用G418進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選，利用熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況從而確定pEGFP-TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和pEGFP對(duì)照組轉(zhuǎn)染效率分別為86%和89%，通過采用RT-PCR、Western blot及免疫熒光分析等手段鑒定構(gòu)建的心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株能穩(wěn)定高表達(dá)TGF-β1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)TGF-β1質(zhì)粒，心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞系TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著升高。構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)TGF-β1質(zhì)粒可以用于后續(xù)TGF-β1在心肌細(xì)胞中的生物學(xué)作用及相關(guān)信號(hào)通路的研究。

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Construction and identification of rat cardiomyocyte H9c2 cell line with stable and high expression of TGF-β1.

XU Shu-wenLI Yan,LI Ji-qiang,DAI Wen.
1.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA;2.Department of Neurosurgery,the First Hospital of Wuhan,Wuhan 430022, Hubei,CHINA

ObjectiveTo construct and identify rat cardiomyocyte H9c2 cell line with stable and high expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1).MethodsPlasmid pEGFP-TGF-β1was extracted by RNA interference,and sequenced by ABI3130 Genetic Analyzer for identification.The identified pEGFP-TGF-β1were then transfected into rat cardiomyocyte H9c2 cell line(pEGFP-TGF-β1group).After screening culture by G418,the expression of TGF-β1was verified by RT-PCR and Western blot.The cells transfected withempty control plasmid pEGFP were used as the control group.ResultsThe sequencing results confirmed that pEGFP-TGF-β1extracted contained TGF-β1sequence.The transfection efficiency of pEGFP-TGF-β1group and control group were 85%and 93%,respectively. RT-PCR showed that TGF-β1mRNA expression level was(2.563±0.198)in pEGFP-TGF-β1group,which was significantly higher than(1.037±0.022)in control group(t=3.056,P=0.028).Western blot revealed that TGF-β1protein expression level was(3.275±0.234)in pEGFP-TGF-β1group,which was significantly higher than(1.011±0.015)in control group(t=4.372,P=0.015).ConclusionThe constructed rat cardiomyocyte H9c2 cell line could stably express TGF-β1at high level,which could be used for our further research regarding the role of TGF-β1in rat cardiomyocyte and the related signaling pathway.

Rat cardiomyocyte;H9c2 cell line;Transforming growth factor-β1(TGF-β1);Plasmid

R-332

A

1003—6350（2017）11—1721—041,121

2017-02-22)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.11.001

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81572069、81501815）

李艷。E-mail：yanlitf1120@163.com