余萍，范翠翠

（漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司，沈陽110023）

鼠李糖乳桿菌（H0107）凍干保護(hù)劑的優(yōu)化

余萍，范翠翠

（漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司，沈陽110023）

以鼠李糖乳桿菌為研究對象，研究凍干保護(hù)劑脫脂乳粉、麥芽糊精、海藻糖、葡聚糖及甘油對菌株凍干存活率的影響。在鑒定菌種的基礎(chǔ)上，先后通過單因素實驗和正交實驗得出最佳凍干保護(hù)劑組合，并進(jìn)行驗證，此配方凍干存活率為96.38%，根據(jù)配方的組成闡述凍干保護(hù)機(jī)理。

鼠李糖乳桿菌；凍干保護(hù)劑；存活率

0 引言

鼠李糖乳桿菌是由Sherwood Gorbach和Barry Goldin發(fā)現(xiàn)的一種益生菌，并命名[1]，LGG可以影響有害菌在腸道中的定植與克隆，同時還可以通過吸附和利用體內(nèi)的毒素作為營養(yǎng)源，從而起到減少毒素對機(jī)體的影響[2]，提高免疫力等作用。LGG在保存和加工過程為了保持其活力，通常利用冷凍干燥技術(shù)來去除菌體中的水分，降低菌體的新陳代謝，從而達(dá)到保存的目的。但是在凍干的過程中，由于水分子結(jié)晶會受到蛋白質(zhì)變性或是細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)作用的損傷[3]。為了保護(hù)菌體，在凍干時會加入保護(hù)劑。由于不同菌種的代謝情況和抗冷凍能力不同，因此保護(hù)劑的成分以及各成分的含量就非常重要[4]。本實驗以鼠李糖乳桿菌H0107為研究對象，經(jīng)鑒定后利用單因素和正交實驗得出LGG的最佳保護(hù)劑配方。

1 實驗

1.1 MRS培養(yǎng)基

將蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80為1.0 mL，K2HPO4·7H2O為2.0 g，醋酸鈉·3H2O為5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，MgSO4· 7H2O為0.2 g，MnSO4·4H2O為0.05 g，瓊脂粉15.0 g加入1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，待溫度下降到25℃后用濃度為0.1 mol/L的鹽酸和濃度為0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.2，并分裝，在121℃下高壓滅菌15 min備用。

1.2 菌泥的制備

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，GG，LGG）H0107來源于漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司實驗室菌種庫。配制MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基60 mL，將培養(yǎng)基加入玻璃試管中，每只10 mL，滅菌后于37℃培養(yǎng)24 h，再按2%的量接種活化3代對數(shù)期的菌種，所得菌種在轉(zhuǎn)速為6 000 r/min[5]（10℃）條件下離心10 min，去除上清液，得到鼠李糖乳桿菌菌泥。

1.3 方法

1.3.1 菌種鑒定

方法見GB 478935-2010對鼠李糖乳桿菌的形態(tài)及糖發(fā)酵能力進(jìn)行鑒定。

1.3.2 冷凍干燥菌粉的制備與活菌計數(shù)

將保護(hù)劑按照要求用無菌水配置好，用濃度為0.1 mol/L鹽酸將pH值調(diào)至7.2后在115℃（30 min）的條件下進(jìn)行滅菌，滅菌結(jié)束后，待溫度冷卻至20℃以下才可使用。將制備好的菌泥與保護(hù)劑混合，混合比例為1∶1（質(zhì)量比），制成10 mL菌懸液，先在-25℃下與冷凍24 h，后逐步升溫，每次提升5℃，直至30℃，當(dāng)菌粉含水量小于2%凍干完成。凍干后的菌粉需在25℃以下，濕度小于50%的環(huán)境中收集，將得到菌粉用無菌袋密封好，用橡膠錘將大塊敲碎；粉碎機(jī)進(jìn)行間歇式細(xì)粉，粉碎后過100目篩，封存于冰柜中。

將得到的菌粉與10 mL生理鹽水混合，攪拌成菌懸液后進(jìn)行稀釋涂布并培養(yǎng)，根據(jù)菌落總數(shù)確定凍干數(shù)量，來計算凍干存活率，平行三次實驗[6]。

1.4.2 凍干保護(hù)劑單因素實驗

選用5種保護(hù)劑，分別為脫脂乳粉（1%，5%，10%，15%，18%）；麥芽糊精（1%，2%，4%，8%，10%）；海藻糖（3%，4%，5%，7%，9%）；甘油（0.2%，0.5%，1.0%，1.2%，1.5%）；葡聚糖（1%，3%，4%，5%，7%）[7]。

1.4.3 正交試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果選擇各因素保護(hù)能力較好的濃度水平，并利用正交組合的方法優(yōu)化保護(hù)劑的配比，并測得每個結(jié)果的活菌數(shù)量，計算存活率。

2 結(jié)果

2.1 菌種鑒定結(jié)果

經(jīng)鑒定后結(jié)果如圖1所示。圖1中，此菌株為革蘭氏陽性菌，菌體呈規(guī)則桿狀，通常斷裂成鏈狀，無芽孢，在MRS培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h，菌落直徑1～2 mm，表面光滑、中央有凸起或扁平的白色菌落、不透明、有光澤、質(zhì)地軟。由糖發(fā)酵實驗可知，其對可利用七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖發(fā)酵而不可利用棉子糖發(fā)酵，是鼠李糖乳桿菌典型的生化反應(yīng)特征，因此可以證明，本實驗所用菌種為鼠李糖乳桿菌。

圖1 菌種鑒定結(jié)果

2.2 單因素實驗結(jié)果

由圖2可以看出，脫脂乳粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～15%時菌粉凍干存活率最高，麥芽糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～8%時效果最好，海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～9%時凍干結(jié)果最好，甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～1.2%時結(jié)果最好，葡聚糖幾乎對菌體沒有保護(hù)效果。

圖2 五種保護(hù)劑凍干效果

為了更好的保證菌體的存活率，一般選擇幾種保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配。本實驗中我們選擇單因素實驗中結(jié)果較好的保護(hù)劑分別為麥芽糊精、海藻糖、甘油以及脫脂乳粉進(jìn)行接下來的正交實驗，正交實驗的因素水平如表1所示。

表1 因素與水平

表2為正交實驗結(jié)果。由表2可以看出，各因素對鼠李糖乳桿菌H0107凍干效果影響順序為C＞D＞A＞B，即海藻糖＞甘油＞脫脂奶粉＞麥芽糊精，得到最佳的凍干保護(hù)劑配方為脫脂乳粉10%，麥芽糊精4%，海藻糖7%，甘油1%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；以此條件進(jìn)行驗證實驗，活菌存活率為96.38%，保護(hù)效果最好。

表2 鼠李糖乳桿菌H0107凍干保護(hù)劑正交組合優(yōu)化結(jié)果

3 討論

糖和醇在凍干過程中可以保護(hù)菌體是因為其具有多個羥基，隨著溫度的下降，這些羥基代替了水分子與細(xì)胞膜中的磷酸基團(tuán)形成氫鍵[8]，一方面減小了機(jī)械損傷，另一方面增大了空間，使磷脂之間不產(chǎn)生空間結(jié)構(gòu)變化引起細(xì)胞死亡[9]，同時利用同樣的原理，糖和醇與蛋白質(zhì)結(jié)合，保證了蛋白質(zhì)原有的結(jié)構(gòu)和功能[10]。脫脂乳粉中含有的蛋白質(zhì)可以作為大分子保護(hù)劑來保證菌類的存活率，其主要是吸附在菌類的細(xì)胞壁外，通過提高溶液的粘度，在凍干過程中會形成不規(guī)則的網(wǎng)狀空間[11]，從而減小了菌體的機(jī)械損傷，大分子保護(hù)劑還可以促進(jìn)低分子保護(hù)劑發(fā)揮作用。

海藻糖本身具有穩(wěn)定生物膜和蛋白質(zhì)的作用，被當(dāng)做保存劑廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)和食品領(lǐng)域，從結(jié)構(gòu)來看，每個海藻糖分子含有8個羥基[12]，同時每個甘油分子中含有3個羥基，因此此配方可以為菌體提供大量的羥基，在凍干過程中保護(hù)菌體。另一方面，脫脂乳粉所提供的大量蛋白質(zhì)可以很好的為具體提供中空的保護(hù)結(jié)構(gòu)[13]。

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Optimization for cryoprotectant of Lactobacillus rhamnosus H0107

YU Ping,FAN Cuicui
（Han's(Shenyang)children's products Co.Ltd.，Shenyang 110023，China）

Lactobacillus rhamnosus is as the research object in this experimenta.Study on five cryoprotectors of freeze-dried survival strains, which are skimmed milk powder,malt,trehalose,glucan and glycerol.First we identified strains,then got the best combination of freeze dry?ing protective agents with single factor experiment and orthogonal experiment.Verified with experiment,survival rate of this formula of freeze drying protective agent is 96.38%.At last,this paper explains the protective mechanism of freeze drying according this formula.

Lactobacillus rhamnosus;freeze drying protective agent;survival rate

Q93-335

A

1001-2230（2017）05-0014-03

2016-10-31

余萍（1982-），女，碩士研究生，從事食品營養(yǎng)與益生菌方面的研究。