朱毓華，潘波，毛勇，吳平

(娃哈哈集團(tuán)有限公司質(zhì)量監(jiān)控部，杭州310018)

原料乳顯微鏡直接細(xì)菌計數(shù)方法

朱毓華，潘波，毛勇，吳平

(娃哈哈集團(tuán)有限公司質(zhì)量監(jiān)控部，杭州310018)

通過對原料乳細(xì)菌數(shù)量采用顯微鏡直接細(xì)菌計數(shù)方法和國標(biāo)GB478.2-2010菌落總數(shù)測定方法進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，確定了顯微鏡直接細(xì)菌計數(shù)方法和國標(biāo)GB478.2-2010方法間良好相關(guān)性。結(jié)果表明，顯微鏡直接計數(shù)方法檢測時間短，且檢測成本低廉，可以作為原料乳驗(yàn)收的輔助方法使用。

原料乳；顯微鏡直接計數(shù)；細(xì)菌；快速方法

0 引言

原料乳細(xì)菌總數(shù)是衡量生牛乳原料的重要指標(biāo)[1]。然而鮮乳的菌落總數(shù)指標(biāo)按照GB478.2-2010方法進(jìn)行檢測需時48h，無法滿足原料乳快速驗(yàn)收的要求。如果細(xì)菌超標(biāo)的原料乳被用于加工生產(chǎn)，則為加工過程乃至終產(chǎn)品品質(zhì)帶來影響。

現(xiàn)今用于鮮乳快速計數(shù)的檢測方法有顯微鏡檢法[2-3]、流式細(xì)胞計數(shù)法45、還原實(shí)驗(yàn)法光電法[6]、電導(dǎo)分析法與阻抗分析法[7]、ATP熒光計數(shù)法[8-9]、PCR技術(shù)[10]。各種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，有的方法快速但成本昂貴，有的方法操作繁瑣復(fù)雜。

顯微鏡直接計數(shù)法是基于光學(xué)顯微鏡觀察方法，對視野中單個細(xì)菌、菌團(tuán)、酵母、霉菌等微生物的直接計數(shù)方法。本文摸索生乳細(xì)菌直接鏡檢計數(shù)方法并與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法進(jìn)行比對，現(xiàn)就該方法的具體情況做一闡述。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

2016年5月和6月三次在娃哈哈公司奶源基地采集牛乳，每次采集牛乳10個左右，25室溫保存直至檢測，3次共計28個樣品；0.1%呂氏堿性美藍(lán)染色液；平板計數(shù)瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺，高壓滅菌鍋，生化培養(yǎng)箱，漩渦震蕩儀，顯微鏡。

1.3 方法

采用菌落總數(shù)計數(shù)和顯微鏡直接計數(shù)方法對同一樣品，同時進(jìn)行取樣的模式進(jìn)行檢測。

1.3.1 菌落總數(shù)

參見GB4789.2-2010。

1.3.2 顯微鏡直接計數(shù)方法

（1）涂片。在載玻片上用標(biāo)尺畫1 cm×1 cm方框，用微量移液器吸取10 μL振蕩后的牛乳，滴加至方框中央，并用無菌接種環(huán)將奶液涂勻使其平鋪于方框內(nèi)。

（2）風(fēng)干。將涂布好的標(biāo)本置于通風(fēng)處吹干至完全干燥。

（3）固定。將玻璃染色支架放在沸水浴上，然后將干燥的涂片置于染色支架上。用蒸汽固定10 min以上。并風(fēng)干。

（4）染色。取0.1%呂氏堿性美藍(lán)染色液對標(biāo)本進(jìn)行浸染，染色時間為2 min。取出載玻片，用吸水紙吸取多余的染料，晾干。

（5）觀察。油鏡下觀察細(xì)菌數(shù)，共計數(shù)20個視野細(xì)菌數(shù)量，最終求細(xì)菌數(shù)量平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微直接計數(shù)方法檢測原料乳細(xì)菌總數(shù)的重復(fù)性

用顯微直接計數(shù)方法計對細(xì)菌總數(shù)不同的28個奶樣同時用兩種方法進(jìn)行多次檢測，分析用顯微直接計數(shù)方法檢測原料乳細(xì)菌總數(shù)的可靠性，結(jié)果如表1所示。

表1 顯微直接計數(shù)方法檢測原料乳細(xì)菌總數(shù)的重復(fù)性

通過對細(xì)菌總數(shù)不同的奶樣進(jìn)行顯微計數(shù)檢測結(jié)果（表1）可知，所有數(shù)據(jù)變異系數(shù)都小于2%，說明使用顯微計數(shù)方法重復(fù)性良好，計數(shù)平均值具有好的代表性。

2.2 兩種方法檢測牛乳細(xì)菌總數(shù)的比較

同時用顯微直接計數(shù)方法與GB4789.2-2010對鮮乳菌落總數(shù)計數(shù)兩種方法對細(xì)菌含量不同的28個鮮乳樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖1）表明，顯微直接計數(shù)方法與GB4789.2-2010對鮮乳菌落總數(shù)兩種方法間存在良好的線性關(guān)系，y=5625.2x+921.31，R2=0.9224。

2.3 顯微直接計數(shù)方法結(jié)果

以美蘭為染色劑的顯微直接計數(shù)方法所觀察到的樣品呈現(xiàn)藍(lán)色背景，其中脂肪球在顯微鏡下形成明亮的小滴，有強(qiáng)烈的折射光，由于光學(xué)現(xiàn)象所致，每個脂肪球表面如有層膜包覆。所有微生物包括細(xì)菌和酵母等形態(tài)微生物被染上較深的藍(lán)色，其在視野中以較清晰的形態(tài)存在，如圖2所示。

圖1 兩種檢測方法的線性關(guān)系

圖2 顯微直接計數(shù)方法圖片

3 結(jié)論

本研究所采用直接計數(shù)方法是以顯微鏡觀察為基礎(chǔ)，通過制片、染色和觀察等幾個簡單的步驟直接對樣品中細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行計數(shù)方法：

（1）從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，運(yùn)用顯微鏡直接計數(shù)方法檢測原料乳細(xì)菌總數(shù)與國標(biāo)方法具有良好的線性（R2=0.9224）。（2）顯微計數(shù)時視野的選擇需要選擇微生物分布均勻的視野，需要一個個計數(shù)，不管兩個相連或成堆成鏈，均需一個個計數(shù)，菌團(tuán)按一個計數(shù)；并在本研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)視野內(nèi)細(xì)菌數(shù)量過多時，計數(shù)的準(zhǔn)確性明顯降低。（3）該方法的優(yōu)點(diǎn)為能夠在20 min內(nèi)完成原料乳中的細(xì)菌總數(shù)的檢測，與GB4789.2-2010方法相比，可以改善由于傳統(tǒng)國標(biāo)方法培養(yǎng)48h出結(jié)果所造成的細(xì)菌總數(shù)過多而已經(jīng)投入使用的狀況。（4）與FOSS等細(xì)胞計數(shù)儀相比，該方法驗(yàn)收且成本低廉，是一種值得推廣的新型技術(shù)。

[1]郭本恒.乳品微生物學(xué)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2007，23-35.

[2]杜茂昌.利用顯微鏡直接計數(shù)快速檢驗(yàn)鮮乳細(xì)菌總數(shù)研究[J].食品科學(xué),1983(12):46-48.

[3]徐爾尼.細(xì)菌顯微直接計數(shù)法用于乳粉生產(chǎn)中半成品乳雜菌總數(shù)的快速檢驗(yàn)[J].食品工業(yè)科技,1996(3):81-82.

[4]THUSITHA S，PAUL V，DUNCAN A V,et al.A flow cytometry method for rapid detection and enumeration of total bacteria in milk [J].Applied and Environmental Micorbiology,2005,66(3):1228-1232.

[5]王寧，劉寧.細(xì)菌顯微直接計數(shù)法用于乳粉生產(chǎn)中半成品乳雜菌總數(shù)的快速檢驗(yàn)[J].食品工業(yè)科技,2007,28(9):197-200.

[6]許振偉.實(shí)時光電微生物法快速檢測生鮮乳中的嗜冷菌[J].現(xiàn)代食品科技，2012,28（12）1792-1795.

[7]COOMBS P,MARLATT F．Conductance microbiology in the dairy industry[M]．Food and Beverage Technology International USA, 1989:209-211.

[8]孔保華.乳品科學(xué)與技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社，2004：115-125.

[9]田麗萍,吳志良,孟慶紅，等.兩種原料乳細(xì)菌總數(shù)檢測方法的比較[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2011,147（2）77-78.

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方案對A1B3C2與A1B3C3進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)，A1B3C2得最終平均離心率為0.487%，A1B3C3得最終平均離心率為0.484%，兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常接近，且觀察21 d后，兩組產(chǎn)品沉淀非常少，析水約0.3 cm，從經(jīng)濟(jì)效益的角度考慮，選擇A1B3C2較為適宜。

3.6 感官評價結(jié)果

通過品嘗乳酸菌飲料的口感，從酸甜度、清爽度、外觀、整體喜好度挑選出最喜愛的樣品。由表2可以看出，9組樣品中1～6號樣品總體評價較高，7～9號樣品感官評價相對較低。且通過觀察，記錄臨界期21 d的析水情況，1號、2號、4號、7號、8號、9號實(shí)驗(yàn)方案析水較多，約0.8～1.0 cm，且沉淀多；其他幾組3號、5號、6號實(shí)驗(yàn)方案析水較少，約0.3～0.5 cm，沉淀少，這與正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也是相符的。

3.7 結(jié)論

綜上所述，使用純凈水配制，在pH值為3.6的條件下，以大豆多糖添加量0.25%、果膠添加量0.3%為復(fù)配穩(wěn)定劑，制作褐色活性乳酸菌飲料，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥1.0%，風(fēng)味好，酸甜適宜，且在保質(zhì)期21 d內(nèi)穩(wěn)定性良好，無明顯沉淀與水析出，是一款符合產(chǎn)品品質(zhì)要求的產(chǎn)品[8]。但由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，沒有對水質(zhì)電導(dǎo)率進(jìn)行深入研究，并且在后續(xù)還會對褐色飲料工藝進(jìn)行研究，進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)品。

參考文獻(xiàn)：

[1]潘麗紅,姚林宏,吳菊清,等.簡述美拉德(Maillard)反應(yīng)[J].中國調(diào)味品,2008,33(4):25-27.

[2]董濤,張國松,周玉玲.養(yǎng)樂多風(fēng)味乳酸菌飲料生產(chǎn)工藝的探討[J].中國乳品工業(yè),2005,33(4):40-41.

[3]蒲金平.可溶性大豆多糖和大豆膳食纖維在乳制品中的應(yīng)用研究[D].華東師范大學(xué),2014.

[4]楊曉泉,齊軍茹,司華靜,等.大豆多糖的研究進(jìn)展及在含乳飲料、米面等食品上的應(yīng)用[J].中國食品添加劑,2008(3):135-139.

[5]曾令平,常忠義,高紅亮.水溶性大豆多糖和果膠作為酸性乳飲料穩(wěn)定劑的研究[J].中國乳品工業(yè),2008,36(11):25-28.

[6]盛林霞,盧蓉蓉.高酯果膠和水溶性大豆多糖及其復(fù)配對酸性脫脂乳飲料穩(wěn)定性的影響[J].2015.

[7]劉麗,蔡云升.調(diào)配型酸乳飲料穩(wěn)定劑及其穩(wěn)定性的研究[J].食品工業(yè)科技,2003,24(5):63-65.

[8]GB/T 21732-2008含乳飲料[S].

[10]SHAMA G,MALIK D J.The uses and abuses of rapid bioluminescence-based ATP assays[J].International Journal of Hygiene and En?vironmental Health,2013,216(2):115-125.

Direct microscopy of raw milk bacteria count methodology

ZHU Yuhua，PAN Bo，MAO Yong，WU Ping
(The quality monitoring department，Wahaha Group Co.Ltd.，Hangzhou 310018，China)

The number of bacteria in raw milk by the total number of bacteria microscope counting method and GB 4789.2-2010 total na?tional food safety standards of food microbiology testing colonies determination were compared，found that there are good correlation be?tween direct microscope bacterial count method and GB478.2 method.The experiment found that the microscopic counting method has the characteristics of short detection time，low detection cost，can be used as an auxiliary method for inspection of raw milk.

raw milk;microscope counting;bacteria;rapid method

Q93-332

A

1001-2230（2017）05-0051-02

2016-06-01

朱毓華(1980-)，女，工程師，從事食品微生物質(zhì)量檢測工作方向。