劉曉慶，劉師文，肖芳，施勇，李健雄，熊英

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

2013年至2015年江西省脊髓灰質(zhì)炎實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞敏感性監(jiān)測(cè)分析

劉曉慶，劉師文，肖芳，施勇，李健雄，熊英

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

目的評(píng)價(jià)江西省疾病預(yù)防控制中心脊髓灰質(zhì)炎（脊灰）實(shí)驗(yàn)室2013年至2015年所用細(xì)胞系對(duì)脊灰病毒的敏感性，為維持無(wú)脊灰工作提供可靠的質(zhì)量保證。方法選擇江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室2015年制備的Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型質(zhì)量控制株，以及國(guó)家脊灰實(shí)驗(yàn)室提供的合格的無(wú)支原體污染的RD和L20B細(xì)胞系，采用96孔微量培養(yǎng)板滴定法測(cè)定2013年至2015年江西省江西省疾病預(yù)防控制中心脊髓灰質(zhì)炎（脊灰）實(shí)驗(yàn)室所用細(xì)胞系對(duì)脊灰病毒的敏感性。結(jié)果江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室2013～2015年細(xì)胞敏感性試驗(yàn)結(jié)果：人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（RD)細(xì)胞均值及標(biāo)準(zhǔn)差為：Ⅰ型7.32±0.23，Ⅱ型6.97±0.20，Ⅲ型6. 88±0.23；轉(zhuǎn)人脊灰病毒受體的小鼠肺細(xì)胞系（L20B）細(xì)胞均值及標(biāo)準(zhǔn)差為：Ⅰ型7.03±0.19，Ⅱ型6.93±0.14，Ⅲ型6.62±0.18，與江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)株（Laboratory quality control standard，LQC）的參考值相比其滴度均波動(dòng)在±0.5 log10CCID50/0.1ml以?xún)?nèi)。結(jié)論2013年至2015年江西省江西省疾病預(yù)防控制中心脊髓灰質(zhì)炎（脊灰）實(shí)驗(yàn)室所用細(xì)胞系對(duì)脊灰病毒的敏感性良好。

脊髓灰質(zhì)炎病毒；細(xì)胞系敏感性實(shí)驗(yàn)；質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)株

按照世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）要求，全球脊髓灰質(zhì)炎（脊灰）網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)開(kāi)展細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)，以保持病毒分離過(guò)程中的高度敏感性，維持網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的高質(zhì)量運(yùn)轉(zhuǎn)。江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室也建立了細(xì)胞系敏感性實(shí)驗(yàn)方法并制備江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制株（Laboratory quality control standard，LQC），對(duì)實(shí)驗(yàn)室所用的人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（Human Rhabdomyo-sarcoma， RD），和轉(zhuǎn)人脊灰病毒受體的小鼠肺細(xì)胞系（Mouse Cell Line Expressing the Gene for the Human Cellular Receptor for Poliovirus，L20B）細(xì)胞敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)?，F(xiàn)將2013年至2015年細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析如下。

1 材料與方法

1.1 毒株的選擇2005年制備的江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制株，每管0.1ml，-70℃冰箱保存。

1.2 細(xì)胞無(wú)支原體污染的合格RD，L20B細(xì)胞系，從國(guó)家脊灰實(shí)驗(yàn)室獲得。

1.3 細(xì)胞系敏感性實(shí)驗(yàn)用96孔微量培養(yǎng)板滴定法[1]。

1.4 病毒滴度的計(jì)算通過(guò)Karber公式計(jì)算病毒滴度：logCCID50=L-d(S-0.5)，其中：L=實(shí)驗(yàn)中使用的最低稀釋度的log值：d=稀釋過(guò)程中2個(gè)稀釋度之間的差（稀釋梯度）的log值；S=終判斷時(shí)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性部分總和（即出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔所占的比例之和）

1.5 江西省LQC滴度值SabinⅠ：在RD細(xì)胞上為7.16log10CCID50/0.1ml，在L20B細(xì)胞上為6.81 log10CCID50/0.1ml。SabinⅡ：在RD細(xì)胞上為6.91log10CCID50/0.1ml，在L20B細(xì)胞上為6.78 log10CCID50/0.1ml。SabinⅢ：在RD細(xì)胞上為6.83log10CCID50/0.1ml，在L20B細(xì)胞上為6.68 log10CCID50/0.1ml。評(píng)價(jià)細(xì)胞敏感性時(shí)，用LQC做質(zhì)量控制株，細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)的滴度需與其質(zhì)量控制株滴度相比較，其滴度波動(dòng)在±0.5 log10CCID50/0.1ml以?xún)?nèi)，才可以確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室2005年建立細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)方法，2005年開(kāi)始按照國(guó)家實(shí)驗(yàn)室要求，對(duì)實(shí)驗(yàn)室所用RD和L20B細(xì)胞開(kāi)展敏感性常規(guī)監(jiān)測(cè)，以檢驗(yàn)細(xì)胞對(duì)脊灰病毒的敏感程度以及變化曲線。其結(jié)果見(jiàn)表1、表2，RD和L20B細(xì)胞各型別細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)曲線見(jiàn)圖1、圖2。各型別脊灰病毒均值和標(biāo)準(zhǔn)差見(jiàn)表3。

3 討論

中國(guó)脊髓灰質(zhì)炎（脊灰）監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)建立以來(lái)，在新疆維吾爾自治區(qū)、云南省、青海省有一些脊灰野病毒爆發(fā)的報(bào)告[2～5]，2000年10月，中國(guó)所在的世界衛(wèi)生組織（WHO）西太平洋區(qū)已被證實(shí)為無(wú)脊灰區(qū)[6]，表明我國(guó)已經(jīng)成功阻斷了本土脊灰野病毒的循環(huán)。但是，這僅是消滅脊灰的一個(gè)階段性成果。中國(guó)維持無(wú)脊灰狀態(tài)仍然面臨著許多挑戰(zhàn)，目前與我國(guó)接壤的一些國(guó)家仍有脊灰野病毒流行，我國(guó)依然存在野病毒輸入的危險(xiǎn)性；2011年我國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)發(fā)生輸入性WPV并引起局部傳播[7，8]。另外，在我國(guó)，使用口服OPV是消滅脊灰的重要策略之一，疫苗衍生脊灰病毒（VDPV）的出現(xiàn)也提示我們對(duì)于維持無(wú)脊灰工作仍然不能掉以輕心[9]。

由于全球消滅脊灰日期的推近，消滅脊灰的形勢(shì)越來(lái)越嚴(yán)峻，假陰性的病毒分離結(jié)果可能會(huì)導(dǎo)致非常嚴(yán)重的后果。所以在病毒監(jiān)測(cè)過(guò)程中，保持網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室脊灰病毒學(xué)監(jiān)測(cè)的高質(zhì)量，使用高敏感的細(xì)胞系是分離脊髓灰質(zhì)炎病毒的第一步，對(duì)于進(jìn)一步鑒定病毒是野病毒還是VDPVs是必不可少的。RD細(xì)胞（即人橫紋肌肉瘤細(xì)胞）和L20B細(xì)胞（即轉(zhuǎn)人脊灰病毒受體的小鼠肺細(xì)胞系）來(lái)源于世界衛(wèi)生組織（WHO）由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心脊髓灰質(zhì)炎實(shí)驗(yàn)室分發(fā)，省疾病預(yù)防控制中心脊髓灰質(zhì)炎實(shí)驗(yàn)室建立細(xì)胞庫(kù)[10]。根據(jù)WHO脊灰實(shí)驗(yàn)手冊(cè)指導(dǎo)，RD細(xì)胞和L20B細(xì)胞應(yīng)用于脊灰細(xì)胞敏感性的評(píng)價(jià)?，F(xiàn)因此，脊灰實(shí)驗(yàn)室對(duì)用于病毒分離的RD和L20B細(xì)胞系的敏感性進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測(cè)，這是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證體系中的重要組成部分[11]。為此，江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室制備了具有已知滴度的并且滴度穩(wěn)定受到國(guó)家脊灰實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的參考病毒，具體方法參考WHO《脊灰實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[12]，定期進(jìn)行細(xì)胞敏感性的評(píng)價(jià)。

表1 江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室RD細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室L20B細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室2種細(xì)胞病毒滴度的均值（x±s）

圖1 江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室RD細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)曲線圖

圖2 江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室L20B細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)曲線圖

對(duì)細(xì)胞敏感性結(jié)果造成影響的因素有很多，如培養(yǎng)液的質(zhì)量（如同牛血清、水、pH值）、生產(chǎn)條件（如孵育溫度）、支原體污染等，所以需要及時(shí)監(jiān)控和保持記錄這些培養(yǎng)條件。當(dāng)有因素發(fā)生變化時(shí)，就需要對(duì)用于脊灰病毒檢測(cè)的細(xì)胞的敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)；同時(shí)在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行凍存細(xì)胞、復(fù)蘇細(xì)胞和收到新的細(xì)胞系時(shí)，都要進(jìn)行敏感性的評(píng)價(jià)[13]。

江西省按照國(guó)家脊灰實(shí)驗(yàn)室的要求，自2005年8月以來(lái)，制備實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)株后，至今一直使用該標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每次復(fù)蘇的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞敏感性測(cè)試，嚴(yán)格遵守至少每3個(gè)月測(cè)試一次，在結(jié)果出來(lái)48h內(nèi)及時(shí)向國(guó)家脊灰實(shí)驗(yàn)室上報(bào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，2013年至2015年共20次的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果期滴度波動(dòng)幅度均在±0.5log10CCID50/0.1ml以?xún)?nèi)，均為有效的結(jié)果。在進(jìn)行細(xì)胞敏感性測(cè)試的同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以確保得到準(zhǔn)確的敏感性結(jié)果，監(jiān)測(cè)結(jié)果做到了及時(shí)、有效、準(zhǔn)確。

保持無(wú)脊灰狀態(tài)的任務(wù)是一個(gè)既長(zhǎng)久又艱巨的任務(wù)，我國(guó)周邊國(guó)家野病毒的死灰復(fù)燃以及疫苗變異株的流行，對(duì)我們能否保持無(wú)脊灰狀態(tài)產(chǎn)生巨大威脅[14，15]。所以我們要保證高質(zhì)量的監(jiān)測(cè)水平，本研究表明，江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室RD和L20B細(xì)胞敏感性監(jiān)測(cè)結(jié)果，與質(zhì)量控制株LQC的滴度值相比起滴度均波動(dòng)在±0.5log10CCID50/0.1ml以?xún)?nèi)，顯示江西省脊灰實(shí)驗(yàn)室所使用的細(xì)胞對(duì)脊灰病毒保持正常的敏感性，細(xì)胞敏感性的常規(guī)監(jiān)測(cè)運(yùn)轉(zhuǎn)正常，為江西省維持無(wú)脊灰狀態(tài)提供了可靠的質(zhì)量保證。

[1]WHO.WHO poliovirus laboratory manual[M].4th edition.Geneva：WHO，2004：73-80.

[2]侯曉輝，鄭紅，方勇，等.中國(guó)新疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎Ⅲ型野毒株[J].疾病監(jiān)測(cè)，1995，10（8）：229-233.

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Cell sensitivity test in Polio laboratory in Jiangxi from 2013 to 2015

LIU Xiaoqing，LIU Shiwen，XIAO Fang，SHI Yong，LI Jianxiong，XIONG Ying.
Jiangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330029，China.

Objective To evaluate the sensitivity of cell lines to poliovirus used in Jiangxi Provincial Polio Laboratory(JXPPL) and provide the laboratory data for maintaining polio-free status in Jiangxi Province from 2013 to 2015.Methods The LQC of SabinⅠ，Ⅱ，Ⅲcome from Polio laboratory in 2015 in Jiangxi province，as well as the qualified and no mycoplasma pollution RD and L20B cell lines which are provided by the National Polio Laboratory are used.Then the 96-holed Microtest Plate Culture method was applied to detect the sensitivity of Poliovirus used in the lab of Jiangxi Center for Disease Center and Prevention within 2013-2015.Results The mean value and standard deviation of human rhabdomyosarcoma cell line RD was 7.32±0.23 for typeⅠ，6.97±0.20 for typeⅡ，and 6.88±00.23 for typeⅢ；The mean value and standard deviation of the poliovirus-transferred lung cell from mice was 7.03±0.19 for typeⅠ，6.93±0.14 for typeⅡ，and 6.62±0.18 for typeⅢ，Compared with the Laboratory quality control standard，the fluctuation of the titre was within±0.5 log10CCID50/0.1ml in cellular sensitivity test.Conclusion The sensitivity of the cell line to poliovirus used in JXPPL through 2013～2015 was fine.

∶Poliovirus；cell-line sensitivity test；LQC

R512.4

A

1674-1129(2017)03-0308-04

2016-08-22；

2017-03-23)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.005

江西省衛(wèi)生計(jì)生委資助課題，編號(hào)：20166018

劉曉慶，1986年生，女，碩士，研究方向：檢驗(yàn)技師，脊灰病病毒的研究，電話：18079125862，E-mail：liuxiaoqing035@163.com