謝銘芳 唐蒙蒙 丁偉

●基礎研究

miR-630在肺腺癌組織中的表達及其對肺腺癌細胞遷移侵襲的影響

謝銘芳 唐蒙蒙 丁偉

目的 研究miR-630在人肺癌組織中的表達，探討miR-630對肺腺癌細胞系（A549）細胞遷移侵襲的影響及其機制。方法 收集37例肺腺癌組織標本及癌旁正常肺組織，通過RT-PCR檢測各標本中miR-630、SOX4 mRNA的表達情況，Pearson相關分析檢驗miR-630與SOX4的相關性；通過轉(zhuǎn)染miR-630mimic和miR-630NC至離體培養(yǎng)的A549細胞中，Western blot檢測A549細胞中COL1A1、COL1A5、SOX4的表達情況，劃痕試驗和Transwell法觀察細胞遷移侵襲情況，熒光素酶素試驗驗證SOX4是miR-630的靶基因。結(jié)果 與癌旁正常肺組織比較，miR-630在肺腺癌組織中的表達降低（P＜0.05）；肺腺癌組織中SOX4 mRNA的表達增加（P＜0.01）；miR-630與SOX4 mRNA的表達量呈負相關（r=-0.344，P＜0.01）。與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-630mimic后A549細胞的遷移侵襲減少（P＜0.01），細胞中COL1A1、COL1A5、SOX4的表達減少（均P＜0.05）；熒光素酶試驗結(jié)果顯示，miR-630能夠降低SOX4-3′-UTR質(zhì)粒的熒光素活性（P＜0.05）。結(jié)論 miR-630在肺腺癌組織中低表達；miR-630可能是通過下調(diào)SOX4抑制A549細胞的遷移和侵襲。

肺腺癌 微小RNA-630 SOX4 侵襲

microRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，可調(diào)控多種腫瘤細胞的遷移和侵襲[1]。在肺癌細胞研究中，目前熱門的miRNAs包括miR-630、miR-32、miR-21、miR-34、miR-138、miR-206，但是目前人肺癌組織中這些miRNAs的表達情況鮮有研究報道。SOX4基因（SRY related high-mobile group box4）屬于SOX基因家族中C亞族，其編碼的蛋白通過HMG盒（high－mobility group DNAbinding domain）與DNA結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活化或抑制。已經(jīng)有大量的研究發(fā)現(xiàn)SOX4參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，具有抑癌基因和癌基因雙向調(diào)節(jié)功能[2]。抑制SOX4的表達可以抑制肺癌細胞、乳腺癌細胞、食管癌細胞、宮頸癌細胞等多種腫瘤細胞的遷移和侵襲[3－6]。筆者在預實驗中通過實時熒光定量PCR檢測15例患者肺腺癌組織、正常肺組織中miR－630、miR－32、miR－21、miR－34、miR－138、miR－206的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR－630和miR－32在肺腺癌組織中表達減少。本研究擬通過擴大樣本量，驗證miR－630在肺癌組織中的表達情況，及其與SOX4表達量之間的相關性關系，并通過細胞實驗進一步探索miR－630對肺腺癌細胞遷移侵襲的影響以及SOX4的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2015年4至9月37例肺腺癌患者手術切取的肺腺癌組織及癌旁正常肺組織（紹興市柯橋區(qū)中醫(yī)醫(yī)院4例，浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院胸外科33例），男16例，女21例，年齡41～74（63.7±6.9）歲；所有患者術前均未行任何放、化療。肺腺癌診斷經(jīng)病理診斷確認，TNM分期Ⅰ期患者2例，Ⅱ期患者19例，Ⅲ期患者12例，Ⅳ期患者4例。

1.2 方法

1.2.1 試劑 肺腺癌細胞株A549購于上海拜力生物公司；胎牛血清（美國GIBCO公司）；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶（美國Sigma公司）；RNA提取試劑（美國Invitrogen公司）；兔或鼠抗人COL1A1、COL1A5、SOX4、βactin多克隆抗體（美國ABCAM公司）；辣根過氧化酶標記的二抗（美國Jackson公司）；脂質(zhì)體2000（中國上海英駿公司）；Western blot相關試劑（中國江蘇碧云天生物技術研究所）。

1.2.2 實驗分組 手術取下的組織根據(jù)病理結(jié)果分為肺腺癌組、癌旁正常肺組織組；細胞實驗中，在miR－630mimic轉(zhuǎn)染A549細胞后，將細胞分為對照組和miR－630 mimic組。

1.2.3 熒光定量RT－PCR檢測miR－630和SOX4 mRNA的表達 提取組織或細胞中總RNA，將提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應體系為20μl，反應條件為：37℃反轉(zhuǎn)錄15min，85℃反轉(zhuǎn)錄酶失活5s，4℃保存。運用SYBR Green法檢測miR－630、SOX4 mRNA的表達情況，運用的反應條件為：94℃預變性15min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共循環(huán)40次；最后72℃延伸8 min。每組樣品重復3次，試驗重復3次，統(tǒng)計分析各標本中miR－630和SOX4 mRNA的表達。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達量 提取細胞中總蛋白，BCA法定量蛋白，SDS－PAGE膠每孔加入30μl的樣品，70V 30min進行蛋白濃縮，100V 2h進行蛋白電泳，并用孔徑0.45μm的PVDF膜250mA 90min進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后常溫下TBST洗膜3次、封閉1h后，以1∶1 000濃度加入兔（鼠）抗人COL1A1一抗（或抗COL1A5、SOX4、β－actin一抗），4℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標記羊抗兔（鼠）二抗（1∶5 000）孵育后ECL化學發(fā)光法檢測?？逻_膠片暗室顯影，Quantity one軟件分析。

1.2.5 轉(zhuǎn)染細胞株 過表達質(zhì)粒的構建：miR－630mimic由上海吉瑪公司設計合成，miR－630mimic序列為：正義鏈：5′－AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU－3′，反義鏈：3′－ACCUUCCCUGGUACAGAAUACU－5′。轉(zhuǎn)染：將A549細胞系接種至6孔板，生長至50%～70%密度時，以脂質(zhì)體2 000轉(zhuǎn)染miR－630mimic或miR－630NC，各100pmol 24h后，提取總RNA/蛋白后，PCR/Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率，進行后續(xù)試驗。

1.2.6 細胞劃痕實驗（Wound Healing）測定A549細胞遷移 A549細胞先用1.8mmol/L羥基脲作用12h抑制細胞增殖，100μl槍頭垂直孔板制造細胞劃痕，棄細胞培養(yǎng)液，PBS沖洗孔板3次。拍照記錄0、24h后劃痕圖片，用image pro plus6.0軟件分析計算細胞遷移面積。

1.2.7 Transwell法測定細胞侵襲 A549細胞先用血清饑餓使細胞同步化，1.8mmol/L羥基脲作用12h用抑制細胞增殖，用0.25%胰蛋白酶消化A549細胞后，用DMEM培養(yǎng)基（1%血清）配成細胞懸液并計數(shù)（5×104個/ml）。各組24孔板配套Transwell小室（0.8μm）上室加入200μl的細胞懸液，下室加入含有10%FBS的培養(yǎng)液500μl，分別培養(yǎng)24h。以棉簽擦去上層未穿透膜的A549細胞，取下Transwell半透膜，PBS洗3次，用3.7%多聚甲醛室溫固定5min，再用PBS洗3次，用1mg/ml的結(jié)晶紫染色，PBS洗3次，倒置顯微鏡每組隨機取5個視野觀察計數(shù)并記錄穿膜細胞數(shù)。

1.2.8 熒光素酶試驗 設計合成SOX4－3′－UTR的序列及突變序列，以SOX4質(zhì)粒為載體，分別構建能夠表達熒光素酶的包含SOX4－3′－UTR和SOX4－3′－UTR突變序列的質(zhì)粒，然后將A549細胞系按每孔1×105接種至24孔板，24h后以脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染200ng包含SOX4－3′－UTR或SOX4－3′－UTR突變序列的熒光素酶質(zhì)粒和 80ng海腎熒光質(zhì)粒以及 60pmol miR－630－mimic或?qū)φ眨?8h后用熒光檢測儀測熒光強度，海腎熒光作為內(nèi)參照，每組試驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較用t檢驗；SOX4 mRNA表達量與miR-630表達量間相關性分采用Pearson相關分析。

2 結(jié)果

2.1 癌旁正常肺組織、肺腺癌組織中miR-630和SOX4 mRNA的表達 檢測發(fā)現(xiàn)miR-630在肺癌組織中表達減少，SOX4 mRNA在肺癌組織中表達升高，與癌旁正常肺組織比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；相關性分析結(jié)果顯示SOX4 mRNA的表達量與miR-630的表達量之間呈負相關（r=-0.3928，P＜0.01），見圖1。

2.2 miR-630對A549細胞侵襲遷移的影響 miR-630mimic轉(zhuǎn)染A549細胞后，miR-630組中A549的遷移均較對照組減少（均P＜0.01），見圖2a-b（插頁）。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，miR-630組 A549細胞中COL1A1和COL1A5與細胞遷移密切相關的蛋白表達均較對照組減少（均P＜0.01），見圖2c（插頁）。

圖1 癌旁正常肺組織、肺腺癌組織中miR-630和SOX4 mRNA表達情況（a：miR-630在癌旁正常肺組織、肺腺癌組織中的表達情況；b：SOX4 mRNA在肺組織、肺腺癌組織中的表達情況；c：miR-630與SOX4 mRNA的相關性；與癌旁正常肺組織比較，*P＜0.01）

2.3 miR-630通過識別3′-UTR抑制SOX4的表達Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-630 mimic組A549細胞中SOX4的表達較對照組明顯降低（P＜0.01），見圖3。分別構建包含SOX4-3′-UTR和其突變序列的熒光素酶質(zhì)粒，見圖4a。與miR-630mimic或者miR-630NC共轉(zhuǎn)A549細胞，培養(yǎng)24h后，檢測各組細胞中熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示，miR-630mimic+WT-SOX4-3′-UTR組熒光素酶活性低于miR-630NC+WT-SOX4-3′-UTR組（P＜0.01），見圖4b。

圖3 miR-630抑制SOX4的表達（與對照組比較，*P＜0.01）

圖4 miR-630通過識別3′-UTR抑制SOX4的表達（a：miR-630與SOX4-3′UTR靶向結(jié)合示意圖；b：各組熒光素酶活性，與對照組比較，*P＜0.01）

3 討論

轉(zhuǎn)移和侵襲是腫瘤基本的生物學特征，不僅跟腫瘤細胞的黏附能力下降、侵襲性增強有關，還與腫瘤組織中血管生成、細胞外基質(zhì)（ECM）的降解及間質(zhì)重構等過程密切相關[7]。因此，抑制肺腺癌細胞侵襲和遷移對臨床治療肺腺癌有重要意義[8]。

miRNAs是一類高度保守的小分子非編碼單鏈RNA，大量的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNAs參與調(diào)控腫瘤細胞的遷移和侵襲[9]。本研究檢測了癌旁正常肺組織以及肺腺癌組織中miR-630的表達，發(fā)現(xiàn)miR-630在肺腺癌組織中的表達減少。miR-630是一種抑癌miRNAs，參與調(diào)節(jié)多種與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關蛋白的表達，可調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[10-13]。據(jù)此結(jié)果，筆者選擇進一步研究miR-630對肺腺癌細胞遷移和侵襲的影響。在離體實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)miR-630mimic抑制A549細胞的遷移和侵襲，同時還可以下調(diào)COL1A1和COL1A5這兩個與腫瘤遷移侵襲密切相關的蛋白的表達。

SOX4基因?qū)儆赟OX C亞族，主要在胚胎發(fā)育過程中的心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胸腺高表達。此外，SOX4還在一些干細胞和祖細胞中高表達，對干細胞的穩(wěn)定和分化具有重要的調(diào)控作用。因此，SOX4基因突變、缺失或者過表達不僅僅會引起先天性疾病，還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。已有研究結(jié)果顯示，SOX4基因在多種腫瘤組織中表達升高[2]。Shen等[14]和Wang等[15]研究還發(fā)現(xiàn)SOX4基因的表達與多種腫瘤患者預后相關，并預測SOX4可以作為腫瘤治理的一個靶向位點。此外，近期的研究發(fā)現(xiàn)miR-211通過靶向抑制SOX4的表達從而抑制SGC-7901細胞的侵襲。與上述研究結(jié)果相符，本研究顯示，相比于肺癌旁組織，SOX4在肺腺癌組織中表達升高，并且與miR-630的表達量呈負相關。這些結(jié)果提示在肺腺癌中，miR-630可能也可以通過下調(diào)SOX4發(fā)揮抑制細胞遷移侵襲的作用。在之后的離體實驗中，本研究組進一步發(fā)現(xiàn)在用miR-630mimic干預A549細胞后，細胞中SOX4的表達減少。熒光素酶實驗顯示miR-630可以與SOX4的3′-UTR靶向結(jié)合。在預先用SOX4過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 A549細胞，發(fā)現(xiàn)過表達 SOX4可以增加COL1A1和COL1A5的表達，逆轉(zhuǎn)miR-630對A549細胞遷移侵襲的抑制作用。以上結(jié)果提示miR-630是通過下調(diào)SOX4的表達，從而發(fā)揮抑制A549細胞遷移侵襲的作用。

本實驗通過實時熒光定量PCR檢測正常肺組織和肺腺癌組織中miR-630和SOX4 mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-630在肺腺癌組織中表達減少、SOX4在肺腺癌組織中表達增加，兩者之間呈負相關。之后在離體實驗中證實miR-630可以抑制A549細胞的侵襲遷移，并進一步通過熒光素酶試驗證實miR-630結(jié)合SOX4-3′-UTR的序列，為肺腺癌的治療提供新的思路。

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Expression of miR-630 in lung adenocarcinoma and its effect on tumor migration and invasion

XIE Mingfang，TANG Mengmeng, DING Wei,et al.Department of Clinical Laboratory,Shaoxing Keqiao Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shaoxing 312030, China

Lung adenocarcinoma miR-630 Sex determining region Y-box 4 Invasion

2016-12-01）

（本文編輯：嚴瑋雯）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.12.2016-2015

浙江省自然科學基金項目（LY14H0200002）

312030 紹興市柯橋區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗科（謝銘芳）；浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院病理科（唐蒙蒙、丁偉）

丁偉，E-mail:dingweihz1977@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of miR-630 in lung adenocarcinoma and its effect on tumor invasion and metastasis. Methods The expressions of miR-630 and SOX4 mRNA were detected by RT-PCR in 37 samples of lung adenocarcinoma tissue and matched normal lung tissue.Pearson correlation analysis was performed to test the correlation of miR-630 with SOX4 mRNA.Human lung adenocarcinoma A549 cells were transfected with miR-630.The migratory ability of A549 cells was tested by wound healing and Transwell assays;the expressions of COL1A1,COL1A5 and SOX4 in A549 cells were detected by Western blotting;Luciferase assay was used to confirmed whether SOX4-3'-UTR was the target gene of miR-630. Results Compared with normal lung tissue,the expression of miR-630 was decreased and SOX4 mRNA was significantly increased in lung adenocarcinoma (P＜0.05,P＜0.01).Pearson correlation analysis showed that miR-630 was negatively correlated with SOX4 mRNA (r=-0.344,P＜0.01).In vitro experiment,compared with the wild A549 cells,the expressions of COL1A1,COL1A5 and SOX4 were decreased in the miR-630-transfected A549 cells(P＜0.01).The migration activity of A549 cells was decreased after transfected with miR-630(P＜0.01).The Luciferase activity of the SOX4-3′-UTR plasmid was significantly suppressed by miR-630(P＜0.00). Conclusion The expression of miR-630 is down-regulated in lung adenocarcinoma;miR-630 inhibits migration and invasion ofA594 cells,indicating that SOX4-3′-UTR may be its targeting gene.