王慶濤，王玉璟

(長江大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 荊州 434020)

不同給藥方式建立阿霉素心肌病模型的評價(jià)

王慶濤，王玉璟

(長江大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 荊州 434020)

目的：評價(jià)3種腹腔注射阿霉素建立SD大鼠擴(kuò)張型心肌病模型的方案。 方法：雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，模型組A(阿霉素0.8mg/次×2次/w×8w)、B(阿霉素2.5mg/次×1次/w×6w)、C(阿霉素2mg/次×1次/w×8w)(以下簡稱模A、模B、模C)腹腔注射不同濃度的阿霉素，對照組給予生理鹽水，對大鼠心肌組織的病理改變、血清中腦鈉肽(BNP)結(jié)果進(jìn)行評估。結(jié)果：與對照組相比，模A全心質(zhì)量指數(shù)增大(P<0.05)；與對照組相比，模B、模C全心質(zhì)量指數(shù)降低(P<0.05)；與模A相比，模B、C全心質(zhì)量指數(shù)降低(P<0.05)；模B、C之間全心質(zhì)量指數(shù)無明顯差異(P>0.05)。與對照組相比，模A血清BNP水平增高(P>0.05)；與對照組相比，模B、C血清BNP水平增高(P<0.05)；與模A相比，模B、C血清BNP水平增高(P<0.05)；模B、C之間血清BNP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對照組相比，模A、B、C膠原容積分?jǐn)?shù)增高(P<0.05)；與模A相比，模B、C膠原容積分?jǐn)?shù)增高(P<0.05)；模B、C之間膠原容積分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：多次間斷腹腔注射一定劑量的阿霉素能建立擴(kuò)張型心肌病模型，但需要達(dá)到阿霉素累積劑量。

阿霉素；擴(kuò)張型心肌??；建模

擴(kuò)張型心肌病(Dilation Cardiomyopathy，DCM)在原發(fā)性心肌病中發(fā)病率很高[1]，主要表現(xiàn)為心室擴(kuò)張，收縮或舒張功能下降，最終發(fā)展為嚴(yán)重的心力衰竭，死亡率極高，確切的病因尚不清楚。阿霉素(adriamycin，ADR) 是一種蒽醌類廣譜高效抗腫瘤藥物，臨床上應(yīng)用廣泛，但阿霉素的長期使用具有不可逆的心臟毒性[2]，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)藥源性擴(kuò)張型心肌病，限制其應(yīng)用。一般認(rèn)為，相對于其他細(xì)胞，蒽環(huán)類藥物具有親心肌特性，更易在心肌細(xì)胞停留，而心臟組織缺少過氧化氫酶，抗氧化活性較弱[3]。另外，心肌細(xì)胞富含線粒體，也是產(chǎn)生ROS的根源；同時(shí)蒽環(huán)類藥物對于心磷脂的親和力較高，可進(jìn)入線粒體，結(jié)合心磷脂從而抑制呼吸鏈，造成心臟損傷[4]。本研究旨在利用阿霉素誘導(dǎo)大鼠擴(kuò)張型心肌病纖維化來探討建立阿霉素?cái)U(kuò)張型心肌病模型的適宜劑量，為藥源性擴(kuò)張型心肌病動(dòng)物研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1)試驗(yàn)藥物 阿霉素(鹽酸多柔比星)，由深圳萬樂藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號為1505E1。

2)動(dòng)物 清潔級SD大鼠66只，體重(180.3±5.3)g，雄性，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號:NO.42010200000361。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

3)試劑 100%乙醚、10%中性甲醛以及相關(guān)耗材均由長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室和長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；蘇木素(生產(chǎn)批號585065)、0.5%水溶型伊紅液(生產(chǎn)批號580378)、Masson染色液(生產(chǎn)批號615091)均由(臺(tái)資)珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。大鼠血漿腦鈉素(brain natriuretic peptide,BNP)Elisa試劑盒(上海軒昊科技發(fā)展有限公司)。嚴(yán)格按試劑盒說明書由專人進(jìn)行操作。

1.2 方法

1)DCM動(dòng)物模型的建立 清潔級SD大鼠66只，隨機(jī)分為模型組A(阿霉素0.8mg/次×2次/w×8w)16只，模型組B(阿霉素2.5mg/次×1次/w×6w)16只，模型組C(阿霉素2mg/次×1次/w×8w)16只，及對照組(生理鹽水2.5mg/次×1次/w×6w)18只。各組間體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2)指標(biāo)測定 在給藥結(jié)束后2周將大鼠稱重，用100%乙醚行吸入麻醉，取血清，Elisa檢測血清中BNP；分離心臟，稱重，計(jì)算全心質(zhì)量指數(shù)(心臟質(zhì)量/體重)；沿心臟從心底至心尖最大切面取中段放入10 %甲醛固定，用石蠟包埋、組織切片后行HE、Masson染色。所有切片均通過顯微攝像系統(tǒng)放大采圖，然后輸入MICRO-COSMOSMiVnt法醫(yī)病理圖像分析系統(tǒng)，以測量分析目標(biāo)面積(膠原面積)和視場面積(全視野面積)，然后計(jì)算出膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF) =(膠原面積/全視野面積)×100%。所有計(jì)量數(shù)據(jù)結(jié)果均輸入SPSS20.0計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生存情況

給藥結(jié)束后，對照組與模型組A生存率均為100%，模型組B組大鼠在第1、5、8周各死亡1只,生存率為 81.3%，模型組C組大鼠在第4、7周各死亡1只, 生存率為87.5%。

2.2 各組大鼠全心質(zhì)量指數(shù)、BNP、膠原容積分?jǐn)?shù)比較

與對照組相比，模A全心質(zhì)量指數(shù)增大(P<0.05)；與對照組相比，模B、模C全心質(zhì)量指數(shù)降低(P<0.05)；與模A相比，模B、C全心質(zhì)量指數(shù)降低(P<0.05)；模B、C之間全心質(zhì)量指數(shù)無明顯差異(P>0.05)。與對照組相比，模A血清 BNP水平增高(P>0.05)；與對照組相比，模B、C血清BNP水平增高(P<0.05)；與模A相比，模B、C血清BNP水平增高(P<0.05)；模B、C之間血清BNP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對照組相比，模A、B、C膠原容積分?jǐn)?shù)增高(P<0.05)；與模A相比，模B、C膠原容積分?jǐn)?shù)增高(P<0.05)；模B、C之間膠原容積分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠全心質(zhì)量指數(shù)、BNP、膠原容積分?jǐn)?shù)比較

注：與對照組相比,#P<0.05;與模型組A比較,*P<0.05。

2.3 HE染色

對照組心肌細(xì)胞排列整齊，無心肌細(xì)胞壞死及纖維化；模型組A出現(xiàn)散在心肌細(xì)胞排列紊亂，局限性壞死及纖維化；模型組B、C出現(xiàn)彌漫性心肌細(xì)胞壞死及纖維化。見圖1。

2.4 Masson染色

對照組無明顯纖維化；模型組A出現(xiàn)局灶性纖維化增生；模型組B及模型組C出現(xiàn)彌漫性纖維化。見圖2。

3 討論

擴(kuò)張型心肌病是一種嚴(yán)重威脅著人類健康的常見心肌疾病，發(fā)病率較高，至今病因尚未完全清楚，但認(rèn)為與遺傳，病毒感染及藥物等因素有關(guān)[5]。阿霉素屬于蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，臨床上應(yīng)用廣泛，研究顯示[6]長期使用 ADR 對心臟的慢性毒性作用主要是引起與累計(jì)量有關(guān)的擴(kuò)張型心肌病和充血性心力衰竭，而且ADR誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化在心肌損傷中起重要作用[7]。研究顯示阿霉素心肌病的發(fā)病有以下幾種可能的機(jī)制：氧自由基學(xué)說[8]、鐵離子代謝紊亂[9]、細(xì)胞凋亡學(xué)說[10]、自噬學(xué)說[11]，目前認(rèn)為氧自由基增多是阿霉素心肌病最主要的機(jī)制。研究阿霉素心肌病機(jī)制前，構(gòu)建相關(guān)模型是最基礎(chǔ)的一步，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)有多種方式可以構(gòu)建大鼠阿霉素?cái)U(kuò)張型心肌病模型，包括鼠尾靜脈注射，腹腔一次性大劑量注射和腹腔分次注射等，幾種方式各有優(yōu)缺點(diǎn)。本試驗(yàn)選用SD大鼠作為研究對象，采用不同劑量的藥物腹腔注射，比較幾種小劑量長療程的ADR造模方案的有效性，評價(jià)擴(kuò)張型心肌病模型的建立方法。

圖1 各組HE染色結(jié)果比較(×200)

圖2 各組Masson染色結(jié)果(×100)

從病理學(xué)研究結(jié)果可知，模型組A、B、C心肌組織已經(jīng)發(fā)生變化，但是模型組A與模型組B、C的全心質(zhì)量指數(shù)變化趨勢卻不同，與文獻(xiàn)[12]的研究結(jié)果不同，分析原因如下：模型組B、C大鼠因心臟擴(kuò)張、心功能下降而產(chǎn)生嚴(yán)重的腹水(平均60ml左右)，阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷后心臟質(zhì)量也下降，從而導(dǎo)致數(shù)值出現(xiàn)下降；而模型組A也出現(xiàn)心臟質(zhì)量的下降，但由于心功能尚可，沒有產(chǎn)生明顯的腹水，同時(shí)藥物可影響大鼠食欲，故體重下降的幅度超過了心臟質(zhì)量下降的幅度，從而出現(xiàn)全心質(zhì)量指數(shù)升高的趨勢。從本實(shí)驗(yàn)可知，當(dāng)實(shí)驗(yàn)中大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的腹水時(shí)，利用全心質(zhì)量指數(shù)來衡量心臟受損的程度則意義不大，此時(shí)可利用心臟/腓骨長度指數(shù)作為指標(biāo)，因?yàn)樵撝笜?biāo)只是基于大鼠的年齡，而與大鼠體重?zé)o關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)并未進(jìn)一步探究。

血清BNP是急性心力衰竭時(shí)最敏感和特異的指標(biāo)之一，其水平升高的程度與心室擴(kuò)張和壓力超負(fù)荷呈正比[13]。本研究中聯(lián)合血清BNP水平和心臟組織學(xué)結(jié)果，為建立可靠、實(shí)用的理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。模A給予阿霉素0.8mg/次×2次/w×8w，其累積劑量為12.8mg，在實(shí)驗(yàn)過程中全部存活，與對照組相比，其血清BNP雖然升高了，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合模A大鼠的癥狀及病理學(xué)的結(jié)果，考慮模A大鼠的造模未成功，與呂騰的研究結(jié)果不符[14]，分析其原因可能與大鼠的體重、藥物廠家及動(dòng)物耐受不同有關(guān)。但是與對照組相比，模型組A的膠原容積分?jǐn)?shù)結(jié)果顯示其心肌已經(jīng)出現(xiàn)區(qū)域性纖維化，表明阿霉素已經(jīng)對心肌產(chǎn)生了毒性作用，但是并沒有達(dá)到擴(kuò)心病的程度。原因分析如下：①每周分次給藥方式使大鼠對阿霉素藥物更易耐受。②研究顯示給藥累積劑量達(dá)到15mg/kg造模成功可能性較大[15]，模型組A給藥累積總量為12.8mg，小于15mg/kg，故心臟毒性表現(xiàn)不明顯，導(dǎo)致造模未成功。模B大鼠給予阿霉素2.5mg/次/w×6w，累積劑量為15mg，模B大鼠在第 1、5、8周各死亡 1只,生存率為 81.3%，與李曉倩的結(jié)果類似[16]。模C大鼠給予阿霉素2mg/次/w×8w，累積劑量為16mg，模C大鼠在第4、7周各死亡1只, 生存率為87.5%，與白潔等[17]的結(jié)果類似。模型組B、C在給藥過程中普遍出現(xiàn)脫毛，活動(dòng)減少，腹瀉，食量減少，體重增加(主要是因?yàn)楦顾ぴ觯顾科骄?0ml)等情況。模型組B、C造模死亡率低, 病理學(xué)結(jié)果顯示心肌細(xì)胞壞死，心肌膠原纖維增生明顯，血清BNP的結(jié)果也提示心功能損害嚴(yán)重，符合慢性擴(kuò)心病的改變。綜上，模A造模不成功可能與累積劑量的相關(guān)性最大。

表1中膠原容積分?jǐn)?shù)結(jié)果表明模型組B、C相較于模型組A纖維化更明顯，結(jié)合病理圖片結(jié)果、BNP及大鼠體征，提示較模A的給藥方式而言，模B及模C的給藥方式更理想，與之前的研究結(jié)果類似。

綜上所述，利用阿霉素造模的B、C兩種方式結(jié)果沒有顯著差異，均為阿霉素誘導(dǎo)擴(kuò)心病模型的可靠方式。ADR小劑量長療程腹腔注射建立阿霉素?cái)U(kuò)心病大鼠模型成功率高、死亡率低、重復(fù)性好，可作為構(gòu)建ADR擴(kuò)心病的理想方式，但是需要注意ADR的累積劑量。本實(shí)驗(yàn)為建立大鼠阿霉素?cái)U(kuò)張型心肌病模型提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究藥源性擴(kuò)心病的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[1]董巍.擴(kuò)張型心肌病患者的臨床治療進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2012,18(19):25～26.

[2] Carvalho F S,Burgeiro A,Garcia R,et al. Doxorubicin-induced cardiotoxicity:from bioenergetic failure and cell death to cardiomyopathy[J].Med Res Rev,2014,34(1):106～135.

[3] 中國臨床腫瘤學(xué)會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì).蒽環(huán)類藥物心臟毒性防治指南(2013 年版)[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志,2013,18(10):925～934.

[4] Simunek T,stérba M,Popelov O,et al.Anthracycline-inducedcardiotoxicity: Overview of studies examining the roles of oxida-tive stress and free cellular iron[J].Pharmacological Reports,2009,61(1):154～171.

[5] Knoll R H, Hoshijima M, Chien K R. Mechanisms of dilated cardiomyopathies [J]. Drug Discovery Today: DiseaseM echanisms, 2004, 1(1): 31～36.

[6]Swain S M,Whaley F S,Ewer M S,et al.Congestive heart failure in patients treated with doxorubicin: a retrospective analysis of three trials[J].Cancer,2003,97(11):2869～2879.

[7] Lipshultz S E,Lipsitz S R,Sallan S E,et al.Chronic progressive cardiac dysfunction years after doxorubicin therapy for childhood acute lymphoblastic leukemia[J].J Clin Oncol,2005,23(12):2629 ～2636.

[8] Simunek T,Stérba M,PopelovO,et al.Anthracycline induced cardiotoxicity:Overview of studies examining of roles of oxidation stress and free cellular iron[J].Pharmacological reports,2009,61(1):154～171.

[9] Stérba M,PopelovO,VavrovA,et al.Oxidative stress,redox signaling,and metal chelation in anthracycline cardiotoxicity and pharmacological cardioprotection[J].Antioxid Redox signal,2013,18(8):899～929.

[10] Liu L,Zhang X J,Qian B,et al.Heat shock protein 27 attenuated doxorubicin-induced myocardial damage by reducing cardiomyocyte apoptosis mitochondria damage and protein carbonylation[J].Chin J Cardiol,2008,36(11):1021～1026.

[11] Sishi B J,Loos B,van Rooyen J,et al.Autophage upregulation promotes survival and attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity[J].Biochem Pharmacol，2013,85(1):124～134.

[12] Shaojun M,Xiaojiang L,Liang D,et al. Protective effect of Sheng-Mai Yin, a traditional Chinese preparation, against doxorubicin-induced cardiac toxicity in rats[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine,2016,16:61.

[13]韓曼,于遠(yuǎn)望.利鈉肽家族及其與心力衰竭的關(guān)系[J].海南醫(yī)學(xué),2015,261(17):2558～2561.

[14]呂騰,武璞,肖思源,等. 阿霉素誘導(dǎo)建立擴(kuò)張型心肌病大鼠和家兔模型的研究[J]. 中藥藥理與臨床,2015,31(2):120～123.

[15] Hayward R,Hydock D S.Doxorubicin cardiotoxicity in the rat:an in vivo characterization[J].J Am Assoc Lab Anim Sci,2007,46(4):20～32.

[16]李倩曉,那榮妹,李曉菲,等. 阿霉素誘導(dǎo)擴(kuò)張型心肌病大鼠心功能的變化[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新, 2013,10(28):20～21.

[17] 白潔,陳蓉,盛佳,等. SD大鼠擴(kuò)張型心肌病模型的建立[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,16(3):210～212.

[編輯] 劉陽

2017-03-03

王慶濤(1990-)，男，碩士生，主要從事心血管專業(yè)學(xué)習(xí)與研究；通信作者：王玉璟，90829359@qq.com。

R542.2

A

1673-1409(2017)12-0080-04

[引著格式]王慶濤,王玉璟.不同給藥方式建立阿霉素心肌病模型的評價(jià)[J]. 長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2017,14(12):80～83,89.