管 笛，魏 穎，王 旗，李俊博，武會娟,*

（1.北京市理化分析測試中心，北京 100089；2.北京市基因測序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京 100089）

乳膠免疫層析法定量檢測豬尿液中的鹽酸克倫特羅

管 笛1,2，魏 穎1,2，王 旗1,2，李俊博1,2，武會娟1,2,*

（1.北京市理化分析測試中心，北京 100089；2.北京市基因測序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京 100089）

目的：建立以彩色乳膠微球為標記物的免疫層析技術(shù)檢測豬尿液中的鹽酸克倫特羅（clenbuterol，CLB）。方法：彩色乳膠微球標記CLB抗體并真空冷凍干燥，鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白（CLB-bovine serum albumin，CLB-BSA）人工抗原與羊抗鼠抗體分別噴到硝酸纖維素膜上作檢測線和質(zhì)控線，豬尿液樣本與凍干微球混勻后，插入試紙條，通過讀條儀進行測定。結(jié)果：通過理化參數(shù)的優(yōu)化，吐溫-20為最優(yōu)表面活性劑，選用300 nm乳膠微球，層析時間為9 min。方法的檢出限為0.013 ng/mL，回收率范圍在97.8%～106.0%之間，相對標準偏差不高于9.6%。結(jié)論：本研究成功建立了一種靈敏、準確的檢測豬尿液中CLB的彩色乳膠免疫層析方法。

免疫層析試紙；彩色乳膠；鹽酸克倫特羅；豬尿液；定量檢測

鹽酸克倫特羅（clenbuterol，CLB），瘦肉精的一種，是一種人工合成的β-腎上腺素受體激動劑。在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，因其具有加強心臟收縮、骨骼肌血管和支氣管平滑肌的擴張的作用，常用于治療休克和支氣管痙攣[1]。當大劑量使用CLB時，又具有能量重分配的作用，可顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率[2]。但是，CLB在動物體內(nèi)具有殘留性積累和半衰期長等藥理特性，且分布廣的特點。人們食用含有CLB殘留的肉品后，常常造成心動過速、肌肉震顫、口干、頭暈、失眠甚至于癱瘓等中毒癥狀，對心臟病患者更有生命危險[3-4]。我國農(nóng)業(yè)部發(fā)文明確禁止在飼料中添加CLB，并規(guī)定在動物性食品中不得檢出CLB。

目前CLB的檢測方法主要有儀器分析法和免疫學(xué)分析法。儀器分析法主要包括氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-7]、高效液相色譜法[8-9]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-13]、毛細管電泳法[14-15]。以上方法主要用于確證檢測，具有檢測靈敏度高、特異性強的優(yōu)點；但是也存在檢測步驟復(fù)雜，依賴昂貴設(shè)備支撐和對人員操作要求高等缺點，不適用于市場現(xiàn)場檢測[16]。免疫學(xué)分析法包括酶聯(lián)免疫吸附法[17-21]、化學(xué)發(fā)光檢測法[22-23]和膠體金免疫層析方法[24-26]等。酶聯(lián)免疫吸附法和化學(xué)發(fā)光法檢測靈敏度高，可用于定量分析，但檢測時間相對較長（30 min以上），對操作者素質(zhì)要求較高，無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測[27]。膠體金免疫層析法具有檢測速度快（3～10 min）、成本低、操作簡單等優(yōu)點，適用于現(xiàn)場快速篩查；但該法目前多采用裸眼目測方式通過條帶顯色的有無進行結(jié)果判讀，只能用于定性分析，存在檢測靈敏度不高、人為因素干擾大的缺點[28]。近年來，基于免疫層析讀數(shù)儀的試紙條定量檢測研究越來越多，在CLB檢測方面也有較多報道，用于定量檢測的標記物主要為膠體金和熒光微球。彩色乳膠微球作為免疫層析技術(shù)的標記物，與膠體金相比，成本更低且靈敏度更好。目前，主要應(yīng)用于疾病診斷領(lǐng)域，在食品安全領(lǐng)域應(yīng)用相對較少。本研究以彩色乳膠微球作為標記物，建立定量檢測豬尿液中CLB的免疫層析技術(shù)，以期降低檢測成本，獲得更高檢測靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

CLB標準品、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、吐溫-20、吐溫-80、Triton X-100、2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate，MES）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride crystalline，EDC）、羊抗鼠抗體 美國Sigma-Aldrich公司；乳膠微球 德國Merck公司；硝酸纖維素（nitrocellulose fi lter membrane，NC）膜 德國賽多利斯公司；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 美國Pierce公司；CLB單克隆抗體、CLB-BSA偶聯(lián)物 北京百歐美生科技有限公司；Tetronic 1307 上海杰一生物技術(shù)有限公司；氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用水均為超純水。

SCAN-01試紙條讀條儀 北京百歐美生科技有限公司；XYZ3060點膜儀 美國BioDot公司；ZQ2000斬切機 上海金標生物科技有限公司；THZ-C恒溫搖床太倉市實驗設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 乳膠微球與抗體的偶聯(lián)

以p H 6.0、0.1 m o l/L的M E S溶液（稱取1.066 g MES，0.45 g NaCl溶于50 mL純水，調(diào)pH 6.0）作為活化緩沖溶液，取50 μL乳膠微粒溶液于2 mL離心管中，14 000 r/min離心7 min，棄去液體，加入300 μL活化緩沖溶液，旋渦振蕩器上混勻；14 000r/min離心7 min，棄去液體，重復(fù)洗滌2 遍后，向乳膠微粒中加入0.96 mg EDC、1.15 mg NHS和300 μL活化緩沖溶液，37 ℃、120 r/min搖床振蕩30 min；用活化緩沖溶液洗滌2 遍，除去未反應(yīng)的活化劑，并更換新的2 mL離心管。加入CLB單克隆抗體至活化緩沖液終體積為400 μL，37 ℃、120 r/min搖床振蕩2.5 h。

封閉加入100 μL的BSA溶液（BSA事先溶解在偶聯(lián)緩沖液中）至BSA終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，對免疫乳膠微粒表面沒有偶聯(lián)抗體的活化基團進行封閉，并且通過BSA的物理吸附，封閉其他空間位點，降低在之后實驗中可能發(fā)生的非特異性吸附。37 ℃、120 r/min搖床振蕩30 min。14 000 r/min離心7 min，棄去液體，用含0.5% BSA的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌兩次，加入400 μL 0.5% BSA的PBS，80%功率超聲振蕩4 min后，4 ℃保存待用。

1.2.2 試紙條噴制與乳膠微球凍干

采用點膜儀將CLB-BSA（抗原質(zhì)量濃度為1 mg/mL）以及羊抗鼠二抗（質(zhì)量濃度為2 mg/mL）以1 μL/cm的噴量分別噴涂至NC膜上作為檢測線（T線）與質(zhì)控線（C線），T線與C線的間隔為0.5 cm，37 ℃烘箱干燥過夜。將NC膜、樣品墊、吸水墊依次相互交錯2 mm粘在含有不干膠的底板上得到試紙板，并用斬切機切割成寬度為4 mm的試紙條，置于含干燥劑的錫箔袋中密封，并于室溫條件保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述偶聯(lián)好抗體的乳膠微球加入到凍干緩沖液中（含1% BSA、1%蔗糖、2%吐溫-20、0.1% Proclin 300的PBS，pH 7.0），渦旋混勻后，以100 μL/孔加到微孔條中。將微孔條放入－80 ℃冰箱中預(yù)冷2 h后放入真空冷凍干燥機中，真空凍干16 h。凍干后將微孔條扣蓋放入含干燥劑的錫箔袋中密封，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 豬尿液的測定

用移液器吸取100 μL豬尿液加入到含有凍干免疫乳膠微球的微孔中，反復(fù)吸打幾次直至乳膠微球與豬尿液充分混勻，將試紙條插入微孔中進行層析，9 min后將試紙條放入讀條儀中進行測定。

1.2.4 標準曲線建立與數(shù)據(jù)處理

取CLB標準品溶液進行梯度稀釋，分別加入到含有凍干免疫乳膠微球的微孔中，充分混勻后，插條層析，9 min后將試紙條放入儀器中進行測定，獲得T線和C線位置的光密度值，每個質(zhì)量濃度重復(fù)測定3 次。以CLB的質(zhì)量濃度為橫坐標，T/（T+C）值為縱坐標，作標準曲線，結(jié)果用非線性四參數(shù)邏輯斯蒂回歸擬合。

1.2.5 豬尿液樣品中CLB回收率的測定

以不同質(zhì)量濃度CLB添加于空白豬尿液樣品中，使豬尿液中CLB的質(zhì)量濃度分別為0.8、0.2 ng/mL和0.08 ng/mL。取上述豬尿液樣品加入凍干免疫乳膠微球的微孔中，充分混勻后，插條層析，9 min后將試紙條放入讀條儀中進行測定，每個質(zhì)量濃度試紙條重復(fù)測定5 次。1.2.6 與酶聯(lián)免疫吸附法的比較

利用本研究建立的彩色乳膠免疫層析法與酶聯(lián)免疫吸附法測定含不同質(zhì)量濃度的CLB尿樣20 份，計算結(jié)果，并比較兩種方法的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面活性劑的選擇

表面活性劑在免疫層析過程中起到不可忽視的重要作用，表面活性劑的物理化學(xué)性質(zhì)對免疫層析試紙條的親水性、層析速度、靈敏度、均一性和穩(wěn)定性等都有著重要的影響。本實驗選取免疫層析研究中常用的表面活性劑：2%吐溫-20、2%吐溫-80、2% Triton X-100與20 mg/mL Tetronic 1307進行優(yōu)化。在免疫乳膠微球?qū)游? min后，分別測定加入吐溫-20、吐溫-80、Triton X-100與Tetronic 1307表面活性劑的試紙條的T/（T+C）值。當T/（T+C）值在0.5～1之間時，表明檢測線T值大于C值，相對于彩色乳膠免疫層析來說就是檢測線的顏色要比質(zhì)控線的顏色更深。在測定空白樣品時要盡量選取T/（T+C）值大的為最優(yōu)，表明在此條件下，抗體抗原結(jié)合更充分。加入2% 吐溫-20、2% 吐溫-80、2% Triton X-100與20 mg/mL Tetronic 1307表面活性劑的試紙條的T/（T+C）值分別為0.66、0.55、0.63、0.36。由于加入2%吐溫-20的試紙條T/（T+C）值最大，因此實驗選擇2% 吐溫-20為最優(yōu)表面活性劑。

2.2 抗體用量與微球大小優(yōu)化

本研究選取兩種不同粒徑的乳膠微球（300 nm和200 nm）各50 μL分別偶聯(lián)3 種不同質(zhì)量的CLB抗體（10、30 μg和50 μg）。以上6 種乳膠微球各取0.5 μL加入到微孔中，再補加100 μL凍干緩沖液后進行真空冷凍干燥。干燥完成后，分別測定空白豬尿液（CLB為陰性的豬尿液樣品）和CLB質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL的豬尿液，層析9 min后對試紙條進行測定，結(jié)果見表1。

表1 抗體與微球的優(yōu)化Table1 Optimization of antibody and latex beads

由表1可知，兩種不同粒徑的乳膠微球均隨著偶聯(lián)抗體量的增多，T/（T+C）值呈上升的趨勢。表明單位乳膠微球內(nèi)抗體量的增加，使得免疫乳膠微球與T線的結(jié)合能力增加。在空白豬尿液時，抗體量的增加，使得T線的顏色比C線的顏色要深的多。但是實驗發(fā)現(xiàn)在偶聯(lián)抗體量為50 μg時，兩種粒徑的乳膠微球?qū)游龊笥捎谌槟z微球絕大部分與T線的包被抗原結(jié)合，使得C線的顏色非常淺，用裸眼很難辨別是否顯色，容易使檢測人員作出試紙條失效判斷，因此該質(zhì)量濃度不可取。在豬尿液中CLB質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL時，偶聯(lián)抗體量為30 μg的兩種乳膠微球的T/（T+C）值在0.5左右，表明T線與C線顏色深淺差不多；偶聯(lián)抗體量為10 μg的兩種乳膠微球的T/（T+C）值分別為0.20和0.34，表明300 nm乳膠微球T線與C線顏色深淺差異最明顯，接近T線消線。從用裸眼初步定性檢測的角度考慮，偶聯(lián)10 μg抗體的300 nm乳膠微球優(yōu)勢明顯，更易于判斷。因此，綜合定性檢測和定量檢測兩方面的要求，選擇偶聯(lián)10 μg抗體的300 nm乳膠微球為最優(yōu)。

2.3 層析時間的確定

圖1 層析時間的影響Fig.1 Effect of chromatography time

層析時間過長，影響檢測的效率；層析時間過短，免疫反應(yīng)不夠充分，造成結(jié)果重復(fù)性差，不穩(wěn)定。本研究在免疫層析開始后，從1 min開始測定，每間隔2 min測定一次，到19 min結(jié)束。由圖1可知，隨著時間的延長，T線和C線的光密度值逐漸增大，即顏色一直加深。表明免疫乳膠微球隨著層析液均勻的在試紙條上層析，隨著時間的延長，層析到T線和C線的乳膠微球也隨之增加，因此光密度值一直升高。但是T/（T+C）值沒有隨著層析時間的延長而一直增加，在層析反應(yīng)的一開始T/（T+C）值一直在增加，但在9 min以后一直到19 min，T/（T+C）值不再增加維持相對穩(wěn)定。因此選擇9 min為最佳層析反應(yīng)時間。

2.4 標準曲線的建立與檢出限的確定

用空白豬尿液配制標準品溶液，標準品質(zhì)量濃度分別為1、0.5、0.17、0.056 ng/mL和0.019 ng/mL。將0.5 μL偶聯(lián)10 μg抗體的300 nm乳膠微球加入到微孔中，再補加100 μL凍干緩沖液后進行真空冷凍干燥。干燥完成后，將標準品溶液加入微孔中混勻，插試紙條層析9 min后測定結(jié)果。標準曲線橫坐標為CLB質(zhì)量濃度，縱坐標為T/（T+C）值，標準曲線采用四參數(shù)邏輯斯蒂擬合。標準曲線方程為：，線性范圍在0.062～1 ng/mL之間，r值為0.999。

取20 個空白豬尿液，采用彩色乳膠試紙條檢測，每個樣品重復(fù)檢測3 次，9 min后測定試紙條的T/（T+C）值。試紙條測定豬尿液的檢出限等于20 個陰性樣品測量的T/（T+C）平均值減去3 倍的標準偏差所對應(yīng)的質(zhì)量濃度。通過測定該法豬尿液樣品的檢出限為0.013 ng/mL。

2.5 方法的特異性實驗結(jié)果

將彩色乳膠試紙條與其他常見的β-興奮劑化學(xué)藥物進行交叉反應(yīng)的測定。在陰性尿樣中分別添加萊克多巴胺、沙丁胺醇、賽曼特羅、鹽酸特布他林和鹽酸環(huán)侖特羅5 種藥物，添加質(zhì)量濃度均為50 ng/mL，用本研究建立的方法定量檢測。結(jié)果測得的質(zhì)量濃度均小于0.013 ng/mL的檢出限，表明本研究建立的彩色乳膠免疫層析法與以上5 種藥物幾乎沒有交叉反應(yīng)，特異性良好。2.6 添加回收率測定結(jié)果

向空白豬尿液樣品中添加一定量的CLB標準品，使終質(zhì)量濃度為0.8、0.2 ng/mL和0.08 ng/mL。每個質(zhì)量濃度試紙條重復(fù)測定5 次，結(jié)果見表2，添加回收率范圍在97.8%～106.0%之間，相對標準偏差在5.3%～9.6%之間。表明本實驗建立的用于豬尿液中CLB定量檢測的彩色乳膠免疫層析法具有良好的精密度。

表2 CLB添加回收率測定Table2 Recoveries of CLB from spiked swine urine samples

2.7 方法的比較

利用彩色乳膠試紙條與酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定20 份不同質(zhì)量濃度的豬尿液樣品，兩種方法測得的結(jié)果進行相關(guān)性比較，結(jié)果見圖2。兩種方法測定結(jié)果相關(guān)性良好，相關(guān)性方程為y=0.981x－0.005，R2為0.982。

圖2 彩色乳膠試紙條與酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定方法的相關(guān)性Fig.2 Correlation between the proposed method in the study and enzymelinked immunoabsorbent assay (ELISA)

3 結(jié) 論

本研究中，實驗將彩色乳膠微球最為標記物并應(yīng)用于免疫層析檢測中，通過層析時間、微球粒徑、抗體用量和表面活性劑等參數(shù)的優(yōu)化，建立了能夠定量檢測豬尿液中CLB的免疫層析技術(shù)。該技術(shù)的檢出限為0.013 ng/mL，添加回收率范圍在97.8%～106.0%之間，相對標準偏差在5.3%～9.6%之間。本研究建立的方法比文獻報道利用膠體金標記物[29]（檢出限為0.22 ng/mL）和熒光硅球標記物[30]（檢出限為0.28 ng/mL）的檢出限更低，更加靈敏。綜上，本研究成功建立了一種檢測豬尿液中CLB的彩色乳膠免疫層析方法。

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Development of Dyed Latex Bead-Based Immunochromatographic Assay for Quantitative Detection of Clenbuterol in Swine Urine

GUAN Di1,2, WEI Ying1,2, WANG Qi1,2, LI Junbo1,2, WU Huijuan1,2,*
(1. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China; 2. Beijing Engineering Technique Research Center for Gene Sequencing & Function Analysis, Beijing 100089, China)

Objective： Aiming at the development of an immunochromatographic method based on dyed latex beads for the detection of clenbuterol (CLB) in swine urine. Methods： Dyed latex beads were conjugated with anti-CLB antibody and vacuum freeze-dried. CLB-bovine serum albumin (CLB-BSA) conjugate and goat anti-mouse IgG antibodies were coated onto nitrocellulose membranes to establish test and control lines, respectively. The test was carried out by placing swine urine into the sample well and mixed with dyed latex beads. After incubation, the optical density was measured by a microplate reader. Results： After optimizing the physical and chemical parameters, the best surfacant was Tween-20, 300 nm dyed latex beads were chosen, and the incubation time was9 minutes. The limit of detection (LOD) was 0.013 ng/mL. The recoveries from spiked swine urine varied from 97.8% to 106.0%, with relative standard deviation of less than 9.6%. Conclusion： A sensitive and accurate method for the detection of CLB was successfully developed in this paper.

immunochromatographic strip; dyed latex beads; clenbuterol; swine urine; quantitative detection

10.7506/spkx1002-6630-201712042

TS207.3

A

1002-6630（2017）12-0273-05

管笛, 魏穎, 王旗, 等. 乳膠免疫層析法定量檢測豬尿液中的鹽酸克倫特羅[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 273-277.

10.7506/spkx1002-6630-201712042. http：//www.spkx.net.cn

GUAN Di, WEI Ying, WANG Qi, et al. Development of dyed latex bead-based immunochromatographic assay for quantitative detection of clenbuterol in swine urine[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 273-277. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201712042. http：//www.spkx.net.cn

2016-07-22

北京市優(yōu)秀人才項目（2014400685627G277）；北京市科學(xué)技術(shù)研究院青年骨干計劃項目（201415）

管笛（1983—），男，副研究員，博士，研究方向為分析化學(xué)。E-mail：guandi@yeah.net

*通信作者：武會娟（1972—），女，研究員，博士，研究方向為分子生物學(xué)。E-mail：sunnywhj@126.com