王琳煒，歐陽臻*，張碧娟，楊 倩，王篤軍，于一凡，張 杰，馬 青

（江蘇大學藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

霍山鐵皮石斛多糖的脫蛋白工藝及結構分析

王琳煒，歐陽臻*，張碧娟，楊 倩，王篤軍，于一凡，張 杰，馬 青

（江蘇大學藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

優(yōu)選霍山鐵皮石斛多糖脫蛋白工藝，并對其進行分離純化及結構分析。以蛋白脫除率和多糖損失率為評價指標，比較Sevag法、酶法及酶-Sevag法3 種脫蛋白方法。結果表明，酶-Sevag法脫蛋白效果最佳，蛋白脫除率為81.58%，多糖損失率為15.63%。采用DEAE-52纖維素柱、Sephadex G-100凝膠柱分離純化石斛多糖，得活性組分DOPA-1；采用紫外掃描光譜、高效液相色譜鑒定DOPA-1為均一多糖；采用氣相色譜分析表明組分單糖由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成（各單糖的物質的量比為1∶0.42∶0.27）；采用紅外光譜和剛果紅實驗分析糖鏈結構表明，DOPA-1有典型的糖類特征吸收峰，存在β-D-甘露吡喃糖苷，且具有三股螺旋構象。

鐵皮石斛多糖；脫蛋白；分離純化；結構分析

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛（Dendrobium off i cinale Kimura et Migo）的干燥莖[1]，是藥食兩用的名貴藥材之一，具有獨特的藥用價值。早在我國第一部藥學專著《神農本草經》中，就有石斛“除痹，下氣，補五臟虛勞，羸瘦，強陰。久服厚腸胃，輕身延年”的記載[2]。目前鐵皮石斛主要分布在我國安徽、浙江、湖南、云南、廣西等地[3]，其中安徽霍山鐵皮石斛，又名萬丈須，生長條件極為苛刻，作為安徽省道地藥材一直倍受社會各界的關注，也被歷代研究者奉為石斛中的上品，近年來，關于霍山鐵皮石斛的研究漸為盛行[4]。鐵皮石斛中含有多糖、生物堿、菲類、聯(lián)芐類、氨基酸等多種活性成分[5]，多糖作為其主要有效成分之一，在抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、提高機體免疫力[6-9]等方面具有顯著療效。多糖的生物活性與結構密切相關，目前已成為該領域研究的一大核心問題[10-12]。目前多糖的提取方法較多，但在多糖提取過程中都會伴有蛋白質，蛋白質的存在嚴重影響多糖結構與活性的進一步研究。所以，蛋白質的脫除成為多糖純化的一個關鍵步驟，對多糖品質、結構以及活性的研究有著重要影響，現國內外采用的脫蛋白法主要有：Sevag法、三氯乙酸法、酶法、等電點法、鹽酸法等[13]。因此，本實驗中以霍山產鐵皮石斛為原料，優(yōu)選霍山鐵皮石斛多糖脫蛋白工藝，采用DEAE -52纖維素色譜柱和Sephadex G-100凝膠色譜柱分離純化霍山鐵皮石斛多糖，并對其結構進行分析，為進一步揭示多糖結構與活性的關系奠定基礎，同時為霍山鐵皮石斛保健品的開發(fā)以及資源培育提供有價值的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霍山鐵皮石斛（3 a生），采自安徽省六安市霍山縣，由江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定為蘭科植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）的干燥莖，批號1410C02HS013S3；胰蛋白酶（活力單位大于2 500 U/g，pH 5.0～7.0） 上海生化試劑廠；牛血清白蛋白、單糖標準品（葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖等）美國Sigma公司；透析袋（截留分子質量3 500 D）北京Solarbio科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA124S電子天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；UNIC9100型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；R-210旋轉蒸發(fā)儀 德國Büchi公司；FreeZone?冷凍干燥機 美國Labconco公司；7890氣相色譜儀 美國Agilent公司；Nicolet 470傅里葉紅外光譜儀美國Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 霍山鐵皮石斛多糖的提取

稱取霍山鐵皮石斛鮮條20 g，剪成不超過3 mm的小段置于圓底燒瓶中，以料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水，90 ℃水浴提取2 h，重復3 次，合并浸提液，減壓濃縮至一定體積后，加入95%乙醇溶液使乙醇體積分數達到80%，靜置過夜，經離心（12 000 r/min，15 min）收集沉淀，冷凍干燥，得石斛粗多糖。

1.3.2 蛋白質含量的測定

1.3.2.1 標準曲線溶液的繪制

精密稱取10.0 mg牛血清白蛋白于100 mL容量瓶中，加水至刻度，即得0.1 mg/mL的貯備液。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL于具塞試管中，加水至1.0 mL，搖勻后每管加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250染色液，混勻，以蒸餾水作空白，于595 nm波長處測定吸光度（A595nm）[14]，以牛血清白蛋白溶液質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線方程：Y=6.586 6X+0.056 7，R2＝0.999 1。

1.3.2.2 樣品中蛋白質的測定

將凍干的霍山鐵皮石斛粗多糖用去離子水配成溶液，按照1.3.2.1節(jié)步驟操作，各取1.0 mL樣品液至3 支試管內，分別加入考馬斯亮藍染色液5.0 mL，以蒸餾水作空白測定吸光度，代入1.3.2.1節(jié)中標準曲線計算蛋白含量，以式（1）計算蛋白脫除率：

式中：Ri、Rj分別為脫蛋白前、后蛋白含量/（mg/mL）。1.3.3 多糖含量的測定

1.3.3.1 標準曲線的繪制

精密稱取烘干至質量恒定的葡萄糖標準品25.0 mg，置于250 mL容量瓶中，加水至刻度，即得0.1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。各吸取0、0.2 、0.4 、0.6、0.8 mL和1.0 mL于具塞試管中，分別加水至2.0 mL，加入1.0 mL 5%的苯酚及5.0 mL濃硫酸溶液，搖勻后移至40 ℃水浴鍋保溫10 min，冷卻至室溫，同樣以蒸餾水作空白，于490 nm波長處測定吸光度（A490nm）[15]，以葡萄糖質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，得回歸方程：Y＝8.192X+0.038 9，R2＝0.999 2。（采用苯酚-硫酸法測多糖含量，以葡萄糖做標準曲線僅為工藝考察作參考）。

1.3.3.2 樣品中多糖的測定

石斛粗多糖按1.3.3.1節(jié)方法測定吸光度后，代入回歸方程即可得到多糖含量，從而計算出多糖損失率，如式（2）所示：

式中：Ti、Tj分別為脫蛋白前、后多糖含量/（mg/mL）。

1.3.4 霍山鐵皮石斛多糖脫蛋白方法

1.3.4.1 Sevag法

配制質量濃度為1 mg/mL的粗多糖溶液，加入其1/4體積的氯仿-正丁醇溶液（4∶1，V/V），充分攪拌后離心（5 000 r/min，15 min），棄去中間蛋白層及下層有機試劑，測定蛋白質和多糖含量。按上述方法重復多次，直至無明顯沉淀[16]。

1.3.4.2 胰蛋白酶法

稱取胰蛋白酶1.0 g，K2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH 5.8）溶解后定容至100 mL，配制成pH 5.98、質量濃度10 mg/mL的酶液[17-18]。選取酶添加量、酶解溫度及酶解時間3 個因素，在單因素試驗的基礎上，設計L9（34）正交試驗，考察對粗多糖蛋白脫除率及多糖損失率的影響，其因素水平設計如表1所示。待糖液酶解后置沸水浴滅酶10 min，離心（3 000 r/min，10 min）后取上清液測定蛋白含量。

表1 酶法脫蛋白正交試驗因素與水平Table1 Coded and corresponding actual values of the independent variables used in the orthogonal array design for the optimization of enzymatic deproteinization of the polysaccharides

1.3.4.3 胰蛋白酶-Sevag法

配制1 mg/mL的石斛粗多糖溶液，采用1.3.4.2節(jié)酶法最優(yōu)脫蛋白工藝，置沸水浴中滅酶10 min，取出后離心，上清液采用1.3.4.1節(jié)Sevag法脫蛋白，重復多次，直至無明顯蛋白沉淀。

1.3.5 霍山鐵皮石斛多糖的分離純化

1.3.5.1 DEAE-52纖維素柱層析

稱取石斛粗多糖0.1 g，溶于5 mL蒸餾水，離心后上清液經DEAE-52纖維素柱層析。用蒸餾水以及不同濃度NaCl溶液洗脫，以1 mL/min的流速收集洗脫液，苯酚-硫酸法示蹤，于490 nm波長處隔管測定吸光度，并繪制洗脫曲線。合并各管洗脫液，濃縮、透析、冷凍干燥，最終得到DEAE-52柱分離組分，命名為DOPA。

1.3.5.2 Sephadex G-100凝膠柱純化

稱取多糖組分DOPA 60 mg，溶于5 mL蒸餾水，離心后取上清液，經Sephadex G-100凝膠柱作進一步純化。用蒸餾水按1 mL/min的流速洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤檢測。繪制洗脫曲線，收集各單一峰，減壓濃縮、冷凍干燥，得純化組分DOPA-1。

1.3.6 純度鑒定

1.3.6.1 紫外光譜檢測

配制1 mg/mL的DOPA-1溶液，于200～400 nm波長范圍內進行紫外掃描。

1.3.6.2 高效液相色譜檢測

稱取樣品DOPA-12 mg，溶于2 mL雙蒸水配制成1 mg/mL的溶液，用0.45 μm濾膜過濾后進樣。色譜柱：TSK-GEL G-3000PWXL（7.8 mm×30 mm）；檢測器：示差折光檢測器；流動相：雙蒸水；進樣量：10 μL；流速：0.45 mL/min；柱溫30 ℃；檢測器溫度：30 ℃。

1.3.7 單糖組成分析

采用氣相色譜分析單糖組成前，通常先將多糖制備成糖腈乙酸酯衍生物[19]。精確稱取DOPA-1 10.0 mg至具塞試管中，加入5 mL2 mol/L的硫酸溶液，100 ℃水浴8 h后加碳酸鋇至溶液呈中性，離心，上清液減壓蒸干，再依次加入鹽酸羥胺10 mg、吡啶1 mL，90 ℃水浴30 min，冷卻后加入乙酸酐1 mL，90 ℃水浴加熱30 min，冷卻后即得糖腈乙酸酯衍生物[20]。其余各單糖的制備方法同上。

氣相色譜分析條件：色譜柱：HP-1彈性石英毛細管色譜柱（21 m×0.2 mm）；載氣：氮氣；檢測器：氫火焰離子化檢測器；柱溫：以4 ℃/min從130 ℃升至240 ℃，并在240 ℃時保留10 min；汽化室及檢測器溫度均為250 ℃。

1.3.8 紅外光譜分析

稱取1 mg干燥的DOPA-1樣品，與100 mg KBr粉末在紅外燈下混勻后壓片，在500～4 000 cm－1范圍內進行掃描[21]。

1.3.9 剛果紅實驗

配制DOPA-1溶液（1 mg/mL）與剛果紅溶液（80 μmol/mL）。將1 mL DOPA-1溶液與1 mL剛果紅溶液混勻后分別加至10 支試管內，每管逐漸加入1 mol/L的NaOH溶液，使NaOH濃度范圍為0～0.5 mol/L，振蕩后室溫靜置，于400～600 nm波長范圍內進行波長掃描，記錄不同濃度NaOH溶液中剛果紅的λmax吸收[22]。

2 結果與分析

2.1 Sevag法脫蛋白

圖1 Sevag法脫蛋白Fig.1 Efficiency of protein removal by the Sevag method

由圖1可知，隨著脫蛋白次數的增加，蛋白脫除率與多糖損失率均呈上升趨勢。用Sevag法處理8 次后，蛋白質脫除率達到82.67%，多糖損失率達32.72%?？梢娫诘鞍酌撊サ耐瑫r，會損失部分多糖，且易造成有機試劑的殘留。

2.2 胰蛋白酶法脫蛋白

2.2.1 霍山鐵皮石斛多糖脫蛋白工藝單因素試驗結果

2.2.1.1 酶添加量對石斛多糖蛋白脫除率的影響

固定酶解溫度40 ℃、酶解時間40 min，考察酶添加量（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL）對蛋白脫除率的影響，結果見圖2。

圖2 酶添加量對蛋白脫除率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on protein removal

由圖2可知，酶添加量在0.2～0.5 mL范圍內，隨著酶添加量的增加，蛋白脫除率增加顯著；酶添加量為0.5 mL時，蛋白脫除率達到最大；繼續(xù)添加酶，蛋白脫除率無明顯變化。這可能由于當酶添加量低于0.5 mL時，酶與底物的接觸面積會隨著酶添加量的上升而增加，蛋白脫除率效果顯著；當酶添加量高于0.5 mL時，蛋白脫除率效果增加不明顯。這可能是多糖中的蛋白質，即胰蛋白酶的作用底物含量有限，限制了酶的進一步反應[23]，因此將0.5 mL選為最適酶添加量。

2.2.1.2 酶解時間對石斛多糖蛋白脫除率的影響

固定酶解溫度40 ℃、酶添加量0.5 mL，考察酶解時間（30、40、50、60、70 min）對蛋白脫除率的影響，結果見圖3。

圖3 酶解時間對蛋白脫除率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on protein removal

圖3表明，在30～40 min時間范圍內，石斛粗多糖的蛋白脫除率隨著酶解時間的延長而顯著提高，在40 min時有最高值，50 min后蛋白脫除率變化不明顯。可能由于酶促反應在40 min時已基本完成，固定酶添加量，延長酶促反應時間并不能使蛋白脫除率顯著增加[24]，因此將40 min選為最佳酶解時間。

2.2.1.3 酶解溫度對石斛多糖蛋白脫除率的影響

固定酶解時間40 min、酶添加量0.5 mL，考察酶解溫度（20、30、40、50、60 ℃）對蛋白脫除率的影響，結果見圖4。

圖4 酶解溫度對蛋白脫除率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on protein removal

由圖4可知，當溫度在20～40 ℃范圍內，蛋白脫除率隨酶解溫度的升高顯著增加，當酶解溫度達到40 ℃時，蛋白脫除率達到最大值；溫度高于40 ℃后，蛋白脫除率逐漸下降。這可能與蛋白酶作用的最適溫度有關，當溫度高于酶的最適溫度后，酶活力減弱，直至完全失活

[25]，因此選擇40 ℃作為最適酶解溫度。

2.2.2 正交試驗結果

表2 胰蛋白酶法脫蛋白正交試驗結果Table2 Orthogonal array design in terms of coded and actual values with experimental results

表2胰蛋白酶法脫蛋白正交試驗結果中，綜合得分按蛋白脫除率及多糖保留率各50%的權重綜合，由極差R分析可得知，影響蛋白脫除程度的主次順序為A＞C＞B＞D，即酶添加量＞酶解溫度＞酶解時間。

表3 蛋白脫除率方差分析Table3 Variance analysis on the deproteinization rate

由表3可知，酶添加量對蛋白脫除率影響顯著，酶解時間和酶解溫度對脫蛋白影響不顯著。故最優(yōu)脫蛋白工藝為A2、B2、C1，即胰蛋白酶量0.5 mL、酶解時間40 min、酶解溫度35 ℃。在此條件下進行3 次驗證實驗，蛋白平均脫除率為71.88%（相對標準偏差為0.71%）；多糖平均損失率為13.44%（相對標準偏差為0.86%）。

2.3 胰蛋白酶-Sevag法脫蛋白

圖5 酶-Sevag法脫蛋白Fig.5 Deproteinization efficiency of the combined method

由圖5可知，3 次萃取后蛋白脫除率基本保持不變，但多糖損失率仍有增加；5 次萃取后蛋白脫除率為81.61%、多糖損失率為16.33%。綜合考慮，以酶-Sevag法萃取3 次較為合理，此時蛋白脫除率為81.58%，多糖損失率為15.63%。

2.4 脫蛋白工藝的比較

表 43 種脫蛋白方法的比較Table4 Comparison of three protein removal methods

表4表明，采用Sevag法脫蛋白，蛋白脫除率最高，達82.67%，但多糖損失率為32.72%；酶法脫蛋白時，蛋白脫除率最低，僅為71.88%；而將酶-Sevag法聯(lián)用，蛋白脫除率與Sevag法結果相差不大，但多糖損失率僅為15.63%，遠小于Sevag法。這是由于采用酶-Sevag法脫蛋白，胰蛋白酶可酶解蛋白，使其成為相對分子質量較小的多肽或氨基酸，離心后大分子多糖大多數得到沉淀，而相對分子質量較小的多肽和氨基酸大部分保留在溶液中，再結合Sevag法處理3 次，減少了萃取次數，使多糖損失率變低。綜合考慮蛋白脫除率與多糖損失率，確定酶-Sevag法為霍山鐵皮石斛多糖脫蛋白的最優(yōu)方法。

2.5 霍山鐵皮石斛多糖的純化結果

2.5.1 霍山鐵皮石斛多糖的DEAE-52柱分離

由圖6可知，鐵皮石斛多糖經DEAE-52纖維素柱洗脫后得到了4 個組分，先后順序依次為DOPA、DOPB、DOPC和DOPD。其中，以水洗脫部位（DOPA ）收集量最大，并對其進一步分離純化。

圖6 鐵皮石斛多糖DEAE-52柱層析洗脫曲線Fig.6 Elution curve of the polysaccharides from Dendrobium officinale on DEAE-52

2.5.2 霍山鐵皮石斛多糖的Sephadex G-100柱分離

圖7 鐵皮石斛多糖DOPA的Sephadex G-100柱層析洗脫曲線Fig.7 Elution curve of the polysaccharides on Sephadex G-100

組分DOPA的Sephadex G-100洗脫曲線如圖7所示，顯示單一對稱峰，表明DOPA-1已達到一定均一純度。

2.6 純度鑒定結果

2.6.1 紫外光譜分析

圖8 紫外光譜掃描圖Fig.8 UV absorption spectrum of the purified polysaccharides

樣品DOPA-1的紫外掃描圖譜（圖8）在260、280 nm波長處無紫外特征吸收峰，表明樣品不含核酸和蛋白質。

2.6.2 高效液相色譜分析

圖9 DOPA-1的高效液相色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram of DOPA-1

樣品DOPA-1的高效液相色譜圖譜如圖9所示，顯示單一對稱峰，表明該樣品為均一組分。

2.7 單糖組成的氣相色譜分析結果

氣相色譜分析表明，DOPA-1主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，各單糖物質的量比為1∶0.42∶0.27，氣相色譜圖譜見圖10。

圖10 標準單糖（A）和DOPA-1（B）衍生化后的氣相色譜圖Fig.10 GC chromatograms of derivatives of monosaccharide standards (A) and DOPA-1 (B)

2.8 紅外光譜分析結果

圖11 DOPA-1紅外光譜圖Fig.11 FI-IR spectrum of DOPA-1

從圖11可以看出，在3 386.443 cm－1和1 027.890 cm－1處的吸收峰分別是由O—H的伸縮振動和變角振動引起的；2 929.389 cm－1處為C—H伸縮振動峰，1 425.160 cm－1處的吸收峰屬于C—H的變角振動，由此可以確證DOPA-1為糖類物質；1 645.009 cm－1出現的吸收峰是由乙酰氨基（—NHCOCH3）中C＝O的伸縮振動引起的；1 380.805 cm－1處為羧基中C＝O吸收峰；1 300～1 000 cm－1區(qū)域屬于吡喃糖環(huán)的特征吸收峰[26-29]。此外，811.897 8 cm－1和873.6097 cm－1處的吸收峰，表明多糖分子中可能存在β-D-甘露吡喃糖苷[19]。

2.9 剛果紅實驗結果

圖12 剛果紅-DOPA-1絡合物最大吸收波長變化Fig.12 Maximum absorption wavelength of Congo red-DOPA-1 complex as a function of NaOH concentration

剛果紅可與含三股螺旋鏈構象的多糖發(fā)生絡合反應，進而使絡合物的吸收發(fā)生紅移，且在一定的NaOH濃度范圍內呈亞穩(wěn)性，呈現最大吸收波長的特征變化[30]。圖12顯示，當NaOH溶液在0～0.2 mol/mL范圍時，紫外吸收移向長波，表明樣品與剛果紅發(fā)生絡合反應，但隨著繼續(xù)增大，溶液的λmax逐漸減小，由此推測DOPA-1具有三股螺旋構象。

3 討 論

本研究比較了Sevag法、酶法以及酶-Sevag法對石斛粗多糖蛋白脫除率及多糖損失率的影響，結果表明傳統(tǒng)的Sevag法需經多次重復，耗費試劑的同時會造成有機溶劑的殘留，多糖損失率大，高達32.72%；酶法脫蛋白是通過蛋白酶將粗多糖中的蛋白質水解，專屬性強，蛋白脫除率最低，為71.88%；而將酶法與Sevag法聯(lián)用，蛋白脫除率高，多糖損失較少。本實驗優(yōu)選得到的最佳脫蛋白方法為酶-Sevag法聯(lián)用，此時蛋白脫除率為81.58%，多糖損失率為15.63%。

本實驗采用傳統(tǒng)的水提醇沉法提取霍山鐵皮石斛多糖，酶-Sevag法脫蛋白，再經DEAE-52纖維素柱、Sephadex G-100凝膠柱分離純化得到石斛多糖組分DOPA-1，并進行結構分析，石斛多糖組分DOPA-1為均一多糖，單糖組成為甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質的量比為1∶0.42∶0.27。紅外光譜及剛果紅實驗結果表明，DOPA-1具有典型的糖類特征吸收峰，存在β-D-甘露吡喃糖苷，且具有三股螺旋構象。本研究結果可為進一步研究霍山鐵皮石斛多糖結構與活性的關系及開發(fā)應用提供科學依據。

[1] 衛(wèi)生部藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京： 化學工業(yè)出版社, 2015： 282.

[2] 孫星衍, 孫馮翼. 神農本草經[M]. 北京： 商務印書館, 1959： 22.

[3] 吳建, 王建方, 方玲, 等. 國內鐵皮石斛研究概況[J]. 中國藥學雜志, 2013, 48(19)： 1610-1613.

[4] 黃澤豪, 林文明, 范世明. 中華仙草： 鐵皮石斛[J]. 生命世界, 2015(10)： 36-37.

[5] 張光濃, 畢志明, 王崢濤, 等. 石斛屬植物化學成分研究進展[J]. 中草藥, 2003, 34(6)： 附5-附8. DOI：10.3321/j.issn：0253-2670.2003.06.042.

[6] 鮑素華. 不同分子量鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性研究[J]. 食品科學, 2009, 30(21)： 123-127. DOI：10.3321/j.issn：1002-6630.2009.21.029.

[7] YANG L, HAN H, NAKAMURA N, et al. Bio-guided isolation of antioxidants from the stems of Dendrobium aurantiacum var. denneanum[J]. Phytotherapy Research, 2007, 21(7)： 696-698. DOI：10.1002/ptr.2133.

[8] WU X, MAO G, ZHAO T, et al. Isolation, purification and in vitro anti-tumor activity of polysaccharide from Ginkgo biloba sarcotesta[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 86(2)： 1073-1076. DOI：10.1016/ j.carbpol.2011.04.069.

[9] DING Q, YANG D, ZHANG W, et al. Antioxidant and anti-aging activities of the polysaccharide TLH-3 from Tricholoma lobayense[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 85： 133-140. DOI：10.1016/j.ijbiomac.2015.12.058.

[10] JIANG G, WEN L, FENG C, et al. Structural characteristics and antioxidant activities of polysaccharides from longan seed[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 92(1)： 758-764. DOI：10.1016/ j.carbpol.2012.09.079.

[11] WANG Y, MAO F, WEI X. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from leaves, flowers and seeds of green tea[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 88(1)： 146-153. DOI：10.1016/ j.carbpol.2011.11.083.

[12] HSIEH S Y, CHENG C, LIAO K S, et al. Structure and bioactivity of the polysaccharides in medicinal plant Dendrobium huoshanense[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 16(11)： 6054-6068. DOI：10.1016/j.bmc.2008.04.042.

[13] 殷洪梅, 尚強, 蕭偉. 金銀花多糖脫蛋白方法的研究[J]. 中草藥, 2010, 41(4)： 584-586.

[14] 秦衛(wèi)東, 馬利華, 陳學紅, 等. 生姜多糖的提取及脫蛋白研究[J]. 食品科學, 2008, 29(4)： 218-220. DOI：10.3321/j.issn：1002-6630.2008.04.045.

[15] 羅傲雪. 石斛粗多糖脫蛋白方法的研究[J]. 安徽農業(yè)科學, 2008, 36(29)： 12741-12742. DOI：10.3969/j.issn.0517-6611.2008.29.087.

[16] 李艷輝. 玉竹多糖脫蛋白方法的比較研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2011, 22(9)： 2127-2128. DOI：10.3969/j.issn.1008-0805.2011.09.033.

[17] YAN Q J. Removal of protein from the crude astragalus polysaccharides by proteases[J]. Food Science & Technology, 2004, 6： 23-26. DOI：10.3969/j.issn.1005-9989.2004.06.007.

[18] 張雅利. 胰蛋白酶-Sevag法聯(lián)用脫柿多糖蛋白[J]. 食品工業(yè)科技, 2005, 26(5)： 107-108. DOI：10.3969/j.issn.1002-0306.2005.05.033.

[19] 張惟杰. 糖復合物生化研究技術[M]. 2版. 杭州： 浙江大學出版社, 2006.

[20] 歐陽臻, 陳鈞, 李永輝. 桑葉多糖的分離純化及組成研究[J]. 食品科學, 2005, 26(3)： 181-184. DOI：10.3321/j.issn：1002-6630.2005.03.043.

[21] 朱玉婷, 田瑞, 楊潔, 等. 傅里葉紅外光譜法測定硫酸酯化葛仙米多糖的取代度[J]. 食品科學, 2013, 34(4)： 150-153.

[22] DILIP R, SOUMITRA M, INDRANIL C, et al. The structure and conformation of a water-insoluble (1→3)-(1→6)-β-D-glucan from the fruiting bodies of Pleurotus florida[J]. Carbohydrate Research, 2008, 343(5)： 982-987. DOI：10.1016/j.carres.2007.12.022.

[23] 林翔凱, 張龍濤, 陳潔, 等. 紫薯多糖脫蛋白工藝的研究[J].熱帶作物學報, 2014, 35(2)： 381-386. DOI：10.3969/ j.issn.1000-2561.2014.02.029.

[24] 張怡. 金柑多糖酶法脫蛋白工藝的研究[J]. 熱帶作物學報, 2012, 33(1)： 166-170. DOI：10.3969/j.issn.1000-2561.2012.01.034.

[25] 周鴻立, 楊曉虹. 玉米須多糖中蛋白質脫除的Sevag與酶法聯(lián)用工藝優(yōu)化[J]. 食品科學, 2011, 32(8)： 129-132.

[26] LUO A X, HE X J, ZHOU S D, et al. Purification, composition analysis and antioxidant activity of the polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl.[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 79(4)： 1014-1019. DOI：10.1016/ j.carbpol.2009.10.033.

[27] FAN Y, HE X J, ZHOU S, et al. Composition analysis and antioxidant activity of polysaccharide from Dendrobium denneanum[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2009, 45(2)： 169-173. DOI：10.1016/j.ijbiomac.2009.04.019.

[28] XU W, ZHANG F, LUO Y, et al. Antioxidant activity of a water-soluble polysaccharide purified from Pteridium aquilinum[J]. Carbohydrate Research, 2008, 344(2)： 217-222. DOI：10.1016/j.carres.2008.10.021.

[29] LI X L, XIAO J J, ZHA X Q, et al. Structural identification and sulfated modification of an antiglycation Dendrobium huoshanense polysaccharide[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 106(12)： 247-254. DOI：10.1016/j.carbpol.2014.02.029.

[30] 劉微微, 劉旭, 曹學麗, 等. 白背三七多糖的結構表征及α-葡萄糖苷酶的抑制活性[J]. 食品科學, 2013, 34(7)： 115-120. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201307024.

Deproteinization and Structural Analysis of Polysaccharides from Dendrobium off i cinale Kimura et Migo Grown in Huoshan

WANG Linwei, OUYANG Zhen*, ZHANG Bijuan, YANG Qian, WANG Dujun, YU Yifan, ZHANG Jie, MA Qing
(School of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

In this study, the deproteinization and structural characterization of the polysaccharides extracted from Dendrobium officinale Kimura et Migo grown in Huoshan county of Anhui province were investigated. Three protein removal methods：the Sevage method, enzymatic hydrolysis and their combination were comparatively evaluated in terms of protein removal and polysaccharide loss rates. The combined method was found to have the highest deproteinization efficiency, yielding 81.58% protein removal and 15.63% polysaccharide loss. After purification of the polysaccharides by successive DEAE-cellulose-52 and Sephadex G-100 column chromatography, an active fraction named as DOPA-1 was obtained. By using UV spectroscopy and high performance liquid chromatography (HPLC), the polysaccharide DOPA-1 was confirmed to be homogeneous. Moreover, DOPA-1 was mainly composed of mannose, glucose and galactose as revealed by GC analysis, with a molar ratio of 1：0.42：0.27. IR spectroscopy and Cango red test indicated that DOPA-1 contained β-D-mannopyranose and possessed a triple-helix conformation.

Dendrobium off i cinale polysaccharide; removal of protein; purification; structural analysis

10.7506/spkx1002-6630-201712025

R284.1

A

1002-6630（2017）12-0164-07

王琳煒, 歐陽臻, 張碧娟, 等. 霍山鐵皮石斛多糖的脫蛋白工藝及結構分析[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 164-170.

10.7506/spkx1002-6630-201712025. http：//www.spkx.net.cn

WANG Linwei, OUYANG Zhen, ZHANG Bijuan, et al. Deproteinization and structural analysis of polysaccharides from Dendrobium off i cinale Kimura et Migo grown in Huoshan[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 164-170. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712025. http：//www.spkx.net.cn

2016-07-24

國家自然科學基金面上項目（81573529；81072985；81373480）；中央本級重大增減支項目（2060302）；安徽省石斛產業(yè)化開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新項目；江蘇大學第14批大學生科研立項項目（14A134）

王琳煒（1992—），女，碩士研究生，主要從事中藥活性成分研究。E-mail：pplynette@163.com

*通信作者：歐陽臻（1964—），女，教授，博士，主要從事藥食兩用資源及中藥新藥開發(fā)。E-mail：zhenouyang@ujs.edu.cn