徐曉丹，潘 宇，柯尊麗，周志欽,2,*

（1.西南大學園藝園林學院，重 慶 400716；2.中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所，農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

高糖脅迫下槲皮素對釀酒酵母胞內(nèi)損傷的保護作用與機制

徐曉丹1，潘 宇1，柯尊麗1，周志欽1,2,*

（1.西南大學園藝園林學院，重 慶 400716；2.中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所，農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

以釀酒酵母S288c為模型，分析高糖 脅迫下槲皮素對其胞內(nèi)損傷的保護作用及機制。結(jié)果表明：與對照相比，高糖脅迫不影響酵母胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，但顯著降低了胞內(nèi)酶比活力（P＜0.05）；槲皮素處理后，與對照組和高糖組相比，釀酒酵母胞內(nèi)ROS水平、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力均顯著下降（P＜0.05），而過氧化物酶（peroxi dase，POD）比活力極顯著升高（P＜0.01），說明POD比活力對高糖耐受性反應(yīng)更為靈敏，可作為衡量高糖脅迫應(yīng)激機制的重要生理指標，槲皮素可通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)POD比活力來提高機體的抗氧化能力。另外，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)結(jié)果表明高質(zhì)量濃度葡萄糖顯著抑制了酵母中GPD2和SUC2的表達水平（P＜0.05），并極顯著提高了HXT1的表達水平（P＜0.01），而對GUT1的表 達影響不顯著；槲皮素處理后，高糖脅迫下酵母中GPD2、SUC2和HXT1的表達 水平顯著提高（P＜0.05），而GUT1無顯著變化，說明槲皮素可能通過高滲透甘油途徑、菊糖水解途徑和己糖轉(zhuǎn)運途徑等來促進葡萄糖的分 解代謝，從而達到保護機體細胞免受傷害的作用。結(jié)果表明槲皮素對高糖誘導的釀酒酵母胞內(nèi)損傷具有保護作用，其作用機制可能與自身的抗氧化作用以及利用調(diào)節(jié)機體內(nèi)高滲透甘油途徑與糖的分解和轉(zhuǎn)運途徑存在一定的關(guān)聯(lián)性。

釀酒酵母；高糖脅迫；槲皮素；酶比活力；基因表達水平

在發(fā)酵與釀造業(yè)中，高糖發(fā)酵具有節(jié)省能源，提高酒精產(chǎn)量，降低成本等優(yōu)點，而釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其耐高滲特性而被廣泛應(yīng)用[1]。然而，在高糖脅迫下，細胞內(nèi)也會產(chǎn)生過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）等有害物質(zhì)，促使線粒體產(chǎn)生超氧化物并激活一氧化氮合酶，形成過氧亞硝基，致使機體進一步被氧化而受損傷[1]。在生物體內(nèi)，過量的ROS、氮化物等氧化物會對生物體產(chǎn)生不同程度的傷害，造成細胞損傷，甚至凋亡。目前，關(guān)于氧化應(yīng)激反應(yīng)在釀酒酵母中已有很多相關(guān)報道，但普遍認為超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是重要的ROS清除劑，對維持生物體內(nèi)ROS的動態(tài)平衡起重要作用[2]；另外，提高SOD和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性可顯著提高其對逆境的耐受能力[3]。除此之外，研究認為過氧化物酶（peroxidase，POD）與高糖耐受力也緊密關(guān)聯(lián)[3]，但具體的分子作用機制尚不清楚。

槲皮素（3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮）是一種抗氧化能力較強的黃酮醇類物質(zhì)，在蔬菜、水果等食物中普遍存在，具有抗氧化、降脂及減少機體損傷等生物學功能，在清除自由基[4]、抗血小板聚集[5]、抗肥胖和延長壽命[6]、抗炎[7]等方面發(fā)揮至關(guān)重要作用。此外，在人類系膜細胞模型中，槲皮素能顯著抑制高糖脅迫下ROS-NF-κB的信號途徑，從而保護機體細胞免受傷害[8]；其超強的抗氧化特性也能顯著抑制高糖脅迫下細胞的凋亡[9]。但在釀酒酵母模型中，高糖脅迫下槲皮素作為抗氧化劑對細胞保護作用的機理還尚不明確。因此，本研究以釀酒酵母S288c為模型，分析了高葡萄糖脅迫下槲皮素對相關(guān)抗氧化酶活性的影響及其葡萄糖代謝途徑中關(guān)鍵酶基因表達的差異，從細胞和分子水平上對槲皮素在高糖脅迫處理后胞內(nèi)抗氧化酶生理特性的變化及分子作用機制進行了初步分析，為今后槲皮素等天然抗氧化黃酮類化合物的開發(fā)及其應(yīng)用提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

釀酒酵母S288c由廣東省微生物菌種保藏中心所提供。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L，121 ℃高壓滅菌15 min。

YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L。

高糖培養(yǎng)基：以YPD液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加葡萄糖至40、80、100 g/L，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.2 試劑

槲皮素（純度≥98%） 寶雞浩翔生物技術(shù)有限公司；ROS檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNAiso Plus（Total RNA）提取試劑盒寶生物工程有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；瓊脂粉、考馬斯亮藍G-250、葡萄糖、鉬酸銨、鄰苯三酚（焦性沒食子酸）、愈創(chuàng)木酚均為國產(chǎn)分析純試劑。

300 μmol/L槲皮素：稱取0.151 g槲皮素粉末溶解于1 000 μL DMSO中，得500 μmol/L槲皮素，取300 μL的500 μmol/L槲皮素用DMSO定容至500 μL。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計 德國Eppendorf公司；Varioskan Flash全波長掃描式多功能酶標儀 美國Thermo公司；CFX96實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母菌株活化與培養(yǎng)處理

將保存的菌種接種于YPD固體培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600nm為1.0。將酵母細胞按1∶100（V/V）的接種量再接種于事先加入0.1%槲皮素或100 g/L葡萄糖處理的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)，槲皮素作用8 h后的釀酒酵母細胞用于后續(xù)實驗中各指標的測定。實驗分4 個處理組，即對照組、高糖組（培養(yǎng)基葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L）、對照組＋300 μmol/L槲皮素、高糖組＋300 μmol/L槲皮素。

1.3.2 釀酒酵母生長曲線的測定

表1 釀酒酵母S288c不同稀釋倍數(shù)OD600 nm值計算回歸方程Table1 Regression equations for OD600of Saccharomyces cerevisiae S288c at different dilution factors

將接入1∶100（V/V）接種量接入YPD培養(yǎng)基開始計為0 h，以未接種的YPD液體培養(yǎng)基將紫外-可見分光光度計校正為零點，在波長600 nm處分別測定培養(yǎng)0、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24 h的酵母細胞懸液的OD600nm值，每份樣品測定3 次計算平均值。當菌懸液菌體濃度過高時，為保證結(jié)果可靠性，對其進行稀釋，控制OD600nm值介于0.1～0.8之間[10]，按照每個稀釋梯度對應(yīng)的回歸方程計算獲得OD600nm實際值（表1），x為稀釋后OD600nm值，y為OD600nm實際值。以各時間點菌懸液的OD600nm值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制酵母細胞生長曲線。

1.3.3 酵母胞內(nèi)ROS水平測定

釀酒酵母胞內(nèi)R O S水平采用2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichloro-dihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）法進行測定。用未接種酵母細胞的YPD培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA終濃度為10 μmol/L，細胞數(shù)量控制在1×106個/mL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃避光孵育20 min。孵育完成后用800 μL 磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）洗滌3 次，充分去除附著于細胞表面的DCFH-DA，收集 并重懸細胞，酶標儀在激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm，檢測各組細胞內(nèi)的熒光強度。

1.3.4 蛋白質(zhì)量濃度測定

采用Bradford法測定樣品中蛋白質(zhì)量濃度，用595 nm波長條件下校正的牛血清白蛋白為標準樣[11]。

1.3.5 酵母細胞內(nèi)酶比活力測定

取20 mL酵母細胞懸液（OD600nm為0.1）8 000×g離心5 min，收集酵母細胞并破碎，再10 000×g離心20 min，收集上清液即為粗提酶液，分別用于后續(xù)相關(guān)指標的測定，3 次重復。酶的比活力以每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力表示。

SOD活力采用鄰苯三酚自氧化法測定，具體步驟參照許雅娟等[12]方法，在波長325 nm處每隔0.5 min測定一次OD值，共測定4 min，計算出OD值變化速率。每分鐘反應(yīng)液中SOD抑制50%反應(yīng)速率時即為1 個SOD活力單位（U）。

CAT活力測定參照程魯京等[13]方法，采用鉬酸銨比色法測定，在波長410 nm處測定OD值并計算酶活力，以每分鐘分解1 μmol過氧化氫為1 個酶活力單位（U）。

POD活力 參照劉艷[14]采用的愈創(chuàng)木酚法進行測定，記錄在波長470 nm處每分鐘內(nèi)的OD變化值，以每分鐘OD值變化0.01為1 個酶活力單位（U）。

1.3.6 酵母中糖代謝基因的表達量差異分析

采用RNAiso Plus試劑盒提取酵母細胞的總RNA。各取1 μg總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

采用qRT-PCR方法分別對4 種不同條件處理的釀酒酵母細胞中GPD2、GUT2、SUC2和HXT1基因表達量的變化進行了檢測，擴增反應(yīng)體系含2 μL（約100 ng）模板cDNA，0.5 μL上下游引物（10 μmol/L），5 μL SYBR Green熒光染料，加ddH2O至10 μL。在qRTPCR儀進行擴增反應(yīng)，條件為95 ℃預變性3 min，40 個循環(huán)，95 ℃變性10 s，退火30 s（退火溫度根據(jù)引物確定，表2），65 ℃延伸5 s。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)內(nèi)參基因ACT1計算目的基因的相對表達量，采用3 次生物學重復和3 次技術(shù)重復，數(shù)據(jù)通過SPSS13.0軟件分析并進行t檢驗。

表2 qRT-PCR目的基因及引物序列Table2 Primers for target genes used for qRT-PCR in this study

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 高糖脅迫對釀酒酵母生長的影響

圖1 不同葡萄糖質(zhì)量濃度處理下的釀酒酵母S288c生長曲線Fig.1 Growth curve of S. cerevisiae S288c at different glucose concentrations

微生物生長歷程一般分為延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4 個時期。圖1結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度葡萄糖處理的釀酒酵母主要經(jīng)歷了前3 個生長階段，0～8 h為延滯期，在低糖質(zhì)量濃度（20、40、80 g/L）條件下8～16 h為對數(shù)期，16 h后趨于穩(wěn)定，而葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L時，8～18 h為對數(shù)期，說明葡萄糖質(zhì)量濃度對酵母生長的延滯期影響較小，當葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L時，酵母生 長的對數(shù)期延長，即進入穩(wěn)定期的時間滯后，認為對酵母生長產(chǎn)生了高糖脅迫。因此，本研究以槲皮素作用8 h后的酵母細胞懸液（即釀酒酵母生長的對數(shù)期起始期）為不同實驗處理起始臨界點，高糖脅迫的葡萄糖質(zhì)量濃度設(shè)為100 g/L。

2.2 槲皮素對釀酒酵母胞內(nèi)ROS水平的影響

圖2 高糖脅迫下槲皮素對釀酒酵母S288c胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.2 Effects of quercetin on intracellular ROS levels of S. cerevisiae S288c under high glucose-induced stress

ROS具有很強的氧化活性，過量積累易造成細胞結(jié)構(gòu)的損傷，影響其正常的生理活性。槲皮素具有較強的抗氧化及自由基清除能力，且濃度為300 μmol/L時對釀酒酵母的保護作用最佳[4]。因此，本研究將在高糖脅迫條件下保護劑的槲皮素濃度設(shè)為300 μmol/L。圖2結(jié)果顯示，對照組與高糖組中胞內(nèi)ROS水平基本保持一致，無顯著差異（P＞0.05），而槲皮素處理后，對照組中胞內(nèi)ROS水平下降了12.88%（P＜0.05），而在高糖組中下降37.47%（P＜0.01），達到差異極顯著水平，說明在進入對數(shù)期之前，盡管高糖脅迫處理對胞內(nèi)ROS水平無顯著作用，卻能顯著降低尤其是高糖脅迫下胞內(nèi)ROS水平。因此，研究結(jié)果表明槲皮素具有很好的自由基清除能力，能顯著降低胞內(nèi)ROS水平，從而保護釀酒酵母免受自由基的損傷，維持機體正常生長。

2.3 槲皮素對釀酒酵母胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響

圖3 高糖脅迫下槲皮素對釀酒酵母S288c胞內(nèi)SOD比活力的影響Fig.3 Effects of quercetin on intracellular superoxide dismutase activity of S. cerevisiae S288c under high glucose-induced stress

圖4 高糖脅迫下槲皮素對釀酒酵母S288c胞內(nèi)CAT比活力的影響Fig.4 Effects of quercetin on intracellular catalase activity of S. cerevisiae S288c under high glucose-induced stress

在逆境條件下，SOD、CAT和POD通常是細胞抵御ROS傷害的重要保護酶，能及時清除氧自由基、過氧化氫、羥自由基等，從而保護機體免受傷害[15]。在高糖脅迫處理后，釀酒酵母胞內(nèi)SOD和CAT比活力變化趨勢比較一致，均明顯低于對照，下降率高達48.59%和43.41%，達到極顯著水平（P＜0.01）（圖3、4）。然而，槲皮素處理后，對照組與高糖組中SOD和CAT比活力仍然表現(xiàn)為明顯的下降趨勢，在對照組中SOD與CAT比活力下降率分別達到18.11%（P＜0.05）和32.43%（P＜0.01），在高糖組中，SOD與CAT比活力分別下降了75.89%（P＜ 0.01）和41.58%（P＜0.01），說明在一定濃度范圍內(nèi)的高糖脅迫及槲皮素能顯著降低釀酒酵母胞內(nèi)SOD與CAT比活力。

圖5 高糖脅迫下槲皮素對釀酒酵母S288c胞內(nèi)POD比活力的影響Fig.5 Effects of quercetin on intracellular peroxidase activity of S. cerevisiae S288c under high glucose-induced stress

然而與對照相比，高糖脅迫處理后，POD比活力降低了44.82%，達到顯著差異水平（P＜0.05），但在槲皮素處理后，對照組與高糖組中POD比活力分別上升了106.71%和198.49%，達到極顯著差異水平（P＜0.01）（圖5），說明槲皮素可通過調(diào)節(jié)POD比活力來響應(yīng)高糖脅迫的抗 氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而顯著提高機體的抗氧化能力。

2.4 釀酒酵母中GPD2、GUT1、SUC2和HXT1表達量的變化

圖6 高糖脅迫下槲皮素對釀酒酵母S288c中GPD2 GUT1 SUC2 HXT1基因表達的影響Fig.6 Effects of quercetin on the expression profiles of GPD2, GUT1, SUC2 and HXT1 in S. cerevisiae S288c under high glucose-induced stress

圖6結(jié)果顯示，與對照相比，槲皮素處理后的酵母中GPD2、GUT1、SUC2和HXT1的相對表達量均無顯著變化（P＞0.05），說明在正常培養(yǎng)條件下，槲皮素對酵母中相關(guān)基因的相對表達量影響較小。在高糖脅迫處理后，釀酒酵母S288c中GPD2和SUC2相對表達量顯著下調(diào)（P＜0.05），分別比對照降低了45.30%和51.30%（圖6），而HXT1表現(xiàn)為極顯著上調(diào)表達（P＜0.01），相對表達量比對照增加了7.54 倍，GUT1相對表達量卻無顯著變化（P＞0.05）；同時在槲皮素處理后，釀酒酵母S288c中GPD2、SUC2和HXT1的相對表達量均顯著升高（P＜0.05），相對表達量分別比高糖組增加了39.50%、1.40倍和38.30%，但GUT1的相對表達量始終無顯著變化（P＞0.05）。本研究結(jié)果表明高質(zhì)量濃度葡萄糖能顯著抑制GPD2和SUC2的表達，誘導HXT1的表達；同時，槲皮素可顯著提高釀酒酵母S288c中GPD2、SUC2和HXT1的表達水平，從而促進酵母體內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運代謝和分解利用。

3 討 論

黃酮類化合物是一類重要的天然有機化合物，是植物在長期自然選擇過程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，它能清除生物體內(nèi)的自由基，具有抗氧化作用而被廣泛關(guān)注[16]。其中，槲皮素被認為是類黃酮物質(zhì)中最重要的一種天然抗氧化劑，屬于多羥基黃酮醇類化合物，廣泛存在于各種蔬菜、水果及中草藥中，其藥理作用主要表現(xiàn)在其抗氧化與自由基清除能力、抗炎、抗病毒等方面[5]。而在生物體中，抗氧化酶系統(tǒng)是有效清除ROS、維持細胞正常生理功能的第一道屏障，包括SOD、CAT和POD等保護酶系統(tǒng)均在清除自由基、過氧化氫和過氧化物及降低自由基的形成等方面發(fā)揮至關(guān)重要作用[17]。釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，其氧化應(yīng)激反應(yīng)的抗脅迫機制與多種代謝途徑相關(guān)，涉及眾多基因的參與調(diào)控[18]。當機體受到高滲脅迫時，細胞內(nèi)的氧化還原平衡系統(tǒng)被破壞，ROS、氮化物等內(nèi)源性氧化物大量積累從而對細胞形成傷害[3]。釀酒酵母在高鹽、高糖、高乙醇和氧化劑等脅迫后，胞內(nèi)ROS水平、SOD、CAT及POD比活力顯著提高[19]，說明這些抗氧化物酶活性物質(zhì)對維持有機體胞內(nèi)正常滲透壓起到關(guān)鍵作用。本研究以釀酒酵母S288c為模型，在葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L時，酵母生長曲線的對數(shù)期延長，說明對酵母的生長形成了高糖脅迫，且細胞內(nèi)的SOD、CAT和POD比活力卻受到顯著抑制，而胞內(nèi)的ROS水平差異不顯著；在槲皮素處理之后，釀酒酵母胞內(nèi)ROS水平降低，且SOD與CAT比活力受到抑制更加明顯，但極顯著提高了POD比活力。本研究結(jié)果顯示高質(zhì)量濃度（100 g/L）葡萄糖和槲皮素處理僅顯著提高了POD比活力，對ROS水平、SOD和CAT比活力起到抑制作用，說明并未激活釀酒酵母胞內(nèi)所有的抗氧化系統(tǒng)應(yīng)激機制，釀酒酵母中POD的調(diào)節(jié)機制與ROS、SOD、CAT可能不同。另外，本研究結(jié)果說明過氧化物酶活性對高糖耐受性更為靈敏，可作為衡量篩選及鑒定高糖脅迫應(yīng)激機制的重要生理指標，而槲皮素主要作用在于通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)過氧化物酶活性來提高機體的抗氧化能力。

在釀酒酵母中，葡萄糖可作為碳源，來維持其正常生長代謝，主要參與了甘油與乙醇合成的糖代謝過程。研究認為，在酵母中甘油的合成主要受胞內(nèi)高滲透甘油（high osmolarity glycerol，HOG）信號途徑中編碼3-磷酸甘油脫氫酶的GPD1、GPD2及甘油分解代謝途徑中編碼甘油激酶和FAD+-3-磷酸甘油脫氫酶的甘油利用的GUT1和GUT2的調(diào)控。GPD2在氧化還原代謝中起著至關(guān)重要的作用，GPD2過表達會提高細胞質(zhì)中NADH的氧化還原[20]。GUT1在發(fā)酵碳源（葡萄糖）和非發(fā)酵碳源（甘油、乙醇等）表達完全不同，在葡萄糖存在的條件下GUT1會受到抑制作用[21]。與GUT1相類似，一些基因的表達也會受到葡萄糖的影響而被抑制，主要包括GAL、SUC2、MAL和STA等基因[22]，其中，SUC2被認為是編碼蔗糖轉(zhuǎn)化酶的重要基因，SUC2的過表達可促進菊糖水解途徑中菊糖的水解與乙醇的合成，因此被認為是分析葡萄糖抑制機理的一種理想基因分析模型[23]。另外，在糖代謝過程中，葡萄糖主要通過己糖代謝途徑被釀酒酵母細胞吸收和利用，而HXT1是該途徑中負責葡萄糖轉(zhuǎn)運的重要基因，屬于HXT基因家族。目前，已有20多個HXT家族基因被成功克隆并完成功能鑒定[24]。當HXT1表達上調(diào)時，釀酒酵母對葡萄糖的攝入利用加快，最終提高乙醇或乳酸的合成[25]。本研究結(jié)果表明，在高質(zhì)量濃度葡萄糖下，GPD2和SUC2的表達受到顯著抑制（P＜0.05），說明高糖脅迫處理顯著影響了酵母細胞內(nèi)的HOG途徑與菊糖水解途徑，使甘油和乙醇形成受阻，導致機體內(nèi)代謝失去平衡；同時，HXT1的表達水平顯著提高，說明高糖脅迫可能會誘導己糖代謝途徑的發(fā)生。在槲皮素處理后，GPD2和SUC2的表達水平顯著提高（P＜0.05），說明在高糖脅迫下，槲皮素在一定程度上緩解了高葡萄糖對HOG途徑的抑制作用，促進了甘油的合成，同時槲皮素顯著提高了葡萄糖的轉(zhuǎn)運，使機體內(nèi)菊糖的分解代謝加快，從而維持細胞正常的生長代謝；另外，槲皮素極顯著提高HXT1的表達水平，說明己糖代謝途徑可能是釀酒酵母攝取外源葡萄糖的重要代謝途徑，槲皮素通過促進機體對葡萄糖的吸收利用，進而維持機體內(nèi)與外界葡萄糖質(zhì)量濃度的平衡，保護細胞免受傷害。

因此，本研究以釀酒酵母S288c為分析模型，發(fā)現(xiàn)高糖脅迫與槲皮素處理后，釀酒酵母胞內(nèi)ROS水平、SOD和CAT比活力顯著降低，POD比活力顯著升高，說明POD比活力對高糖耐受性及槲皮素處理后的反應(yīng)更為靈敏，可作為衡量高糖脅迫應(yīng)激機制的重要生理指標；另外，在高糖脅迫后，槲皮素顯著提高了GPD2、SUC2和HXT1的表達水平，說明槲皮素可以通過調(diào)控釀酒酵母中HOG途徑、菊糖水解途徑和己糖轉(zhuǎn)運途徑來響應(yīng)高糖脅迫處理，從而保護釀酒酵母免受自由基的損傷、修復抗氧化系統(tǒng)和促進機體內(nèi)的代謝平衡。本研究結(jié)果為槲皮素等天然抗氧化黃酮類化合物的開發(fā)及其對酵母體內(nèi)高滲機理的分子機制研究提供一定的理論依據(jù)。

[1] NOTI O, VAUDANO E, PESSIONE E, et al. Short-term response of different Saccharomyces cerevisiae strains to hyperosmotic stress caused by inoculation in grape must： RT-qPCR study and metabolite analysis[J]. Food Microbiology, 2015, 52： 49-58. DOI：10.1016/ j.fm.2015.06.0 11.

[2] 馮宇, 徐滕洋, 蔡瑾, 等. 蛋白酶A敲除對釀酒酵母抗氧化性的影響[J].中國食品學報, 2013, 13(2)： 13-18.

[3] 熊雅蘭, 晏偉, 張穗生, 等. 釀酒酵母呼吸突變株的高糖脅迫反應(yīng)研究[J]. 廣西科學, 2014, 21(1)： 34-41.

[4] VILA A R, MENDES V, MENDES M V, et al. Quercetin protects Saccharomyces cerevisiae against oxidative stress by inducing trehalose biosynthesis and the cell wall integrity pathway[J]. PLoS ONE, 2012, 7(9)： e45494. DOI：10.1371/journal.pone.0045494.

[5] 孫涓, 余世春. 槲皮素的研究進展[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐, 2011, 25(3)： 85-88. DOI：10.3969/j.issn.1004-2407.2006.06.027.

[6] BELINHA I, AMORIM M A, RODRIGUES P, et al. Quercetin increases oxidative stress resistance and longevity in Saccharomyces cerevisiae[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(6)：2446-2451. DOI：10.1021/jf063302e.

[7] 蔡夏夏, 鮑雷, 丁葉, 等. 槲皮素對葡萄糖胺條件下血管內(nèi)皮細胞損傷的影響[J]. 食品科學, 2013, 34(13)： 224-228. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201313047.

[8] CHEN P, SHI Q, XU X, et al. Quercetin suppresses NF-κB and MCP-1 expression in a high glucose-induced human mesangial cell proliferation model[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2012, 30(1)： 119-125. DOI：10.3892/ijmm.2012.955.

[9] QU L, LIANG X, GU B, et al. Quercetin alleviates high glucose-induced Schwann cell damage by autophagy[J]. Neural Regeneration Research, 2014, 9(12)： 1195. DOI：10.4103/1673-5374.135328.

[10] 郭春葉, 龔月生, 劉林麗, 等. 酵母菌生長曲線的測定及其轉(zhuǎn)葡萄芪合酶基因重組菌遺傳穩(wěn)定性的檢測[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2007, 35(7)：190 9-1910. DOI：10.3969/j.issn.0517-6611.2007.07.014.

[11] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1/2)： 248-254. DOI：10.1016/0003-2697(76)90527-3.

[12] 許雅娟, 趙艷景, 胡虹. 鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性的研究[J]. 西南民族大學學報(自然科學版), 2008(6)： 1207-1209. DOI：10.3969/j.issn.1003-2843.2006.06.034.

[13] 程魯京, 孟澤. 鉬酸銨顯色法測定血清過氧化氫酶[J]. 臨床檢驗雜志, 1994, 12(1)： 6-8.

[14] 劉艷. 機械傷害誘導豌豆幼苗防御性反應(yīng)及其調(diào)控機制[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學, 2005： 15-16. DOI：10.7666/d.y773580.

[15] LETELIER M E, LEPE A M, FA NDEZ M, et al. Possible mechanisms underlying copper-induced damage in biological membranes leading to cellular toxicity[J]. Chemico-Biological Iinteractions, 2005, 151(2)： 71-82. DOI：10.1016/j.cbi.2004.12.004.

[16] 延璽, 劉會青, 鄒永青, 等. 黃酮類化合物生理活性及合成研究進展[J]. 有機化學, 2008, 28(9)： 1534-1544. DOI：10.3969/ j.issn.1673-1328.2011.20.030.

[17] FRIDOVICH I. Superoxide dismutases[J]. Annual Review of Bio chemistry, 1975, 44(1)： 147-159. DOI：10.1146/annurev. bi.44.070175.001051.

[18] P REZ-TORRADO R, BRUNO-BRCENA J M, MATALLANA E. Monitoring stress-r elated genes during the process of biomass propagation of Saccharomyces cerevisiae strains used for wine making[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(11)：6831-6837. DOI：10.1128/AEM.71.11.6831-6837.2005.

[19] 杜春迎, 趙輝, 趙志昌, 等. 發(fā)酵工業(yè)中釀酒酵母耐性機制的研究進展[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(13)： 378-382.

[20] KNUDSEN J D, CARLQUIST M, GORWAGRAUSLUND M. NADH-dependent biosensor in Saccharomyces cerevisiae： principle and validation at the single cell level[J]. AMB Express, 2014, 4(1)： 81. DOI：10.1186/s13568-014-0081-4.

[21] GRAUSLUND M, LOPES J M, RNNOW B. Expression of GUT1, which encodes glycerol kinase in Saccharomyces cerevisiae, is controlled by the positive regulators Adr1p, Ino2p and Ino4p and the negative regulator Opi1p in a carbon source-dependent fashion[J]. Nucleic Acids Research, 1999, 27(22)： 4391-4398. DOI：10.1093/nar/27.22.4391.

[22] ZHOU H, WINSTON F. NRG1 is required for glucose repression of the SUC2 and GAL genes of Saccharomyces cerevisiae[J]. BMC Genetics, 2001, 2(1)： 5. DOI：10.1186/1471-2156-2-5.

[23] GANCEDO J M, FLORES C L, GANCEDO C. The repressor Rgt1 and the cAMP-dependent protein kinases control the expression of the SUC2 gene in Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochimica et Biophysica Acta-General Subjects, 2015, 1850(7)： 1362-1367. DOI：10.1016/ j.bbagen.2015.03.006.

[24] ?ZCAN S, JOHNSTON M. Function and regulation of yeast hexose transporters[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1999, 63(3)： 554-569.

[25] ROSSI G, SAUER M, PORRO D, et al. Effect of HXT1 and HXT7 hexose transporter overexpression on wild-type and lactic acid producing Saccharomyces cerevisiae cells[J]. Microbial Cell Factories, 2010, 9(1)： 1. DOI：10.1186/1475-2859-9-15.

Protective Effect and Mechanism of Quercetin against High Glucose-Induced Intracellular Damage in Saccharomyces cerevisiae

XU Xiaodan1, PAN Yu1, KE Zunli1, ZHOU Zhiqin1,2,*
(1. College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Citrus Products (Chongqing), Ministry of Agriculture, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400715, China)

In this study, the protective effect of quercetin on high glucose-induced damage was investigated in Saccharomyces cerevisiae. Compared with the control group, the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and peroxidase (POD) were all significantly decreased under high glucose-induced stress (P ＜ 0.05), but intracellular ROS was no obviously changed. After being treated with quercetin, the ROS levels and SOD and CAT activities were dramatically inhibited (P ＜ 0.05), but the POD activity was significantly enhanced in comparison to the control and high glucose groups (P ＜ 0.01). The results showed that POD activity was more sensitive than other indicators in reflecting the resistance to high glucose-induced stress, and quercetin could effectively enhance the antioxidant capacity by regulating POD activity in S. cerevisiae S288c. In addition, high glucose-induced stress resulted in an significant decrease in the expression levels of glycerol-3-phosphate dehydrogenase2 (GPD2) and sucrose transport protein-encoding genes (SUC2) (P ＜ 0.05), but a significant increase in the expression level of hexose transport-1-encoding gene (HXT1) (P ＜ 0.01), compared with the control. After being treated with quercetin, the expression profiles of GPD2, SUC2, and HXT1 were significantly increased in S. cerevisiae S288c (P ＜ 0.05). However, the expression level of glycerol kinase gene (GUT1) was not changed significantly. These results suggested that quercetin could reduce highglucose-induced damage by regulating the high osmolarity glycerol (HOG) signaling pathway, inulin catabolism pathway and hexose transport pathway to accelerate glucose decomposition. Therefore, we conclude that quercetin plays an important role in protecting S. cerevisiae from damage caused by high glucose-induced stress, and the underlying mechanism may be associated with its antioxidant effect and being involved in the HOG signaling pathway and the glucose decomposition and transport pathways in S. cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae; high glucose-induced stress; quercetin; enzyme activitity; expression levels

10.7506/spkx1002-6630-201712010

TS201.4

A

1002-6630（2017）12-0063-06

2016-09-13

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目（cstc2014jcyjA80026）；2016食用農(nóng)產(chǎn)品特征性營養(yǎng)組成識別與驗證評估專項項目（GJFP201601501；GJFP201601503）；重慶市現(xiàn)代特色效益農(nóng)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新項目（20164-4）

徐曉丹（1990—），女，碩士研究生，研究方向為果品營養(yǎng)與質(zhì)量安全。E-mail：xuxiaodanxdd@163.com

*通信作者：周志欽（1964—），男，教授，博士，研究方向為果品營養(yǎng)與質(zhì)量安全。E-mail：zzqswu@yahoo.com

徐曉丹, 潘宇, 柯尊麗, 等. 高糖脅迫下槲皮素對釀酒酵母胞內(nèi)損傷的保護作用與機制[J]. 食品科學, 2017, 38(12)：63-68.

10.7506/spkx1002-6630-201712010. http：//www.spkx.net.cn

XU Xiaodan, PAN Yu, KE Zunli, et al. Protective effect and mechanism of quercetin against high glucose-induced intracellular damage in Saccharomyces cerevisiae[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 63-68. (in Chinese wit h English abstract) DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201712010. http：//www.spkx.net.cn