廖曉燕+梁淑彩+劉羽萍+張靜雅+鄢國(guó)平

摘 要 將N氨基4N甲基哌嗪1，8萘酰亞胺（AMN）通過(guò)酰胺化反應(yīng)接枝到聚丙烯酸鏈上，利用生成的聚合物在水溶液中的自組裝， 制備了一種水溶性熒光納米粒子（PAAMN）。采用紫外可見(jiàn)光譜、核磁共振氫譜、透射電鏡、動(dòng)態(tài)光散射和熒光光譜方法對(duì)PAAMN進(jìn)行了表征，MTT法檢測(cè)其細(xì)胞相容性，最后用熒光顯微鏡觀(guān)察其自身熒光及細(xì)胞成像效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， PAAMN為球狀結(jié)構(gòu)，萘酰亞胺熒光團(tuán)的摩爾取代度為4.1%； 在生理pH條件下，以390 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，PAAMN在534 nm處發(fā)射較強(qiáng)的熒光，且光穩(wěn)定性較好； 在pH 4.0～10.0范圍內(nèi)，其熒光波長(zhǎng)無(wú)明顯變化，熒光強(qiáng)度隨pH值增大而逐漸減小，但pH敏感程度小于AMN。PAAMN具有良好的細(xì)胞相容性，能進(jìn)入細(xì)胞，且在～390 nm激發(fā)光下發(fā)射綠色熒光，可用于細(xì)胞成像。

關(guān)鍵詞 熒光納米粒子； 聚丙烯酸； 萘酰亞胺； 自組裝； 細(xì)胞成像

1 引 言

熒光納米粒子是一類(lèi)重要的納米功能材料，在細(xì)胞成像、疾病診斷及生物傳感等領(lǐng)域有廣闊的發(fā)展前景[1，2]，而具有良好水溶性、光穩(wěn)定性及低毒性是其在這些領(lǐng)域中應(yīng)用的前提。目前，基于無(wú)機(jī)材料的熒光納米粒子研究較為廣泛，如無(wú)機(jī)半導(dǎo)體量子點(diǎn)[3]、碳量子點(diǎn)[4]和金納米粒子[5]等，這些納米粒子常需要通過(guò)表面修飾或者聚合物包覆來(lái)提高其水溶性、可修飾性、生物相容性等特性。相對(duì)于無(wú)機(jī)熒光納米粒子，有機(jī)聚合物熒光納米粒子在結(jié)構(gòu)多樣性和功能可設(shè)計(jì)性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)引起了研究者的興趣[6～10]。聚合物納米粒子中熒光團(tuán)的存在形式主要有兩種[11，12]： 一種是非共價(jià)結(jié)合，如在納米粒子制備過(guò)程中或者制備完成后，通過(guò)包埋或吸附方法負(fù)載熒光團(tuán)； 另外一種是共價(jià)鍵合，如通過(guò)表面修飾方式將熒光團(tuán)鍵合到無(wú)熒光的納米粒子上，或先制備熒光聚合物單體，再聚合形成納米粒子。利用生物相容性?xún)捎H聚合物的自組裝對(duì)熒光團(tuán)進(jìn)行包裹是制備熒光聚合物納米粒子的常用方法[11，13，14]，該方法簡(jiǎn)單，得到的納米粒子水分散性及生物相容性良好，但由于熒光團(tuán)以非共價(jià)方式結(jié)合，在使用過(guò)程中容易泄露。采用先將熒光團(tuán)與聚合物共價(jià)結(jié)合再進(jìn)行自組裝的方法可以減少或避免染料泄露問(wèn)題，有效提高熒光納米粒子的穩(wěn)定性，目前該類(lèi)水溶性熒光納米粒子的研究報(bào)道較少[15～17]。

聚丙烯酸（PAA）是一種常用高分子材料，在化工、紡織、水處理、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[18，19]。由于PAA無(wú)毒、易溶于水，且富含可功能化的羧基，近年來(lái)被研究者用于無(wú)機(jī)納米粒子的修飾制備有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)合納米材料[20，21]、與共價(jià)聚合物進(jìn)行自組裝制備水溶性熒光納米粒子[22]、作為兩親聚合物的親水鏈段制備納米膠束[23]、進(jìn)行交聯(lián)制備納米凝膠[24]等研究。本研究采用1，8萘酰亞胺熒光化合物N氨基4N甲基哌嗪1，8萘酰亞胺（AMN）對(duì)PAA進(jìn)行接枝改性，制備了兩親性的熒光聚合物，并利用該聚合物在水溶液中的自組裝得到了一種新的熒光納米粒子（PAAMN）； 對(duì)其形態(tài)、結(jié)構(gòu)及熒光特性進(jìn)行了表征，并考察了其細(xì)胞毒性及細(xì)胞成像能力。結(jié)果表明，此納米粒子具有好的水溶性、光穩(wěn)定性和細(xì)胞相容性，可進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)射綠色熒光，在細(xì)胞成像方面有良好應(yīng)用前景。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Bruker AV400型核磁共振儀（瑞士Bruker公司）； UV2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）； 320S型pH計(jì)（梅特勒托利多儀器有限公司）； F4600型熒光分光光度計(jì)（日本日立高新技術(shù)公司）； JEM100CXII型透射電鏡TEM（日本電子株式會(huì)社）； IX51型倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯株式會(huì)社）； ST360型酶標(biāo)儀（上海科華生物工程股份有限公司）； Zetasizer Nano ZEN3600型動(dòng)態(tài)光散射納米激光粒度儀（英國(guó)Malvern公司）。

AMN的合成見(jiàn)文獻(xiàn)[25]； 聚丙烯酸（PAA， 分子量2.6萬(wàn)，河南凱特化工有限公司）； Gibco胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司）； 3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴鹽（MTT，Sigma公司）； HeLa細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)； 其它試劑均為市售分析純； 實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

2.2 PAAMN的制備

將0.5 g PAA，0.63 g EDAC·HCl和0.79 g NHS溶于10 mL DMF中，在室溫下攪拌反應(yīng)1 h，向其中加入含AMN的DMF溶液，并于60℃攪拌反應(yīng)4 h。將反應(yīng)液離心，上清液放入透析袋中，在pH 3～4的稀HCl中進(jìn)行透析。透析一段時(shí)間后將袋內(nèi)膠狀固體取出，溶解在pH 11的NaOH溶液中，滴加稀HCl使其析出。經(jīng)過(guò)多次堿溶酸沉處理后，將該固體溶解，再于水中透析，測(cè)試透析液熒光強(qiáng)度。當(dāng)透析液熒光強(qiáng)度為零時(shí)，將透析袋內(nèi)溶液取出， 凍干， 得目標(biāo)產(chǎn)物（PAAMN）。

2.3 PAAMN的形態(tài)及結(jié)構(gòu)表征

將納米粒子溶液滴在含有Formar膜的銅網(wǎng)上，并進(jìn)行負(fù)染，采用TEM觀(guān)察其形態(tài)； 采用納米激光粒度儀測(cè)定PAAMN在水溶液中的粒徑； 用DMSOd6+D2O為溶劑測(cè)定PAAMN的1H NMR光譜。

將AMN溶于乙醇中，配成1.0 mg/mL儲(chǔ)備液，再用水稀釋得所需濃度的工作溶液。將PAAMN用水溶解， 配制成2.0 mg/mL儲(chǔ)備溶液，并用水稀釋至所需濃度的工作溶液。分別測(cè)定AMN及PAAMN工作溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜； 在392 nm下測(cè)定不同濃度AMN溶液的吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)PAAMN溶液在392 nm處的吸光度和AMN的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，按文獻(xiàn)[25]的方法計(jì)算納米粒子中熒光團(tuán)的摩爾取代度。

2.4 熒光性質(zhì)研究

熒光光譜及量子產(chǎn)率測(cè)定： 測(cè)定水溶液中PAAMN及AMN的熒光光譜； 以硫酸奎寧為參比，測(cè)定水溶液中PAAMN及AMN的熒光量子產(chǎn)率，硫酸奎寧在0.05 mol/L H2SO4溶液中的量子產(chǎn)率按0.55計(jì)算[26]。

光穩(wěn)定性考察： 以390 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，534 nm為發(fā)射波長(zhǎng)，每隔5 s測(cè)定一次PAAMN溶液的熒光，觀(guān)察2.5 h內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化。

金屬離子對(duì)PAAMN熒光的影響： 分別移取PAAMN的工作溶液0.1 mL和Ph 7.4的磷酸鹽緩沖溶液5.0 mL加入到10.0 mL比色管中，再加入金屬離子； 以不加金屬離子的PAAMN體系作為對(duì)照。各溶液用水定容后測(cè)定熒光光譜，記錄熒光強(qiáng)度。

pH值對(duì)PAAMN熒光的影響： 分別移取PAAMN及AMN的工作溶液0.1 mL加入到10.0 mL比色管中，用不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液定容后測(cè)定熒光光譜，記錄熒光強(qiáng)度。

2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞相容性

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞按每孔5000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM為培養(yǎng)基，在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，吸去板內(nèi)培養(yǎng)基殘液，加入含不同濃度PAAMN 的培養(yǎng)液， 置于培養(yǎng)箱中孵育24 h，此后向每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h。然后移去板內(nèi)液體，每孔加入200 μL DMSO，將細(xì)胞培養(yǎng)板放置搖床上， 低速振蕩使結(jié)晶物充分溶解。 用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度（A）。以未加PAAMN的細(xì)胞作空白對(duì)照，計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖率（Relative growth rate，RGR）： RGR = （A實(shí)驗(yàn)組/A空白對(duì)照組）×100%。

2.6 納米粒子及染色細(xì)胞的熒光顯微成像

納米粒子的熒光觀(guān)察： 將0.1 mg/mL PAAMN溶液用PBS溶液（pH7.4）稀釋10倍，然后取0.1 mL置于24孔培養(yǎng)板中，于熒光顯微鏡下觀(guān)察。

細(xì)胞染色及成像： 將HeLa細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，移去原培養(yǎng)基，加入含0.01 mg/mL PAAMN的新培養(yǎng)基，并置于CO2培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)2 h。然后移除培養(yǎng)基，用PBS溶液將細(xì)胞洗滌3次，再加入4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，最后用熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞成像效果。

3 結(jié)果與討論

3.1 PAAMN的制備與表征

PAAMN 的制備方法如圖1所示。PAA中的羧基被活化后與AMN中的氨基反應(yīng)，形成接枝聚合物； 該聚合物在透析過(guò)程中發(fā)生自組裝形成納米粒子，未反應(yīng)的熒光團(tuán)和溶劑也在透析中除去。將透析純化后的納米粒子溶液凍干，得到PAAMN。固體PAAMN能溶解于水中形成黃色透明溶液。

采用TEM、動(dòng)態(tài)光散射（DLS）、UVVis 及1H NMR方法對(duì)納米粒子的形態(tài)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。TEM圖如圖2A所示， 納米粒子呈規(guī)則球狀顆粒； 如圖2B所示，DLS測(cè)定PAAMN的水合粒徑約為290 nm。

圖3為AMN和PAAMN的UVVis光譜， AMN的最大吸收峰在392 nm，PAAMN的最大吸收峰在394 nm。1H NMR測(cè)定表明，PAAMN在7.00～8.77 ppm處有明顯的芳環(huán)氫相關(guān)信號(hào)，且在2.5～3.0 ppm處有哌嗪環(huán)上亞甲基的相關(guān)信號(hào)（圖4）。由于PAA在300 nm以上無(wú)明顯的吸收峰，其結(jié)構(gòu)中不存在芳環(huán)，而納米粒子中未與PAA鍵合的熒光團(tuán)已通過(guò)透析除去，因此上述結(jié)果證明萘酰亞胺熒光團(tuán)已經(jīng)被固定于PAAMN中。經(jīng)計(jì)算，熒光團(tuán)的摩爾取代度為4.1%，說(shuō)明PAA中僅有部分羧基被取代，生成的納米粒子中仍有大量可修飾的羧基存在，為其進(jìn)一步功能化提供了條件。

3.2 熒光性質(zhì)

由AMN和PAAMN的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜（圖5）可見(jiàn)，PAAMN具有與AMN類(lèi)似的特征熒光光譜，它們的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)均分別為390和534 nm，說(shuō)明PAAMN的熒光是由萘酰亞胺熒光團(tuán)產(chǎn)生，且與PAA鏈鍵合對(duì)熒光團(tuán)的熒光波長(zhǎng)無(wú)明顯影響。水溶液中PAAMN和AMN的量子產(chǎn)率測(cè)定結(jié)果分別是0.14和0.08，說(shuō)明形成納米粒子增強(qiáng)了萘酰亞胺熒光團(tuán)的熒光。在設(shè)定的測(cè)試條件下，2.5 h內(nèi)測(cè)定PAAMN的熒光強(qiáng)度變化在7%以?xún)?nèi)（圖6），說(shuō)明其有較好的光穩(wěn)定性。

金屬離子對(duì)PAAMN熒光強(qiáng)度影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在生理pH條件下，1.0106 mol/L的Mg2+，Hg2+，Ni2+，Mn2+，Al3+，Zn2+，Ba2+，Ag+和Cd2+對(duì)PAAMN的熒光沒(méi)有明顯影響ex=390 nm； em=534 nm.

由于許多4氨基萘酰亞胺衍生物對(duì)pH敏感[27，28]，因此本研究進(jìn)一步考察了pH值對(duì)PAAMN熒光性質(zhì)的影響。 結(jié)果表明，在pH 4.0～10.0范圍內(nèi)，PAAMN的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)不隨pH值變化而變化，但熒光強(qiáng)度隨著pH值增大而逐漸減小。如圖7所示，PAAMN的這種pH調(diào)控?zé)晒夥肿娱_(kāi)關(guān)功能與AMN類(lèi)似，但熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)及范圍要小于AMN。造成上述現(xiàn)象的原因可能是[28，29]： 堿性條件下，萘酰亞胺類(lèi)化合物哌嗪基團(tuán)中的烷基胺作為電子給體，向萘酰亞胺進(jìn)行光致電子轉(zhuǎn)移（PET），從而淬滅萘酰亞胺的熒光； 酸性增加使哌嗪基上的氮原子發(fā)生質(zhì)子化，抑制了PET過(guò)程，因此熒光強(qiáng)度增強(qiáng)； 與AMN相比，PAAMN中有較多的羧基，對(duì)哌嗪上氮原子的質(zhì)子化具有一定的緩沖作用，因此其熒光強(qiáng)度隨pH值變化相對(duì)較小。

3.3 細(xì)胞相容性

用于生物樣品的納米材料應(yīng)具有良好的生物相容性。細(xì)胞毒性試驗(yàn)是體外評(píng)價(jià)納米材料生物相容性的常用方法，具有經(jīng)濟(jì)、快速、操作方便等優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法考察了PAAMN濃度（0.001～0.25 mg/mL）對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響，并根據(jù)美國(guó)藥典中RGR與細(xì)胞毒性分級(jí)的關(guān)系（RGR≥100%為0級(jí)； 80%～99%為Ⅰ級(jí)； 50%～79%為Ⅱ級(jí)； 30%～49%為Ⅲ級(jí)； 0～29%，Ⅳ級(jí)）對(duì)其毒性進(jìn)行評(píng)級(jí)。從圖8可見(jiàn)，在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，當(dāng)PAAMN濃度低于0.1 mg/mL時(shí)，細(xì)胞的RGR均大于90%； 隨著PAAMN濃度增加，RGR略有下降，但都大于80%。各測(cè)試濃度PAAMN對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性反應(yīng)分級(jí)均為Ⅰ級(jí)，說(shuō)明PAAMN具有良好的細(xì)胞相容性。

3.4 熒光成像

PAAMN溶液的熒光顯微成像如圖9A所示，在390 nm激發(fā)光下，PAAMN能發(fā)射綠色的熒光。由于PAAMN具有好的細(xì)胞相容性，且在生理?xiàng)l件下具有較強(qiáng)的熒光，因此進(jìn)一步考察了其用于細(xì)胞成像的可行性。

HeLa細(xì)胞在含0.01 mg/mL PAAMN的培養(yǎng)基中孵育，然后洗去多余的納米粒子，將細(xì)胞固定， 在390 nm激發(fā)光下觀(guān)察成像效果，結(jié)果如圖9B所示，染色后的細(xì)胞仍具有較好的形態(tài)， 發(fā)出綠色熒光，表明PAAMN在細(xì)胞成像方面具有應(yīng)用潛力。

4 結(jié) 論

本研究以具有良好生物相容性及水溶性的PAA聚合物為基礎(chǔ)， 進(jìn)行萘酰亞胺衍生物接枝改性，并將生成產(chǎn)物自組裝制備了球形的納米粒子。該納米粒子具有好的水溶性，熒光團(tuán)以共價(jià)鍵的方式固定于其中，不易泄漏， 其在生理?xiàng)l件下具有較強(qiáng)的熒光＼，較長(zhǎng)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)（>500 nm）＼，大的Stocks位移（144 nm）以及良好的光穩(wěn)定性和細(xì)胞相容性。熒光顯微成像表明，合成的熒光納米粒子能進(jìn)入細(xì)胞，且在390 nm激發(fā)光下發(fā)射綠色熒光，可用于細(xì)胞熒光成像。由于具有大量可用于修飾的羧基，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾還有望制成高靈敏度和選擇性的熒光探針，在樣品檢測(cè)及生物成像研究中有應(yīng)用潛力。

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