李　娜，羅學(xué)仕，葉碧華，李志文，吳　狄，李立華，李　紅，周長(zhǎng)忍

(暨南大學(xué) 材料科學(xué)與工程系，人工器官與材料教育部工程中心，廣州 510632)

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“軟模板”法調(diào)控膠原的仿生礦化研究

李娜，羅學(xué)仕，葉碧華，李志文，吳狄，李立華，李紅，周長(zhǎng)忍

(暨南大學(xué) 材料科學(xué)與工程系，人工器官與材料教育部工程中心，廣州 510632)

摘要：在模擬體內(nèi)pH值=7.4的膠原溶膠-凝膠體系中，加入β-甘油磷酸鈉(β-GP)作為礦化的磷源，并引入聚丙烯酸(PAA)和三聚磷酸鈉(TPP)作為“軟模板”模擬體內(nèi)非膠原蛋白DMP-1的N端和C端的隔離功能域，調(diào)控Ⅰ型膠原的礦化，構(gòu)建了納米羥基磷灰石/膠原(n-HA/COL)復(fù)合支架材料。并以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞hUMSCs作為種子細(xì)胞，探究了其對(duì)細(xì)胞的粘附、增殖、分化的影響。結(jié)果表明，膠原纖維組織與礦化同步進(jìn)行，陳化處理有利于羥基磷灰石(HAp)晶體的結(jié)晶。自組裝HAp納米微粒不僅在膠原纖維外部沉積，也可以在原膠原分子上及膠原微纖維的末端被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)納米磷酸鈣鹽沿著膠原微纖維的圓柱形表面分布。細(xì)胞培養(yǎng)表明n-HA/COL并沒(méi)有明顯促進(jìn)hUMSCs細(xì)胞的增殖，但能夠誘導(dǎo)hUMSCs向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞AKP的表達(dá)，并且n-HA/COL復(fù)合支架材料與成骨誘導(dǎo)液(OICM)聯(lián)用時(shí)誘導(dǎo)效果更加顯著。這種以“bottom-up”深度礦化方法為骨支架材料的制備提供了新思路，n-HAp/collagen復(fù)合材料有望用于骨組織填充修復(fù)。

關(guān)鍵詞：膠原；礦化；聚丙烯酸；三聚磷酸鈉

0引言

Ⅰ型膠原是結(jié)締組織中極其重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，因而廣泛應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域。膠原蛋白作為“硬模板”有機(jī)基底礦化生成羥基磷灰石的過(guò)程并不是簡(jiǎn)單的物理沉積。礦化過(guò)程中確實(shí)存在著—COO…Ca的配位螯合作用，膠原纖維上的—COOH是形成HAp主要的成核位點(diǎn)[1]。最近的研究表明，膠原纖維的礦化過(guò)程首先是形成納米級(jí)液相的無(wú)定形磷酸鈣(ACP)前驅(qū)體并進(jìn)入膠原纖維的內(nèi)部[2]，然后ACP前驅(qū)體在膠原纖維內(nèi)部均相成核轉(zhuǎn)變成HAp[3]，但膠原纖維自身并不能克服均相成核中的熱力學(xué)壁壘障礙[4]以誘導(dǎo)成核。磷蛋白如DMP-1、骨涎蛋白等酸性非膠原蛋白可以通過(guò)動(dòng)力學(xué)驅(qū)動(dòng)均相成核，一方面可以作為隔離基元使ACP形成穩(wěn)定的納米前驅(qū)體；另一方面也可以作為模板基元來(lái)啟動(dòng)HAp的成核及分自組裝[5-6]。但這些非膠原體外活性低，價(jià)格昂貴，無(wú)法廣泛應(yīng)用于骨組織工程。

聚陰離子電解質(zhì)可以在膠原的仿生礦化中用來(lái)模擬這些非膠原蛋白的功能基元，多元羧酸如聚丙烯酸和聚天冬氨酸等常被用作模仿這些基質(zhì)蛋白的隔離基元功能的仿生類(lèi)似物[7]。比如，低分子量的聚丙烯酸可以用來(lái)模擬DMP-1蛋白的N端片段的隔離基元。這些聚陰離子電介質(zhì)可以包裹Ca2+、PO43-形成穩(wěn)定的納米級(jí)液相ACP前驅(qū)體，并通過(guò)毛細(xì)管作用滲入膠原纖維的孔區(qū)和原纖維縫隙間，進(jìn)而在膠原纖維內(nèi)部結(jié)晶形成Hap，整個(gè)礦化過(guò)程符合聚合物誘導(dǎo)液相前驅(qū)體機(jī)理(PILP)[6，8]。無(wú)機(jī)小分子的聚磷酸鹽如三偏磷酸鈉(STMP)和三聚磷酸鈉(TPP)等在仿生礦化中起到重要作用。它們可以模擬DMP-1蛋白帶負(fù)電荷的C端片段的模板功能基元，在膠原纖維內(nèi)部為Ca2+提供負(fù)電荷螯合位點(diǎn)[9]。

本文擬采用pH值=7.4的溶膠-凝膠體系中，加入β-甘油磷酸鈉這種可促進(jìn)礦化的活性小分子作為礦化的磷源，且引入低分子量的聚丙烯酸作為隔離功能基元，三聚磷酸鈉作為模板功能基元，兩者作為“軟模板”模擬非膠原蛋白的功能域來(lái)調(diào)控I型膠原的仿生礦化，制備新型的骨組織工程支架材料。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料和儀器

β-甘油磷酸鈉(β-GP，Sigma-Aldrich)，三聚磷酸鈉(TPP，Sigma-Aldrich)和聚丙烯酸(PAA，MW為1 800 Da，Sigma-Aldrich)，氯化鈣(廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)，AR)，鼠尾Ⅰ型膠原(鼠尾腱Ⅰ型膠原，暨南大學(xué)生物材料實(shí)驗(yàn)室)。實(shí)驗(yàn)中其它試劑均為分析純。X射線(xiàn)衍射儀(XRD，MSAL XD-2X，中國(guó)布萊格)超高分辨率場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FESEM，Nova NanoSEM430，荷蘭FEI公司)，高分辨率透射電子顯微鏡(HRTEM，JEM-2100F，日本 JEOL)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1“軟模板”調(diào)控仿生礦化I型膠原纖維

將鼠尾I型膠原溶解于10 mmol/L HCl溶液中，待膠原完全溶解后，緩慢加入96 mmol/L CaCl2。待溶液完全澄清后，邊攪拌邊用氨氣熏蒸至略顯乳白色，此時(shí)測(cè)得溶液pH值約為7.0。 將與HCl等量的25 mmol/L Tris-HCl buffer分成兩份，一份加入TPP，待完全溶解后，加入膠原CaCl2溶液中，靜置5～10 min；另一份加入PAA和β-GP，完全溶解后，迅速加入膠原CaCl2-TPP混合溶液中，最終溶液中各組分濃度為膠原5 mg/mL，CaCl248 mmol/L，β-GP 28.8 mmol/L，TPP 0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，PA 1 mg/mL。此過(guò)程中制備4組不同的樣品相互對(duì)照。(1) 空白對(duì)照組：不加入TPP和PAA；(2) 模板功能調(diào)控組：加入TPP，不加入PAA；(3) 隔離功能調(diào)控組：加入PAA，不加入TPP；(4) 模板-隔離雙調(diào)控組：同時(shí)加入TPP和PAA。

攪拌2 min后，放入37 ℃恒溫水浴箱中陳化0.5～24 h。樣品呈乳白色凝膠狀，用三蒸水洗滌3次以上，-80 ℃預(yù)冷后冷凍干燥，得到磷酸鈣/膠原復(fù)合支架材料。

1.2.2無(wú)機(jī)晶相組成分析

取部分支架材料擠壓成膜后，用X射線(xiàn)衍射法(XRD)測(cè)定樣品的晶相組成，測(cè)試條件為電壓36 kV，管流20 mA，CuKα靶，掃描范圍(2θ)5～80°，掃描速度8°/min。

1.2.3FESEM微觀(guān)形貌觀(guān)察及能譜儀(EDS)元素分析

取經(jīng)冷凍干燥后的多孔支架材料樣品，經(jīng)噴金處理后，置于超高分辨率場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FESEM，工作電壓3.0～5.0 kV)下觀(guān)察其顯微形貌，并用聯(lián)用的能譜儀對(duì)材料微區(qū)成分元素種類(lèi)與含量進(jìn)行分析。

1.2.4HRTEM微觀(guān)形貌觀(guān)察及選區(qū)電子衍射(SAED)晶相分析

將樣品用環(huán)氧樹(shù)脂固化包埋后，超薄切片，充分分散并沉積到銅網(wǎng)上，置于高分辨率透射電子顯微鏡(HRTEM，工作電壓100 kV)下觀(guān)察其顯微結(jié)構(gòu)，并利用傅里葉變換選區(qū)電子衍射(SAED)對(duì)無(wú)機(jī)相進(jìn)行晶相分析。

1.2.5細(xì)胞培養(yǎng)

選取模板-隔離基元雙調(diào)控并陳化24 h的n-HA/COL復(fù)合支架作為種子細(xì)胞的支架材料。將經(jīng)過(guò)鈷60(輻照強(qiáng)度為5 kgy)滅菌的?10 mm×8 mm n-HA/COL復(fù)合支架置于24孔培養(yǎng)板中，無(wú)菌PBS沖洗3次，用含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液浸泡過(guò)夜。取傳至第5代的人臍帶干細(xì)胞(hUMSCs)，0.25%的胰酶消化3～5 min后用培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心5 min收集，培養(yǎng)液吹散成細(xì)胞懸液，倒置顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為4.15×105個(gè)/mL，向每個(gè)支架及空白對(duì)照孔滴加100 μL細(xì)胞懸液。在CO2為0.5%，37 ℃條件下培養(yǎng)3 h細(xì)胞貼壁后，將支架孔及對(duì)照孔分為4組，分別為A組：對(duì)照組(加普通培養(yǎng)液培養(yǎng))；B組：成骨劑誘導(dǎo)組(加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(osteoblast inducing conditional media，OICM)培養(yǎng))；C組：支架材料組(加普通培養(yǎng)液培養(yǎng))；D組：聯(lián)合培養(yǎng)組(同時(shí)使用支架材料和成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng))。向各孔小心加入1 mL 培養(yǎng)液，每?jī)商霵BS清洗并換液1次。

1.2.6細(xì)胞粘附率統(tǒng)計(jì)

(1)1.2.7MTT法細(xì)胞活性檢測(cè)

在第1，3，5和7 d，每天各從A、B、C、D組中取3孔樣品作為測(cè)定孔，將原有培養(yǎng)液吸除后PBS吹洗3次，向測(cè)定孔及背景孔加入80 μL 5 mg/mL的MTT，再加入1 mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸除廢液，并向各孔加入400 μL 三聯(lián)液(10%SDS-5%異丙醇-12 mmol/L HCl)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后快速震蕩5 min后將各孔中的溶液分別轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板中，每孔180 μL，用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值(OD值)，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活性

1.2.8堿性磷酸酶活性測(cè)定

第7，14和21 d時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入1%的Triton X-100 PBS溶液常溫下裂解30～40 min，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中，根據(jù)AKP測(cè)定試劑盒的說(shuō)明，定義每克蛋白37 ℃下與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位，并按照說(shuō)明書(shū)的方法測(cè)定各孔液體在492 nm波長(zhǎng)的吸光度值(OD)。同時(shí)按照BCA試劑盒說(shuō)明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并測(cè)定各孔細(xì)胞裂解液在570 nm波長(zhǎng)的吸光度值(OD)，并計(jì)算出相應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度。最后計(jì)算出每單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中堿性磷酸酶的活性。

1.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)表示為mean±SD，采用SPSS16.0(SPSS，Chicago)分析軟件的獨(dú)立樣品方差分析進(jìn)行分析。P≤0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P≤0.01時(shí)認(rèn)為有顯著性差異。

2結(jié)果與討論

2.1仿生礦化支架無(wú)機(jī)晶相組成分析

圖1為37 ℃陳化0.5h后各組樣品膠原纖維表面礦物的XRD譜圖。從圖1((b)-(e))衍射峰位置與標(biāo)準(zhǔn)的HAp衍射峰位置相比基本一致可知，體系在很短的時(shí)間內(nèi)就生成了磷酸鈣鹽的晶體，無(wú)論是否加入軟模板調(diào)控礦化，各樣品中無(wú)機(jī)鹽的組成都是基本相同的，呈現(xiàn)出非典型的HAp衍射峰，沒(méi)有出現(xiàn)其它磷酸鈣鹽或者非鈣磷鹽雜質(zhì)，說(shuō)明膠原具有比較好的誘導(dǎo)HAp生成的能力。此外，圖1(b)-(e)與(a)標(biāo)準(zhǔn)的HAp衍射峰相對(duì)比，各自的HAp的三強(qiáng)主基衍射峰(約32°，對(duì)應(yīng)HAp的(211)、(112)、(300)晶面)仍出現(xiàn)明顯的衍射峰銳化現(xiàn)象，同時(shí)在46°附近的衍射峰(對(duì)應(yīng)HAp的(222)晶面)明顯尖銳，但在26°附近的HAp特征衍射峰(對(duì)應(yīng)HAp的(002)晶面)不明顯，且(圖1(b)、(c)、(d))三者相比幾乎無(wú)明顯差異，說(shuō)明HAp的晶體受“硬模板”膠原的影響主要沿(211)和(222)面生長(zhǎng)[10]，生成的HAp處于一種非典型的結(jié)晶或者由無(wú)定形磷酸鈣(ACP)向HAp晶體過(guò)渡的狀態(tài)。

圖1　37 ℃陳化0.5 h后各組樣品XRD譜圖

Fig1XRDpatternsofthesamplesafterageingfor0.5hat37 ℃

2.2陳化時(shí)間對(duì)無(wú)機(jī)晶相的影響

由圖2((b)-(d))可知，在模板-隔離雙調(diào)控組中，隨著陳化時(shí)間的延長(zhǎng)，26°附近的HAp特征衍射峰(對(duì)應(yīng)HAp的(002)晶面)逐漸顯露出來(lái)，但更為明顯的是，三強(qiáng)主基峰及46°附近的衍射峰(對(duì)應(yīng)HAp的(222)晶面)峰強(qiáng)明顯在增大，說(shuō)明軟模板調(diào)控膠原礦化的過(guò)程中，HAp在自組裝過(guò)程中更傾向于在(211)和(222)上生長(zhǎng)，表現(xiàn)出非典型的結(jié)晶途徑。

圖2雙調(diào)控組37℃陳化不同時(shí)間后樣品XRD譜圖

Fig 2 XRD patterns of templating-sequestration samples after aging for different time at 37 ℃

2.3FESEM微觀(guān)結(jié)構(gòu)觀(guān)察及EDS元素分析

圖3為37 ℃陳化0.5 h后4組樣品的膠原支架內(nèi)橫截面掃描電鏡圖片。4組樣品膠原纖維表面均沉積了大量的尺寸在100～200 nm之間的磷酸鈣鹽，多為無(wú)定形態(tài)、不規(guī)則的片狀或者球狀晶體，這與XRD結(jié)果相吻合，晶體相互交疊堆垛，呈現(xiàn)出不完全結(jié)晶的形態(tài)。圖3(a)表明，當(dāng)體系中不存在具有隔離和模板功能的軟模板調(diào)控礦化時(shí)，生成的磷酸鈣鹽形貌雜亂無(wú)章，有些部分已經(jīng)開(kāi)始融合。圖3(b)顯示，只加入TPP調(diào)控而無(wú)聚丙烯酸時(shí)，大量片狀或球狀晶體附著在膠原纖維外表面。這是因?yàn)樵诘V化初始階段，由于缺乏隔離功能基元來(lái)調(diào)控穩(wěn)定納米ACP前驅(qū)體，導(dǎo)致反應(yīng)溶液中已經(jīng)形成了尺寸較大的無(wú)定形磷酸鈣，大于膠原纖維的周期橫紋間距約為67 nm，無(wú)法進(jìn)入膠原纖維內(nèi)部從而在膠原纖維外表面無(wú)規(guī)隨機(jī)的吸附沉積成球晶[11]。膠原纖維外表面被這些球晶覆蓋，因此無(wú)法觀(guān)察到膠原內(nèi)部的礦化情況。圖3(c)表明，當(dāng)只加入聚丙烯酸調(diào)控礦化而沒(méi)有加入TPP時(shí)，除了在膠原纖維外部有大量弱結(jié)晶的磷酸鈣鹽以外，更為重要的是，發(fā)現(xiàn)膠原纖維內(nèi)部也有發(fā)生類(lèi)似礦化過(guò)程的傾向，如圖3(c)兩黑線(xiàn)間所示，根據(jù)材料表面特征推測(cè)，膠原纖維內(nèi)部很有可能被大量的磷酸鈣鹽填充，由此推斷，在聚丙烯酸的隔離功能基元作用下，Ca2+和PO43-形成穩(wěn)定的納米無(wú)定形前驅(qū)體小液滴，能夠順利進(jìn)入膠原纖維的孔區(qū)并進(jìn)一步結(jié)晶生成HAp。但接下來(lái)的礦化過(guò)程由于缺乏模板調(diào)控限制了HAp的分級(jí)自組裝，從而導(dǎo)致產(chǎn)生了相互交疊，以致于掩蓋了膠原纖維的周期性結(jié)構(gòu)[6]。圖3(d)顯示出，當(dāng)加入聚丙烯酸作為隔離調(diào)控基元，TPP作為模板調(diào)控基元，在膠原纖維外部發(fā)生了可控的礦化過(guò)程，此外，兩黑線(xiàn)間為明亮區(qū)域，相距大約60 nm，應(yīng)為HAp在膠原纖維的孔區(qū)形成，由此推測(cè)出，在聚丙烯酸的隔離調(diào)控下，納米無(wú)定形前驅(qū)體小液滴通過(guò)孔區(qū)進(jìn)入了膠原纖維內(nèi)，并在TPP的模板調(diào)控下進(jìn)一步發(fā)生了HAp的分級(jí)自組裝，從而形成了周期性的礦化膠原纖維結(jié)構(gòu)。從圖3(c)、(d)發(fā)現(xiàn)膠原纖維束的長(zhǎng)度>1 μm，直徑約為300 nm左右。整個(gè)調(diào)控礦化過(guò)程符合PILP理論。

圖3　37 ℃陳化0.5 h后各組樣品FESEM譜圖

從圖4(a)模板-隔離雙調(diào)控組37 ℃陳化0.5 h后SEM照片的黑色方框區(qū)域的選區(qū)能譜散射分析(EDS)可知，Ca/P=1.19，而標(biāo)準(zhǔn)HAp的Ca/P=1.67，可以認(rèn)為膠原纖維外表面上除了生成大量的HAp晶體外，還存在ACP和很少量其它的鈣磷鹽[12]。

圖4雙調(diào)控組37 ℃陳化不同時(shí)間后樣品SEM & EDS照片

Fig 4 SEM & EDS images of the templating-sequestration samples after aged for different time at 37 ℃

從圖4(b)可知，隨著陳化時(shí)間的延長(zhǎng)，ACP和其它鈣磷鹽向HAp晶體轉(zhuǎn)變并長(zhǎng)大，陳化24 h后，形成尺寸在1 μm左右的不規(guī)則片晶或球晶，這與XRD顯示的晶體優(yōu)先沿(211)和(222)生長(zhǎng)的結(jié)果相一致。從圖4(b)中黑色方框區(qū)域內(nèi)的EDS可知，Ca/P=1.30，接近于HAp的Ca/P=1.67。

2.4HRTEM與SAED分析

HRTEM可以更加直接地研究膠原纖維與形成的晶體間的相互關(guān)系。必須要說(shuō)明的是制樣過(guò)程中破壞了膠原纖維的結(jié)構(gòu)，僅可以觀(guān)察到原膠原分子及膠原微纖維。圖5(a)顯示出膠原纖維的外表面沉積著幾十納米尺寸的HA晶粒。圖5(c)為(b)圖中方框區(qū)域內(nèi)的放大圖像。在圖5(b)中，黑色長(zhǎng)箭頭線(xiàn)表示出膠原微纖維的縱向[13]。自組裝HA納米微粒不僅在膠原纖維外部沉積，也可以在原膠原分子上及膠原微纖維的末端被發(fā)現(xiàn)[10](如圖5(b)、(c)黑色短箭頭線(xiàn)所示)，同時(shí)納米ACP也沿著膠原微纖維的圓柱形表面分布[14](如圖5(b)、(c)黑色短箭頭線(xiàn)所示)。圖5(c)黑色長(zhǎng)箭頭線(xiàn)顯示的是原膠原纖維的縱向，之間的距離約為1.3 nm，這與報(bào)道的膠原分子直徑數(shù)據(jù)相一致。圖5(d)為(c)區(qū)域的傅利葉變換選區(qū)電子衍射圖像。電子衍射圖像呈不連續(xù)的圓弧狀，說(shuō)明生成的HA為多晶體，同時(shí)也存在無(wú)定形態(tài)。根據(jù)計(jì)算由內(nèi)向外，各圓弧分別對(duì)應(yīng)HA的(002)、(211)和(222)晶面，此結(jié)果與XRD的結(jié)果互相吻合。根據(jù)Kikuchi等[15]的研究結(jié)果，HA及膠原纖維自組裝的程度可以根據(jù)膠原纖維的長(zhǎng)度及HA(002)晶面對(duì)應(yīng)的電子衍射弧的弧長(zhǎng)來(lái)判斷， 本文中自組裝的程度比較好。

圖5　雙調(diào)控組37 ℃陳化24 h后樣品HRTEM & SAED照片

2.5細(xì)胞粘附率

如表1所示，hUMSCs細(xì)胞在n-HA/COL復(fù)合支架組和聯(lián)合培養(yǎng)組支架上的粘附率分別為(89.64±1.21)%，(93.73±1.69)%。兩種支架的粘附率都非常高，這是因?yàn)椴牧系奈暂^好，細(xì)胞懸液迅速被支架吸收，同時(shí)復(fù)合支架材料上連通的拓?fù)淇锥摧^為規(guī)整，更加有利于細(xì)胞的粘附和伸展，在一定程度上提高了細(xì)胞的粘附率。

表1hUMSCs在n-HA/COL復(fù)合支架上的粘附率

Table 1 The adherence ration of hUMSCs on the n-HA/COL composite scaffolds

SampleSeededcells/×104Unattachedcells/×103Celladhesionrate/%支架材料組4.154.3±0.589.64±1.21聯(lián)合培養(yǎng)組4.152.6±0.793.73±1.69

2.6MTT法相對(duì)細(xì)胞活性統(tǒng)計(jì)分析

圖6顯示的是MTT法檢測(cè)相對(duì)細(xì)胞活性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。與對(duì)照組相較，第1 d時(shí)，C、D組的相對(duì)細(xì)胞活性在78%～84%之間，這是因?yàn)橹Ъ芸桌锏募?xì)胞有一些沒(méi)有貼壁以及濕態(tài)的支架降低了MTT的濃度導(dǎo)致反應(yīng)不完全等原因造成的。根據(jù)柱形圖的趨勢(shì)可以發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不論是成骨劑誘導(dǎo)組(B組)，支架材料組(C組)還是聯(lián)合培養(yǎng)組(D組)，各組的相對(duì)細(xì)胞活性與對(duì)照組相比均沒(méi)有明顯提高，表明細(xì)胞增殖速度也沒(méi)有明顯的提高，說(shuō)明n-HA/COL復(fù)合支架及成骨誘導(dǎo)液并沒(méi)有明顯促進(jìn)hUMSCs細(xì)胞的增殖，但也沒(méi)有抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。本文結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在圖6中B、C和D與A組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖6MTT法檢測(cè)n-HA/COL及成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活性

Fig 6 The relative cell viability of the cells on the n-HA/COL scaffolds and OICM with MTT

2.7堿性磷酸酶活性

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)是分化成骨細(xì)胞過(guò)程中的早期標(biāo)志物，也是細(xì)胞外基質(zhì)成熟的標(biāo)志，是成骨細(xì)胞的催化劑，能促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化。從圖7可知，在第7，14，21 d時(shí)，n-HA/COL復(fù)合支架材料誘導(dǎo)組(C組)及與成骨誘導(dǎo)液聯(lián)用的聯(lián)合誘導(dǎo)組(D組)中，AKP活性明顯高于空白對(duì)照組。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組中AKP活性都有不同程度的提高；更為明顯的是，隨時(shí)間延長(zhǎng)，含有復(fù)合支架的實(shí)驗(yàn)組(C和D組)中AKP活性的提高速度明顯加快，而且聯(lián)合誘導(dǎo)組(D組)更勝于復(fù)合支架誘導(dǎo)組(C組)，與空白對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。這說(shuō)明n-HA/COL復(fù)合支架材料能夠誘導(dǎo)hUMSCs向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞AKP的表達(dá)，并且n-HA/COL復(fù)合支架材料與成骨誘導(dǎo)液聯(lián)用時(shí)誘導(dǎo)效果更加顯著。在圖7中B、C和D與A組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖7n-HA/COL及成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)細(xì)胞7，14，21 d后的堿性磷酸酶活性

Fig 7 The AKP activity of the cells on the n-HA/COL scaffolds and OICM after 7，14，21d

3結(jié)論

pH值=7.4的膠原溶膠-凝膠體系中，以TPP和PAA雙調(diào)控“軟模板”來(lái)調(diào)控I型膠原的仿生礦化。 PAA作為隔離功能基元可以在礦化的初始階段調(diào)控形成穩(wěn)定的納米ACP前驅(qū)體小液滴，從而進(jìn)入膠原纖維內(nèi)部，此過(guò)程符合PILP理論；TPP作為模板功能基元可以調(diào)控膠原纖維內(nèi)部的HAp的自組裝，從而在纖維內(nèi)部形成納米晶粒，并使膠原纖維產(chǎn)生周期性的明暗條紋。細(xì)胞培養(yǎng)表明hUMSCs在n-HA/COL復(fù)合支架組和聯(lián)合培養(yǎng)組支架上的生長(zhǎng)狀態(tài)良好且AKP活性明顯高于對(duì)照組和OICM組,顯示出了較為顯著的成骨誘導(dǎo)性。因此，這種以“bottom-up”方式仿生構(gòu)建的n-HA/COL復(fù)合材料有望用于骨組織修復(fù)材料[16]。

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Biomimetic mineralization of collagen fibers regulated with “soft template”

LI Na，LUO Xueshi， YE Bihua， LI Zhiwen，WU Di, LI Lihua， LI Hong， ZHOU Changren

(Department of Material Science and Engineering, Engineering Research Center of Artificial Organs and Materials, Jinan University, Guangzhou 510632,China)

Abstract:In this paper, polyacrylic acid (PAA) and sodium tripolyphosphate (TPP) were applied as “soft template” which simulated respectively as the N- and C-terminal domains of the non-collageneous proteins DMP-1 in vivo to control the mineralization process of type Ⅰ collagen. Experimental pH was settled at 7.4 and β sodium glycerophospate was applied as the phosphorus scource. Nano-hydrixyapatite (HAp)/collagen scaffold (n-HA/COL) was fabricated in this experiment. In addition，human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUMSCs) were selected to study the effects of the materials on the cell adhesion, proliferation, and differentiation. Results showed that self-organization and minimization of the collagen fibers were simultaneous. The aging process contributed to the growth of HAp. Self-assembled HAp nanoparticles depositedboth on the external collagen fibres and the terminal of microfibrils. Nano-calcium phosphate crystals were distributed along the cylindrical surface of the collagen microfibrils. Cell culture showed that n-HA/COL did not significantly promote the proliferation of hUMSCs cells but can induce osteoblast differentiation and to promote AKP expression. Also, the osteogenic effect was more significant when n-HA/COL combined with OICM. This “bottom-up” method of deep mineralization provides a novel approach for preparation of bone compositescaffolds, and the n-HAp/collagen composite is expected to be used for bone repairing and regeneration.

Key words:collagen； mineralization； polyacrylic acid； tripolyphosphate

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.03.024

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：Q81

作者簡(jiǎn)介：李娜(1988-)，女，山東德州人，在讀碩士，師承李立華教授，從事生物材料研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31270021)；廣東省優(yōu)秀博士論文資助項(xiàng)目(sybzzxm201121)；廣東省醫(yī)學(xué)基金資助項(xiàng)目(A2013334)

文章編號(hào)：1001-9731(2016)03-03129-07

收到初稿日期：2015-03-24 收到修改稿日期：2015-10-27 通訊作者：李立華，E-mail: tlihuali@jnu.edu.cn