徐盼盼+宋悅+陳娟娟+楊銳+嚴(yán)小軍+鐘琪

摘 要 采用超高效液相色譜四極桿飛行時間質(zhì)譜 （UPLCQTOFMS） 技術(shù)，結(jié)合多元變量數(shù)據(jù)分析方法，研究0.1%褐藻糖膠喂養(yǎng)黃顙魚幼魚1～8周的脂質(zhì)代謝組學(xué)。通過不同喂養(yǎng)時間的黃顙魚脂質(zhì)成分的重要性（VIP）值和差異性（P）值，篩選出98個差異性代謝物，其中鑒定出與褐藻糖膠對黃顙魚隨喂養(yǎng)時間變化的影響有重要作用的11種脂質(zhì)生物標(biāo)志物，包括LysoPC 16∶0、PC 22∶6/16∶0、PE 22∶6/16∶0、PI 18∶0/22∶6、DAG 16∶0/16∶0、DAG 16∶0/18∶1、DAG 18∶1/18∶1、TAG 20∶5/16∶0/18∶3、TAG 20∶4/16∶1/18∶2、TAG 16∶0/18∶2/20∶5 和TAG 18∶2/14∶0/18∶1。研究表明，經(jīng)0.1%褐藻糖膠喂養(yǎng)不同時期的黃顙魚中LysoPC、PC、PE和PI的含量在第8周時達到最大值； DAG的含量呈現(xiàn)出先減少后增加的變化規(guī)律，而TAG的變化不定，TAG 18∶2/14∶0/18∶1、TAG 20∶5/16∶0/18∶3和TAG 20∶4/16∶1/18∶2的含量隨著喂養(yǎng)褐藻糖膠時間的延長而增加，而TAG 16∶0/18∶2/20∶5呈減少的趨勢。根據(jù)上述實驗結(jié)果，推測褐藻糖膠可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)成分的含量來增加黃顙魚幼魚的免疫力。本研究結(jié)果為褐藻糖膠對黃顙魚脂質(zhì)代謝響應(yīng)機理的影響的研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 黃顙魚； 褐藻糖膠； 超高效液相色譜四極桿飛行時間質(zhì)譜； 脂質(zhì)組學(xué)

1 引 言

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）肉質(zhì)細嫩，含有大量粗蛋白、礦物元素、必需氨基酸及維生素E，且藥用價值高，因而成為備受人們喜愛的優(yōu)質(zhì)食用魚[1，2]。然而，在自然生長條件下，黃顙魚體內(nèi)出現(xiàn)大量的脂肪積累，從而導(dǎo)致魚體可食部分減少及食用價值下降，甚至可能引起脂肪肝發(fā)生病變[3～5]。研究表明，在飼料中添加適量植物多糖可改善魚體內(nèi)脂質(zhì)代謝，提高魚體品質(zhì)[6]。Yang等[7]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加0.1%褐藻糖膠（Fucoidan）能顯著促進黃顙魚幼魚的生長，提高胃和腸道中脂肪酶活性。褐藻糖膠具有降血脂、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗凝血、抗腫瘤等活性[8，9]，還可以促進胃腸蠕動，降低膽固醇及甘油三酯含量，加速腸道內(nèi)多余膽固醇及有害重金屬的排出，對肝臟無毒害作用。因此，了解黃顙魚幼魚體內(nèi)脂質(zhì)代謝在褐藻糖膠影響下的變化，對提高黃顙魚幼魚免疫力和黃顙魚食用品質(zhì)具有重要意義。

脂質(zhì)組學(xué)作為代謝組學(xué)的一個分支，對所有脂類物質(zhì)進行系統(tǒng)研究[10～12]。具有高分辨力的超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLCQTOFMS）技術(shù)，是復(fù)雜生物代謝物的脂質(zhì)組學(xué)分析中應(yīng)用最廣泛的分析技術(shù)[13～17]。本研究采用UPLCQTOFMS技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計變量分析方法，進行黃顙魚幼魚在喂養(yǎng)0.1%褐藻糖膠不同時間下的脂類代謝組學(xué)研究，為黃顙魚健康養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

超高效液相色譜分析系統(tǒng)QTOF Premier高分辨四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國Waters公司）； ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）； XS105分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）； 38K臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）。乙腈、甲醇、氯化鋰、甲酸（色譜純，美國SigmaAldrich公司）。

2.2 樣品前處理

黃顙魚幼魚購于浙江嘉興一星公司養(yǎng)殖基地，禁食24 h后取體重相近、健康情況相近的黃顙魚幼魚進行實驗并將其分組。每組5個重復(fù)，每個重復(fù)30尾，以重復(fù)為單位飼養(yǎng)于體積為500 L的圓柱形塑料桶中。飼喂在普通飼料中添加0.1%褐藻糖膠的飼料的為實驗組，實驗周期為8周。分別于喂養(yǎng)1、2、4和8周4個時間點取樣，每個時間點分別取出10尾，作為10個平行樣。經(jīng)超低溫冷凍干燥且液氮冰浴研磨后，于

Symbolm@@ 80℃保存，備用。

總脂的提取采用BlighDyer法[18]并做適當(dāng)改良：取（50 ± 0.1） mg樣品于15 mL玻璃離心管中，加入5 mL甲醇氯仿（1∶1，V/V）振蕩提取5 min，再超聲10 min后，3500 r/min離心10 min，重復(fù)操作3次，合并上清液，于27℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒重； 加2 mL甲醇沖洗旋蒸瓶，轉(zhuǎn)移至4 mL樣品瓶中，氮氣吹干； 用1 mL甲醇復(fù)溶后，12000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm有機濾膜（美國Millipore公司）過濾后，待測。

2.3 UPLCQTOFMS分析條件

2.3.1 色譜條件 流動相A為乙腈四氫呋喃異丙醇（1∶1∶1，V/V），流動相B為乙腈水（2∶1，V/V），A和B中均加入0.1%（V/V）甲酸和0.01%（m/V）LiCl。洗脫梯度：0～3 min， 2% A； 3～5 min，2%～30% A； 5～12 min，30%～50% A； 12～22 min，50%～80% A； 22～25 min， 80% A； 25～27min，80%～2% A； 27～30 min，2% A。流速為0.5 mL/min，進樣量為3 μL。柱溫箱溫度40℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源溫度為120℃，脫溶劑溫度為250℃，脫溶劑氣（氮氣）流速為600 L/h。四極桿質(zhì)譜儀質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1200，一次掃描時間為0.3 s。TOF質(zhì)譜儀離子飛行方式采用V模式，m/z 1000時最大分辨率調(diào)整為10000。在正離子電離模式下，毛細管電離電壓3.0 kV，取樣錐孔電壓為35 kV； 在負(fù)離子電離模式下，毛細管電離電壓為2.6 kV，取樣錐孔電壓為45 kV。用于MSE分析時碰撞能量在低能量（25 eV）和高能量（50 eV）間轉(zhuǎn)換。儀器測定，用甲酸鈉進行多點矯正，并用0.5 ng/μg亮腦啡肽作為外標(biāo)物對目標(biāo)離子進行精確質(zhì)量鎖定。

2.4 數(shù)據(jù)處理

LCMS的原始數(shù)據(jù)通過Masslynx V4.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國 Waters公司），獲得包含樣品名稱、每一樣品基于保留時間和對應(yīng)質(zhì)荷比的峰數(shù)量和歸一化后的峰強度數(shù)據(jù)表。剔除丟失80%數(shù)據(jù)峰，并將歸一化峰面積最小非零值的一半代替未檢測到的數(shù)據(jù)[17]，導(dǎo)入SIMCAP 13.0 （Umetrics， Umea， Sweden）進行多元統(tǒng)計變量分析。經(jīng)Log轉(zhuǎn)換，在Pareto模式下進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法辨別分析（PLSDA）。通過MEV軟件（Version 4.5.1）的KruskalWallis檢驗潛在標(biāo)志物在單因素分析水平上是否存在顯著性差異（p<0.05）和熱圖分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同時期黃顙魚幼魚的脂質(zhì)組學(xué)分析

將喂養(yǎng)0.1%褐藻糖膠1、2、4和8周（分別用F1、F2、F3和F4表示）的黃顙魚幼魚脂質(zhì)提取物進行UPLCQTOF MS分析。將質(zhì)譜數(shù)據(jù)峰進行歸一化處理，導(dǎo)入SimcaP數(shù)據(jù)軟件，分別進行PCA及PLSDA分析。PCA能將多變量、多主成分（PC）的大數(shù)據(jù)降維分析，PCA得分矩陣圖是由第一主成分和第二主成分構(gòu)成的平面投影平面圖（圖1A和1B）。PLSDA作為一種監(jiān)督式投影方法，通過七折交叉驗證使F1F4組的樣品在數(shù)據(jù)集中實現(xiàn)最大分離（圖1C和1D）。在正離子模式下， R2Y=0.980，Q2=0.867； 在負(fù)離子模式下，R2Y=0.987，Q2=0.904。Q2為累積價差有效性，Q2越大，表示模型的預(yù)測能力越好； R2為累積方差值，表示有多少原始數(shù)據(jù)被用于建立新的PLSDA判別模型，R2越大，表示解釋能力越強，這說明在F1F4組的PLSDA模型預(yù)測能力和解釋能力較好。將此模型經(jīng)200次排列實驗，得到正離子模式R2 截距為0.381，Q2 截距為0.271 ，負(fù)離子模式下R2截距為 0.285，Q2 截距為0.227。上述結(jié)果與文獻[19]報道數(shù)值相符，即R2 截距< 0.4； Q2 截距< 0，說明PLSDA模型均能較好擬合，沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象。此外，根據(jù)PLSDA模型和KruskalWallis檢驗分別獲得物質(zhì)的VIP值和p值，篩選出98個VIP>1且p< 0.05的差異性代謝物。

3.2 脂質(zhì)生物標(biāo)志物的鑒定

通過比較各類脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間（RT）、元素組成模擬及特征碎片離子（誤差< 5 ppm），并結(jié)合文獻報道的部分種類脂質(zhì)的碎片模式，如PC，PE，PS，PI，TAG，DAG[15，20～22]，對98個差異性代謝物進行鑒定。為了進一步確定脂質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)，通過LIPID MAPS庫（www.lipidmaps.org）、LIPID BANK庫（www.lipidbank.jp）、METLIN庫（metlin.scripps.edu）、LIPIDOMICS EXPERTISE PLATFORM庫（www.lipidmoicsexpertis.de）及HMDB庫（www.hmdb.ca）在線數(shù)據(jù)庫搜庫確認(rèn)。最終在正、負(fù)離子模式下鑒定出與褐藻糖膠對黃顙魚隨喂養(yǎng)時間變化的影響有重要作用的11種脂質(zhì)標(biāo)志物，如表1所示。

3.3 喂養(yǎng)0.1%褐藻糖膠對黃顙魚幼魚脂質(zhì)影響的分析

隨著喂養(yǎng)0.1%褐藻糖膠時間的變化，黃顙魚體內(nèi)的脂質(zhì)代謝組也發(fā)生改變。如圖2所示，熱圖中不同的顏色代表不同的脂質(zhì)含量水平：紅色表示脂質(zhì)含量相對高，綠色表示脂質(zhì)含量相對低。鑒定的TAG 18∶2/14∶0/18∶1[BHDFG5，WKZQ0W]LysoPC，溶血磷脂酰膽堿； PC，磷脂酰膽堿； PE，磷脂酰乙醇胺； PI，磷脂酰肌醇； DAG，甘油二酯； TAG，甘油三酯。

11種脂質(zhì)標(biāo)志物中，LysoPC 16∶0和 PI 18∶0/22∶6含量在飼喂褐藻糖膠最初的幾周變化不明顯，而在第8周時含量增加； PC 22∶6/16∶0的含量是先增加后下降，但是在第8周時達到最高值； PE 22∶6/16∶0在這4個時間點中，變化不是很明顯，在喂養(yǎng)一段時間后，含量略有升高。此外，與第1周相比，DAGs（16∶0/16∶0，16∶0/18∶1，18∶1/18∶1）含量在第2周和第4周時逐漸減少，到第8周開始回升； 與前4周相比，4種TAG在第8周時有明顯變化，其中TAG 18∶2/14∶0/18∶1、TAG 20∶5/16∶0/18∶3和TAG 20∶4/16∶1/18∶2的含量隨著褐藻糖膠喂養(yǎng)時間的延長而增加，而TAG 16∶0/18∶2/20∶5則隨著喂養(yǎng)時間的延長而含量減少。為了更直觀地表示各個脂質(zhì)標(biāo)志物的含量變化，利用各個時間點下的歸一化面積進行箱式圖分析，如圖3所示。

PC和PE在維持細胞結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用，PC可顯著提高大腦性能，加速神經(jīng)元間的信號傳導(dǎo)[22]，PE在動物磷脂中含量位列第二，大腦中含量最高，在哺乳動物細胞的細胞質(zhì)分裂過程中發(fā)揮了重要作用[23]。PI是重要的信號分子，參與“雙信使系統(tǒng)”[24]。因此，黃顙魚幼魚中LysoPC 16∶0，PC 22∶6/16∶0，PE 22∶6/16∶0及PI 18∶0/22∶6的變化趨勢雖不同，但是在喂養(yǎng)到第8周時含量均增高，這與細胞膜的結(jié)構(gòu)和性能密切相關(guān)。此外，各種類TAG中，有的TAG含量增加，有的TAG減少，而DAG的含量則是先減少再增加。Yang[7]和吳清和[25]等發(fā)現(xiàn)，褐藻糖膠通過刺激相關(guān)的脂肪酶來影響TAG含量，如激素敏感性脂肪酶（HSL）可水解單酰甘油（MAG）、DAG、TAG等[26]，脂蛋白脂肪酶（LPL）可水解血漿脂蛋白中的TAG，從而分別為脂肪及其它組織提供可儲存和氧化的游離脂肪酸（FFA），是魚體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)脂肪含量的酶[28]。其它相關(guān)酶還包括磷酸化激素敏感性脂肪酶（pHSL）等，在上述酶的作用下，黃顙魚體內(nèi)有的TAG水解為FA，且多為不飽和脂肪酸。高含量的不飽和脂肪酸能促進魚類的生長、脂質(zhì)代謝及提高其免疫能力，亦可通過

SymbolbA@ 氧化作為細胞能量的來源[29]。在幼魚生長過程中，需要積累一定的脂肪來提高自身的免疫力，因此TAG脂質(zhì)標(biāo)志物呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，TAG 18∶2/14∶0/18∶1、TAG 20∶5/16∶0/18∶3和TAG 20∶4/16∶1/18∶2的含量隨著褐藻糖膠喂養(yǎng)時間的延長而增加，而TAG 16∶0/18∶2/20∶5含量則隨著喂養(yǎng)時間的延長而減少。在脂質(zhì)生物合成過程中，DAG作為TAG合成的中間分子，且在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作為脂質(zhì)信使發(fā)揮作用，可為膜提供負(fù)曲率，因此DAG是包括膜磷脂和TAG在內(nèi)的細胞甘油酯完整系列的前體分子[30]。正是因為DAG功能的高度多樣化，其在脂質(zhì)代謝中的作用也非常復(fù)雜，因此DAG的含量的變化也呈現(xiàn)多樣化的趨勢。

4 結(jié) 論

利用UPLCQTOFMS和多變量數(shù)據(jù)分析手段，研究了飼喂0.1%褐藻糖膠不同時間下黃顙魚幼魚的脂質(zhì)代謝組學(xué)，共鑒定出11種差異性脂質(zhì)代謝標(biāo)志物，在第8周時變化最顯著； 其中LysoPC、PC、PE、PI和DAG在第8周時含量最高，而TAG未呈現(xiàn)明顯的變化規(guī)律，DAG具有先減少后增加的趨勢。結(jié)果表明，褐藻糖膠通過調(diào)節(jié)黃顙魚幼魚的脂質(zhì)代謝而影響其生長及免疫功能。本研究結(jié)果為研究褐藻糖膠對黃顙魚養(yǎng)殖的作用機制提供了參考。

References

1 LI MingFeng. Modern Fisheries Information， 2011， 26（1）： 4-11

李明峰. 現(xiàn)代漁業(yè)信息， 2011， 26（1）： 4-11

2 CHEN Tao， YU Dan， ZHAO Xin， XIE RuiTao， HUANG Kai， ZHANG Sheng， LU Hao. Guangxi Agricultural Sciences， 2010， 41（1）： 66-69

陳 濤， 于 丹， 趙 鑫， 謝瑞濤， 黃 凱， 張 盛， 陸 豪. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 41（1）： 66-69

3 DU ZhenYu. Journal of Fisheries of China， 2014， 38（9）： 1628-1638

杜震宇. 水產(chǎn)學(xué)報， 2014， 38（9）： 1628-1638

4 Li X F， Liu W B， Lu K L， Xu W N， Wang Y. Fish Shellfish Immun.， 2012， 33（2）： 316-323

5 Chen Q L， Luo Z， Tan X Y， Pan Y X， Zheng J L， Zou M. Gene， 2014， 536（2）： 232-237

6 BAI DongQing， WU Xuan， ZHU GuoXia， NING Bo. Hubei Agricultural Sciences， 2011， 50（9）： 1855-1858

白東清， 吳 旋， 朱國霞， 寧 博. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 50（9）： 1855-1858

7 Yang Q， Yang R， Li M， Zhou Q C， Liang X P， Elmada Z C. Fish Shellfish Immun.， 2014， 41（2）： 264-270

8 Wijesekara I， Pangestuti R， Kim S K. Carbohydrate Polymers， 2011， 84（1）： 14-21

9 Wang J， Zhang Q B， Zhang Z S， Hou Y， Zhang H. Chin. J Oceanol. Limnol.， 2011， 29（3）： 679-685

10 Zehethofer N， Pinto D M. Anal. Chim. Acta， 2008， 627（1）： 62-70

11 CHEN ShengLan， ZHAO XiaoYan， REN LuJing， JI XiaoJun， HUANG He. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（5）： 685-692

陳勝蘭， 趙曉艷， 任路靜， 紀(jì)曉俊， 黃 和. 分析化學(xué)， 2016， 44（5）： 685692

12 Han X， Gross R W. J. Lipid Res.， 2003， 44（6）： 1071-1079

13 Chen D Y， Yan X J， Xu J L， Su X L， Li L J. Metabolomics， 2013， 9（5）： 949-959

14 Xu J L， Chen D Y， Yan X J， Chen J J， Zhou C X. Anal. Chim. Acta， 2010， 663（1）： 60-68

15 Yan X J， Xu J L， Chen J J， Chen D Y， Xu S L， Luo Q L， Wang Y J. Metabolomics， 2012， 8（2）： 299-309

16 Su X L， Xu J L， Yan X J， Zhao P， Chen J J， Zhou C X. Metabolomics， 2013， 9（2）： 300-310

17 Chen J J， Li M， Yang R， Luo Q J， Xu J L， Ye Y F， Yan X J. J. App. Phycol.， 2016， 28（3）： 1903-1913

18 Bligh E G， Dyer W J. Canad. J. Biochem. Physiol.， 1959， 37（8）： 911-917

19 Eriksson L， Jaworska J， Worth A P. Environ. Health Persp.， 2003， 111（10）： 1361

20 Yan X J， Li H Y， Xu J L， Zhou C X. Chin. J. Oceanol. Limnol.， 2010， 28： 106-112

21 Li S， Xu J L， Chen J J， Zhou C X， Yan X J. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2014， 28（3）： 245-255

22 Zhu S， Ye M W， Xu J L， Guo C X， Zheng H K， Hu J B. J. Agric. Food Chem.， 2015， 63（37）： 8283-8291

23 Cole L K， Vance J E， Vance D E. BBAMolecular Cell Bio. Lipids， 2012， 1821（5）： 754-761

24 Vance J E， Tasseva G. BBAMolecular Cell Bio. Lipids， 2013， 1831（3）： 543-554

25 Corda D， Zizza P， Varone A. Biochem. Soc. Transac.， 2012， 40（1）： 101-107

26 WU QingHe， ROMG XiangLu， XING YanHong， LI ShuWen. Traditional Chinese Drug Research & Clinical Pharmacology， 2007， 18（6）： 434-437

吳清和， 榮向路， 邢燕紅， 李淑雯. 中藥新藥與臨床病理， 2007， 18（6）： 434-437

27 Reid B N， Ables G P， Otlivanchik O A， Schoiswohl G， Zechner R， Blaner W S. J. Biol. Chem.， 2008， 283（19）： 13087-13099

28 Yokota T， Nagashima M， Ghazizadeh M， Kawanami O. Life Sci.， 2009， 84（15）： 523-529

29 Tocher D R. Rev. Fish. Sci.， 2003， 11（2）： 107-184

30 Ganesan S， Shabits B N， Zaremberg V. Lipid insights， 2015， 8（Suppl 1）： 75