王曉飛+蔣守芳+張維冰+張凌怡+劉穎+杜曉妍+張潔+申河清

摘 要 大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）污染已成為嚴(yán)峻的環(huán)境問題，探究PM2.5的毒性效應(yīng)和機(jī)理變得尤為重要。本研究利用基于液相色譜/質(zhì)譜的代謝組學(xué)技術(shù)，分析經(jīng)PM2.5懸混液氣管滴注暴露后成年雄性大鼠睪丸代謝組的全局變化，采用偏最小二乘判別分析法和非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，PM2.5暴露組大鼠睪丸的油提和水提代謝指紋譜均可與對(duì)照組實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確區(qū)分，表明PM2.5暴露對(duì)大鼠睪丸的整體代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生了顯著影響，最終鑒定出56個(gè)差異代謝物。通路分析顯示，PM2.5暴露會(huì)引起大鼠睪丸的氨基酸和核苷酸代謝紊亂、類固醇激素代謝失衡以及脂類代謝異常，而這些重要通路可能是PM2.5生殖毒性的關(guān)鍵分子事件。

關(guān)鍵詞 代謝組學(xué)； 大氣細(xì)顆粒物； 睪丸； 生殖毒性； 液相色譜質(zhì)譜

1 引 言

隨著城市化進(jìn)程的推進(jìn)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，以細(xì)顆粒物（PM2.5）為主要成分的空氣污染已成為全國(guó)性的環(huán)境問題。PM2.5顆粒表面附著大量具有內(nèi)分泌和代謝干擾效應(yīng)的內(nèi)分泌干擾物（Endocrine disrupting chemicals，EDCs），如重金屬、多環(huán)芳烴、揮發(fā)性有機(jī)物等，而且固體顆粒本身也對(duì)機(jī)體的正常代謝存在顯著影響。PM2.5進(jìn)入呼吸道深部并沉積在末細(xì)支氣管和肺泡中，其中化學(xué)組分和細(xì)顆粒物進(jìn)入血液循環(huán)，可能通過干擾下丘腦垂體性腺軸的內(nèi)分泌和代謝通路從而影響生殖健康。美國(guó)環(huán)保署2009年發(fā)布的《關(guān)于顆粒物的綜合科學(xué)評(píng)估報(bào)告》指出暴露在濃度水平較高的空氣污染物中，未來生育能力會(huì)受到影響。已有研究表明，大氣顆粒物暴露引起生物體內(nèi)炎癥反應(yīng)和氧化脅迫，導(dǎo)致小鼠睪丸P450scc基因表達(dá)和血清睪酮水平顯著下降[1]，影響激素分泌相關(guān)通路[2，3]，并且大氣顆粒物污染可通過誘導(dǎo)生殖細(xì)胞DNA損傷、異常甲基化和內(nèi)分泌干擾影響動(dòng)物生殖器官發(fā)育，干擾睪丸類固醇激素合成與分泌，抑制精子發(fā)生，降低精子質(zhì)量[4～6]。此外，PM2.5還可干擾大鼠睪丸細(xì)胞周期進(jìn)程及引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而對(duì)其生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒害[7，8]。雖然目前的很多報(bào)道證明了PM2.5暴露對(duì)雄性生殖的影響，但是這些研究大部分停留在效應(yīng)層面，相關(guān)生殖毒性的分子機(jī)理尚不明確[9]。

鑒于PM2.5的組成非常復(fù)雜，闡明其毒性機(jī)制面臨巨大的挑戰(zhàn)，代謝組學(xué)技術(shù)為解決這一問題提供了強(qiáng)大的工具。代謝組學(xué)研究生物體低分子量代謝物的系統(tǒng)響應(yīng)，有助于從復(fù)雜的分子變化中識(shí)別出關(guān)鍵事件，而無需對(duì)毒性成分不確定的細(xì)顆粒物做明確的毒理學(xué)假設(shè)[10]。與基于假設(shè)的傳統(tǒng)毒理學(xué)不同，代謝組學(xué)基于高通量獲取的大數(shù)據(jù)篩選暴露效應(yīng)相關(guān)的標(biāo)志物，某些標(biāo)志物本身就是毒性機(jī)制中的關(guān)鍵分子，與其它標(biāo)志物結(jié)合通過進(jìn)一步的聚類分析可發(fā)現(xiàn)相關(guān)的重要毒性通路。目前，PM2.5暴露相關(guān)的代謝組學(xué)研究還較少，并且主要側(cè)重肺部毒性效應(yīng)的研究。 Chen等[11]利用脂質(zhì)組學(xué)的方法研究了PM2.5對(duì)大鼠肺部脂質(zhì)代謝的影響，發(fā)現(xiàn)一系列重要的脂類代謝物的合成和代謝通路發(fā)生了顯著變化。本研究組也利用代謝組學(xué)技術(shù)探討了PM2.5對(duì)A549肺上皮細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，大量的氨基酸代謝、TCA循環(huán)和能量代謝相關(guān)小分子代謝物的表達(dá)發(fā)生了顯著變化[12]。

上述研究表明，代謝組學(xué)技術(shù)在揭示PM2.5毒性分子機(jī)理方面巨大的應(yīng)用潛力。本研究針對(duì)PM2.5暴露組和對(duì)照組大鼠的睪丸代謝輪廓進(jìn)行研究，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析方法篩選出差異性顯著的代謝物并加以鑒定，結(jié)合相關(guān)代謝通路對(duì)PM2.5的睪丸毒性機(jī)理進(jìn)行了研究。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Q Exactive質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）；大氣顆粒物采樣儀（中國(guó)武漢天虹公司）；石英纖維濾膜（英國(guó)Whatman公司）。甲醇和異丙醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；實(shí)驗(yàn)用水由MilliQ超純水系統(tǒng)制備；甲酸（質(zhì)譜純，百靈威J&K公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 PM2.5的收集和懸浮液制備 PM2.5的采樣地點(diǎn)為唐山市中心的華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院二樓樓頂，采樣時(shí)間為2014年11月至2015年5月（污染最嚴(yán)重時(shí)期），濾膜在40℃避光保存。

將濾膜剪碎后放入超純水中，冰浴下超聲30 min，取出濾膜后，經(jīng)6層無菌紗布過濾，得到混懸液，上述提取過程重復(fù)一次，合并兩次所得混懸液，真空冷凍干燥得到PM2.5顆粒物。準(zhǔn)確稱取PM2.5顆粒物，加入生理鹽水超聲下配制混懸液。PM2.5暴露前滅菌并超聲振蕩使混懸液均勻。

2.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與染毒方法 SD成年雄性大鼠（體重為（200±20） g，2月齡）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成兩組，分別為PM2.5混懸液處理組和對(duì)照組，每組6只。飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，晝夜交替各為12 h，暴露期間大鼠可以自由攝取食物和水。暴露組采用氣管滴注的方式進(jìn)行染毒，每周染毒1次，連續(xù)染毒3個(gè)月，每周染毒容量為25 mg/kg。對(duì)照組采用生理鹽水進(jìn)行氣管滴注。

2.2.3 睪丸組織的收集和代謝物提取 （1）睪丸組織樣品收集 大鼠末次染毒24 h后，采用10%水合氯醛腹腔注射方法麻醉，快速分離睪丸，放入液氮急速冷凍后， 80℃保存。（2）水溶性和脂溶性代謝物提取步驟 ＼[13] 樣品在4℃下解凍。稱取100 mg解凍后的樣品，加入1.5 mL甲醇水（1∶1， V/V， 20℃預(yù)冷），勻漿，離心10 min（4℃，16000 g），上清液即為水提代謝物，上清液真空冷凍干燥。再向沉淀物中加入1.6 mL二氯甲烷甲醇（3∶1， V/V， 20℃預(yù)冷），勻漿，離心10 min（4℃，16000 g），有機(jī)相即為油提代謝物，通風(fēng)櫥內(nèi)揮干。 所有樣品先用200 μL甲醇水（1∶1， V/V）復(fù)溶，離心除去不溶物后再進(jìn)行檢測(cè)。（3）質(zhì)量控制（QC）樣品的制備 每個(gè)大鼠睪丸組織稱取等量混合均勻后，按照上述樣品處理過程處理，所得代謝提取物作為質(zhì)量控制樣品。

2.2.4 睪丸代謝提取物的LCMS條件 （1） 水提代謝物分析 Waters公司ACQUITY HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm i.d.， 1.7 μm，）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸的水溶液； 流動(dòng)相B為含有0.1%甲酸的甲醇。梯度洗脫：初始流動(dòng)相為0.1% B，保持2 min，6 min時(shí)升至25% B，10 min時(shí)升至80% B，12 min時(shí)升至90% B，21 min時(shí)升至99.9% B并保持2 min，隨后快速恢復(fù)初始0.1% B，并保持3 min。進(jìn)樣體積為5 μL；流速為400 μL/min；柱溫40℃。（2）油提代謝物分析 Waters公司ACQUITY BEH C8 色譜柱（100 mm ×2.1 mm i.d.， 1.7 μm）；流動(dòng)相C為0.1%甲酸溶液， 流動(dòng)相D為含0.1%甲酸的甲醇異丙醇（85∶15， V/V）溶液。梯度洗脫：初始流動(dòng)相為75% D，保持1 min，6 min時(shí)升至85% D并保持4 min，15 min時(shí)升至90% D并保持2 min，18 min時(shí)升至91% D并保持3 min，22 min時(shí)升至92% D并保持5 min，29 min時(shí)升至99.9% D并保持3 min，隨后快速恢復(fù)初始75% D并保持3 min。進(jìn)樣體積為5 μL；流速為400 μL/min；柱溫40℃。（3）電噴霧離子源（ESI） 分別采用正、負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，F(xiàn)ull MS分辨率70000，質(zhì)譜掃描范圍為m/z 100～1000。氮?dú)庾鳛檩d氣，正離子模式和負(fù)離子模式的噴針電壓分別設(shè)為3200和2800 V。對(duì)于水提代謝物：鞘氣流量45 L/min；輔助氣體積流量15 L/min；輔助氣溫度350℃；對(duì)于油提代謝物：鞘氣流量40 L/min；輔助氣體積流量10 L/min；輔助氣溫度320℃。每個(gè)樣品進(jìn)樣兩次，隨機(jī)進(jìn)樣，以便能消除人為或者儀器造成的系統(tǒng)誤差，QC樣品每隔6個(gè)樣品進(jìn)一次樣，F(xiàn)ull MS/ddMS2模式用于獲得標(biāo)志物的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，NCE設(shè)為30%。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理及代謝物鑒定 LCMS采集的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML格式，經(jīng)XCMS軟件處理后得到離子信息表，離子質(zhì)荷比窗口設(shè)為10 ppm，保留時(shí)間窗口設(shè)為40 s。所得數(shù)據(jù)經(jīng)過峰面積歸一化并刪除檢出率小于80%的離子峰，處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP（Version 11.0，Sweden），首先進(jìn)行主成分分析考察方法穩(wěn)定性（QC樣品聚合情況），然后進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLSDA），并通過SPSS軟件 （Version 18.0） 和MetaboAnalyst 3.0進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：VIP值（Variable importance in the projection）≥1； 變化倍數(shù)≥2（處理組vs對(duì)照組）； p<0.05（處理組vs對(duì)照組）。將滿足上述篩選條件的水提代謝物的精確分子量導(dǎo)入HMDB（http：//www.hmdb.ca）數(shù)據(jù)庫，質(zhì)量偏差≤30 ppm，同時(shí)結(jié)合代謝物的二級(jí)質(zhì)譜信息進(jìn)行鑒定。對(duì)于滿足上述篩選條件油提代謝物，將其二級(jí)質(zhì)譜信息導(dǎo)入LipidSearchTM軟件 （Thermo ScientificTM）進(jìn)行鑒定，搜索及鑒定參數(shù)設(shè)置如下：Type，Product；ExpType，LC；Precursor Tol，30 ppm， Grade=A or B。

3 結(jié)果與討論

3.1 代謝組學(xué)分析

理想的代謝組學(xué)分析要求盡可能獲得所有代謝物的信息。本研究分別在正、負(fù)離子模式下對(duì)大鼠睪丸組織的水提和油提代謝物進(jìn)行分析，以獲得綜合全面的代謝物信息。圖1為代謝物的代表性指紋譜。

樣品分析過程利用QC樣品檢驗(yàn)方法的可靠性及LCMS的穩(wěn)定性。采用PCA方法對(duì)樣品和QC樣品進(jìn)行模式識(shí)別，如圖1所示，QC樣品有很好的聚合度，說明本方法重復(fù)性好，儀器性能穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠，滿足代謝組學(xué)分析的要求。

偏最小二乘法判別分析（PLSDA）是代謝組學(xué)中常用的數(shù)據(jù)分析方法，可以在不降低模型的預(yù)測(cè)能力的前提下，有效減少模型的復(fù)雜性， 增強(qiáng)模型的解釋能力[14]。PLSDA分析（圖2）表明，在兩種代謝物提取方法和兩種離子掃描模式下，PM2.5處理組均能夠與對(duì)照組實(shí)現(xiàn)很好的聚類區(qū)分，說明PM2.5處理對(duì)大鼠睪丸的整體代謝產(chǎn)生了顯著影響。

處理過的離子信息表導(dǎo)入MetaboAnalyst 3.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（圖3），不同提取方式下代謝物在兩組間差異性，橫坐標(biāo)代表代謝物在兩組間的變化倍數(shù)的log2，縱坐標(biāo)代表代謝物在兩組間ttests的p值的log10。由圖3可見，PM2.5處理組與對(duì)照組大鼠的睪丸中存在大量顯著性差異的代謝物。根據(jù)變量的重要性，結(jié)合變化倍數(shù)及變量在兩組間的差異性，最終篩選出56個(gè)差異代謝物（表1），包括2個(gè)氨基酸代謝物、 6個(gè)核苷酸代謝物、 3個(gè)類固醇激素代謝物、 2個(gè)前列腺素、 3個(gè)溶血磷脂、 20個(gè)磷脂酰膽堿、7個(gè)磷脂酰乙醇胺、 5個(gè)鞘磷脂、2個(gè)甘油單酯、1個(gè)甘油二酯和5個(gè)甘油三酯。

3.2 PM2.5通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起核苷酸代謝紊亂

目前普遍接受的PM2.5暴露的毒性機(jī)理包括以下方面：PM2.5進(jìn)入人體后，會(huì)增加體內(nèi)的氧化應(yīng)激壓力，導(dǎo)致DNA損傷[15，16]、細(xì)胞和器官的功能異常[17，18]，同時(shí)造成炎癥因子的釋放[19，20]，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生或者加重。氧化脅迫是PM2.5暴露所引起的體內(nèi)主要反應(yīng)[12]，睪丸內(nèi)氧化應(yīng)激的增強(qiáng)會(huì)影響睪丸內(nèi)精子的產(chǎn)生和成熟[21]，并且核苷酸代謝紊亂被認(rèn)為與氧化應(yīng)激相關(guān)。6個(gè)與核苷酸代謝相關(guān)的代謝物在PM2.5處理組和對(duì)照組中產(chǎn)生了顯著變化（4個(gè)上升，2個(gè)下降），說明PM2.5暴露引起了大鼠睪丸內(nèi)核苷酸代謝的紊亂，這表明PM2.5很可能通過引起氧化應(yīng)激增強(qiáng)來干擾核苷酸代謝，并對(duì)大鼠睪丸正常生理功能產(chǎn)生損害。

3.3 PM2.5可引起類固醇激素及多種脂類的代謝異常

類固醇激素在促進(jìn)性腺發(fā)育與生殖控制方面起重要作用，PM2.5處理組大鼠睪丸中17羥孕酮（17Hydroxyprogesterone）、7雙烯醇酮（7Dehydropregnenolone）和二氫雄甾酮（Dihydroandrosterone）這3個(gè)與類固醇激素相關(guān)代謝物的水平明顯上升，這表明PM2.5可能會(huì)引起體內(nèi)類固醇激素合成代謝的紊亂。睪酮是雄性生殖調(diào)節(jié)過程中最重要的激素，二氫雄甾酮作為睪酮的代謝物，其表達(dá)在PM2.5處理組中明顯升高，表明PM2.5暴露加速了睪酮代謝，降低體內(nèi)的睪酮水平，因此會(huì)影響雄性大鼠生殖功能。暴露后，45個(gè)脂類代謝物發(fā)生了顯著變化，涉及到前列腺素（Prostaglandins）的生成與代謝、溶血磷脂（Lysophospholipid）代謝、磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine）代謝、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine）代謝、鞘磷脂（Sphingomyelin）代謝和甘油三酯代謝（Monoacylglyceride， diglycerideand triglyceride）。睪丸組織的脂類代謝在維持正常的雄性生殖功能方面也起到了非常重要的作用[22，23]，尤其是在細(xì)胞膜的流動(dòng)性保持、精子運(yùn)動(dòng)能力和維持精子形態(tài)等方面[24]。前列腺素含量變化已被證明能夠顯著影響雄性生殖能力，包括影響睪丸的發(fā)育，精子的生成及活性[25]。磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂做為生物膜的主要成分，在維持精子細(xì)胞膜完整和功能正常方面起到了重要作用[26]。而且甘油三酯代謝與精子生成供能密切相關(guān)[27]。這表明PM2.5暴露會(huì)造成大鼠睪丸內(nèi)脂類代謝紊亂，進(jìn)而可能會(huì)影響到大鼠睪丸的正常生理功能、精子生成及精子形態(tài)的正常，從而損害大鼠的生殖功能。

3.4 PM2.5會(huì)干擾色氨酸和亮氨酸的合成和代謝通路

作為生物體內(nèi)構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位，氨基酸參與了蛋白質(zhì)合成和能量代謝等多種生命活動(dòng)。2氨基2，4己二烯二酸（2Aminomuconic acid）和2羥基異己酸（Hydroxyisocaproic acid）分別是色氨酸和亮氨酸的代謝產(chǎn)物。與對(duì)照組相比，PM2.5處理組大鼠睪丸中色氨酸和亮氨酸的代謝水平顯著升高，這說明PM2.5暴露擾亂了睪丸中部分氨基酸的合成和代謝通路。

4 結(jié) 論

本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)PM2.5處理后大鼠睪丸組織的代謝指紋譜進(jìn)行了比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露對(duì)大鼠睪丸的整體代謝組產(chǎn)生了顯著影響，鑒定了56個(gè)差異顯著的代謝物，代謝通路分析表明PM2.5暴露會(huì)導(dǎo)致氨基酸和核苷酸代謝紊亂、類固醇激素代謝失衡以及脂類代謝異常。這些重要通路是PM2.5生殖毒性的關(guān)鍵分子事件，在此基礎(chǔ)上，綜合利用常規(guī)毒理學(xué)方法和基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，深入研究這些分子事件上下游的響應(yīng)機(jī)理，對(duì)于認(rèn)識(shí)大氣顆粒物的生殖毒性機(jī)制具有重要的意義。

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