朱奇凡，王德選，陳新新，莊捷秋，蔡暉

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

胞外組蛋白對腎小管細(xì)胞的損傷作用及其機(jī)制

朱奇凡，王德選，陳新新，莊捷秋，蔡暉

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

目的：探討細(xì)胞外組蛋白對腎小管細(xì)胞的損傷作用及其相關(guān)機(jī)制。方法：觀察不同濃度（0、50、100、200 μg/mL）組蛋白對腎小管細(xì)胞（Cos-7細(xì)胞）活性的影響；在100 μg/mL濃度的組蛋白作用0、12、24、48 h時分別收集Cos-7細(xì)胞，用Western blot法檢測T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白-1（TIM1）、天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶3（caspase3）和受體蛋白Toll樣受體2（TLR-2）表達(dá)的變化。結(jié)果：隨著組蛋白藥物濃度的增加，Cos-7細(xì)胞活性呈下降趨勢；100 μg/mL組蛋白作用于細(xì)胞，隨著作用時間的延長，細(xì)胞TIM1、caspase3、TLR-2的表達(dá)量均顯著升高。結(jié)論：胞外組蛋白對腎小管細(xì)胞存在損傷作用，其機(jī)制可能是通過TLR-2信號通路誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞外組蛋白；凋亡；TLR-2信號通路；腎小管

組蛋白是構(gòu)成細(xì)胞核染色質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)并參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。應(yīng)激狀態(tài)下，組蛋白可主動或被動地釋放到細(xì)胞外成為胞外組蛋白，通過下游途徑發(fā)揮其細(xì)胞毒性，對全身各器官系統(tǒng)造成損傷[1]。ALLAM等[2]對缺血再灌注誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型的研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞受損死亡時可釋放細(xì)胞外組蛋白，后者對腎血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞有直接毒性作用。臨床上許多病理狀態(tài)，例如膿毒血癥、自身免疫性疾病、外傷等，可表現(xiàn)急性腎損傷或永久性腎功能異常，同時血液中細(xì)胞外組蛋白濃度可明顯升高[3]，提示組蛋白可能參與腎損傷有關(guān)的病理過程。故本研究進(jìn)一步在細(xì)胞學(xué)水平探討胞外組蛋白對腎臟的損傷作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 非洲綠猴腎小管細(xì)胞（Cos-7）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。組蛋白（human histone 3）購自美國Sigma公司，CCK-8分析試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，單克隆兔抗T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白-1（T-cell immunoglobulin and mucindomain-containing molecules-1，TIM1）抗體和單克隆兔抗受體蛋白Toll樣受體2（Toll-like receptor-2，TLR-2）抗體購自美國Abcam公司，單克隆兔抗天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶3（cysteineaspartate-specific protease 3，caspase3）抗體購自美國Cell Signal Technology公司，單克隆小鼠抗Tubulin抗體購自美國Beyotime公司，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗和HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購自美國Jackson ImmunoResearch公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 不同濃度組蛋白對Cos-7細(xì)胞活性的影響

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：Cos-7細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為37 ℃，5% CO2及飽和濕度。每2 d更換培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法測定細(xì)胞活性：對數(shù)生長期Cos-7細(xì)胞，以4×104個細(xì)胞/每孔的密度重新接種于96孔板，培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁生長后，分別換成含0（等量0.9%氯化鈉溶液）、50、100、200 μg/mL濃度組蛋白的DMEM培養(yǎng)液，在組蛋白作用后0、12、24和48 h（每個時間點(diǎn)設(shè)5個復(fù)孔），每孔加入等量CCK-8溶液，不含細(xì)胞的孔作為空白對照。在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h（避光）。使用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度值（OD值），測定波長為450 nm。細(xì)胞活力（%）= [A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]× 100。A（加藥）：加有CCK-8溶液、細(xì)胞和藥物溶液的孔的吸光度。A（空白）：加有CCK-8溶液和培養(yǎng)基而沒有細(xì)胞的孔的吸光度。A（0加藥）：沒有藥物溶液，但加有細(xì)胞、CCK-8溶液的孔的吸光度。

1.3 組蛋白干預(yù)下Cos-7細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 取1× 104Cos-7細(xì)胞懸液分別接種于2盤6 cm培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁生長，再換成含組蛋白濃度為0（對照組）、100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞。干預(yù)12、24、48 h，在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4 Western blot測定細(xì)胞外組蛋白對Cos-7細(xì)胞凋亡蛋白及相關(guān)信號通路蛋白的影響 取1×104Cos-7細(xì)胞懸液分別接種于5盤6 cm培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)12 h，接著用含100 μg/mL組蛋白的DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞，分別在0、12、24、48 h時收集細(xì)胞。預(yù)冷PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，轉(zhuǎn)入EP管，加入RIPA細(xì)胞裂解液。置于冰上裂解30 min。12 000 r/min 4 ℃離心20 min，吸取上清液至另一離心管。取20 μL用作蛋白定量檢測，其余蛋白作變性處理。方法如下：用80 ℃水浴預(yù)熱1份5×Loading Buffer后，與4份蛋白樣品充分混勻，將混合物于37 ℃水浴30 min，以變性蛋白。10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳時，每孔加入40 μg蛋白樣品。濃縮膠電壓設(shè)定為80 mV，分離膠電壓升至120 mV。冰浴下100 V恒壓半干式轉(zhuǎn)膜（PVDF膜），根據(jù)蛋白分子量不同，轉(zhuǎn)膜時間50 min到90 min不等。依次孵育一抗（單克隆兔抗TIM1抗體1∶1 000；單克隆兔抗TLR-2抗體1∶1 000；單克隆兔抗caspase3抗體1∶1 000；單克隆小鼠抗Tubulin抗體3∶8 000，4 ℃搖床孵育過夜）、二抗（HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗1∶7 000；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗1∶7 000，水平搖床上室溫孵育90 min），ECL顯色。根據(jù)蛋白不同選擇相應(yīng)的曝光時間，使用凝膠圖像處理系統(tǒng)對目的條帶的分子量和凈光密度值進(jìn)行分析。以上所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0。定量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析；多重比較，方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett T3檢驗(yàn)；兩因素的分析采用析因分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測不同濃度組蛋白對Cos-7細(xì)胞活性的影響 結(jié)果顯示，對照組（0 μg/mL組）等量0.9%氯化鈉溶液干預(yù)0～48 h，細(xì)胞活性變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其他各組Cos-7細(xì)胞活性隨著組蛋白藥物濃度的增加而下降，同時隨著組蛋白作用時間的延長，細(xì)胞活性也呈下降趨勢。其中組蛋白100 μg/mL或200 μg/mL作用12、24、48 h后與同組0 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），在48 h時達(dá)到最低值（P＜0.01），見表1。

2.2 組蛋白干預(yù)下Cos-7細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 根據(jù)2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用100 μg/mL組蛋白對Cos-7細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理。結(jié)果顯示，對照組Cos-7細(xì)胞生長良好，48 h后細(xì)胞貼壁緊密，接觸生長后呈多邊形。100 μg/mL組蛋白干預(yù)組在12 h即發(fā)生明顯形態(tài)改變，分泌物增多，24 h后細(xì)胞形態(tài)變化更為明顯，細(xì)胞內(nèi)空泡較多，細(xì)胞體積縮小，不易貼壁，48 h細(xì)胞凋亡增多，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)，無法貼壁，漂浮于培養(yǎng)液中（見圖1）。

2.3 組蛋白不同作用時間對Cos-7細(xì)胞TIM1、caspase3、TLR-2表達(dá)量的影響 結(jié)果顯示，100 μg/mL組蛋白干預(yù)Cos-7細(xì)胞后，與組蛋白作用0 h組相比，12 h組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），48 h組的TIM1蛋白表達(dá)水平達(dá)到最高值（P＜0.05）；與組蛋白作用0 h組相比，隨組蛋白的作用時間延長，活化的caspase3蛋白表達(dá)水平緩慢升高，24 h前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，48 h組活化的caspase3蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；相比于0 h組，24 h組TLR-2蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），48 h組TLR-2蛋白水平達(dá)到高峰（P＜0.05），見表2。

表1 不同濃度組蛋白對Cos-7細(xì)胞活性的影響（n=3，，%）

表1 不同濃度組蛋白對Cos-7細(xì)胞活性的影響（n=3，，%）

與同濃度0 h組比：aP＜0.01；與同時間點(diǎn)0 μg/mL組比：bP＜0.01；交互作用cP＜0.01

組別 0 h 12 h 24 h 48 h F P 0 μg/mL 94.32±2.35 94.52±1.65 91.49±2.02 92.49±1.81 2.764 0.069 50 μg/mL 94.99±2.36 86.06±4.59ab83.68±4.11ab52.32±6.51ab101.457 ＜0.001 100 μg/mL 91.30±1.10 81.32±2.79ab58.83±6.68ab44.00±5.29ab160.520 ＜0.001 200 μg/mL 87.27±4.02b66.75±8.38ab43.78±7.95ab19.02±3.24ab126.658 ＜0.001 F 9.014 31.234 97.961 306.484 F=159.746，P＜0.001cP 0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 細(xì)胞外組蛋白對Cos-7細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）

表2 組蛋白不同作用時間對各指標(biāo)蛋白表達(dá)量的影響（n=4，）

表2 組蛋白不同作用時間對各指標(biāo)蛋白表達(dá)量的影響（n=4，）

與0 h組比：aP＜0.05

組別 TIM1/Tubulin cleaved-caspase3/ t-caspase3 TLR-2/Tubulin 0 h 0.15±0.03 1.80±0.94 0.38±0.02 12 h 0.15±0.05 2.35±0.93 0.42±0.04 24 h 0.19±0.05 2.43±1.09 0.52±0.07a48 h 0.26±0.07a3.68±0.92a0.67±0.05aF 3.913 8.201 28.195 P 0.037 0.049 ＜0.001

3 討論

作為真核生物染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)蛋白的組蛋白一旦釋出即成為胞外組蛋白，也是重要的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP）分子，具有細(xì)胞毒性和免疫刺激作用，從而損傷周圍正常組織[4]?，F(xiàn)有研究證實(shí)，胞外組蛋白對肺[5-6]、腎[7]、肝[8-10]均有損傷作用，此外還可能與炎癥[11-12]、腫瘤[13-14]的發(fā)生相關(guān)。目前，胞外組蛋白對呼吸、心血管系統(tǒng)等領(lǐng)域的損傷作用研究較多，但對于腎臟的研究較少。

體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，當(dāng)大鼠腎近端小管上皮損傷后，TIM1[又被命名為腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，KIM1）]的胞外域可以從細(xì)胞上脫落下來[15]，可溶性的KIM1可以在急性腎小管壞死的患者尿液中檢測到，從而成為近端腎小管損傷的一個敏感而特異的生物指標(biāo)[16]。本研究顯示隨著組蛋白作用時間的延長，細(xì)胞TIM1蛋白表達(dá)水平逐漸增加。提示組蛋白可引起腎小管細(xì)胞功能受損。

caspase3是細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要因子，通常以無活性的酶原形式存在，一旦在凋亡信號刺激下被激活，可對多種蛋白底物進(jìn)行降解，而它的活化則被認(rèn)為是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[17]。組蛋白干預(yù)后，我們發(fā)現(xiàn)腎小管細(xì)胞caspase3表達(dá)量遞增，證實(shí)組蛋白啟動了腎小管細(xì)胞的凋亡程序。提示在缺血再灌注、膿毒血癥等病理狀態(tài)下，如果胞外組蛋白細(xì)胞毒性因素持續(xù)存在，超越機(jī)體修復(fù)能力，可能影響腎小管的濃縮稀釋功能。

TLR是一類I型跨膜蛋白，胞外有富含亮氨酸的重復(fù)序列，其家族在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，識別微生物的病原體相關(guān)分子模式，以及先天性免疫過程中都起到了非常重要的作用，其中以TLR-2識別病原體及產(chǎn)物最多，因此被認(rèn)為是具中心作用的受體[18]。目前，大量的DAMP分子被證實(shí)是不同的TLR配體，包括線粒體DNA（TLR-9）、透明質(zhì)酸片段（TLR-2和TLR-4），以及熱休克蛋白（TLR-2和TLR-4）等[19]。而胞外組蛋白是重要的DAMP分子，ALLAM等也提出胞外組蛋白可以與TLR-2和TLR-4相作用，介導(dǎo)髓樣分化蛋白抗原88、核轉(zhuǎn)錄因子-KB和絲裂素活化蛋白激酶信號通路的激活，進(jìn)而分泌大量的炎性細(xì)胞因子[2]。我們的研究結(jié)果表明腎臟固有細(xì)胞在組蛋白的作用下出現(xiàn)類似的結(jié)果，即TLR-2蛋白升高，提示TLR-2信號通路參與了組蛋白誘發(fā)的腎小管細(xì)胞無菌性炎癥及凋亡。

另外本研究細(xì)胞活性檢測和形態(tài)學(xué)的觀察證實(shí)，胞外組蛋白作用于腎臟細(xì)胞后會引起細(xì)胞形態(tài)改變，不易貼壁甚至死亡，且隨著胞外組蛋白作用濃度的增加或作用時間的延長，細(xì)胞活性均呈下降趨勢，進(jìn)一步說明胞外組蛋白對腎臟細(xì)胞存在損傷作用。此外，結(jié)合腎小管細(xì)胞隨著組蛋白作用時間的延長，TIM1、caspase3以及TLR-2蛋白表達(dá)量均同步增加，我們推測胞外組蛋白可以通過TLR-2途徑，誘發(fā)caspase3級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)腎小管細(xì)胞凋亡。但TLR-2介導(dǎo)的下游通路較多，需要進(jìn)一步探究其中哪條通路在組蛋白引起的腎臟損傷作用中起到主要調(diào)控作用。將來還需要建立動物模型以及收集患者血液標(biāo)本，進(jìn)一步驗(yàn)證胞外組蛋白對腎臟的損傷作用，從而找到防治措施。

綜上所述，本研究在細(xì)胞學(xué)水平證實(shí)了胞外組蛋白對腎臟固有細(xì)胞存在損傷作用，TLR-2介導(dǎo)的caspase3凋亡信號通路在其中起到重要作用。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Damage effect of extracellular histones on renal tubular cells and the relating mechanism

ZHU Qifan,

WANG Dexuan, CHEN Xinxin, ZHUANG Jieqiu, CAI Hui. Department of Pediatrics Nephrology, the Second Af fi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To explore the damage effect of extracellular histones on the renal tubular cells (Cos-7 cell) and the relating mechanism. Methods: Cos-7 cells stimulated by different concentration (0, 50, 100, 200 μg/mL) of histones were observed. After treatment with histones (100 μg/mL), Cos-7 cells were collected to detect the expression of T-cell immunoglobulin and mucindomain-containing molecules-1 (TIM1), cysteine aspartate-speci fi c protease 3 (caspase3) and Toll-like receptor-2 (TLR-2) by Western blot at different time points (0, 12, 24, and 48 h). Results: The activity of the Cos-7 cells decreased with the increase of histones concentration. Under the same histones concentration, the expression of TIM1, cleaved-caspase3/t-caspase3 and TLR-2 increased with the stimulation time of the histones. Conclusion: Extracelluar histones induce the kidney injury, and the mechanism may be the induction of renal tubular cell apoptosis through TLR-2 signaling pathway.

extracellular histones; apoptosis; TLR-2 signaling pathway; kidney tubules

R725.7

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.003

2016-12-05

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目（81200513）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY17H050006）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017KY107）。

朱奇凡（1991-），女，浙江溫州人，碩士生。

蔡暉，教授，主任醫(yī)師，Email：hcai3@emory.edu。