木海琦，朱詩(shī)建，王帥彬，南存金，包云帆，陳映鶴

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬蒼南醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325800）

?臨 床 經(jīng) 驗(yàn)?

前列腺增生后不穩(wěn)定膀胱致逼尿肌肌聚糖表達(dá)變化

木海琦1，朱詩(shī)建2，王帥彬1，南存金1，包云帆1，陳映鶴1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬蒼南醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325800）

目的：探討良性前列腺增生（BPH）后不穩(wěn)定膀胱導(dǎo)致膀胱逼尿肌肌聚糖（SG）表達(dá)變化。方法：對(duì)BPH后穩(wěn)定膀胱組患者34例、BPH后不穩(wěn)定膀胱組患者26例，采用免疫組織化學(xué)染色法、Western blot法檢測(cè)膀胱壁逼尿肌中SG的α、β、γ 3種亞基蛋白表達(dá)情況，RT-PCR法檢測(cè)SG的α、β、γ 3種亞基mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：SG在BPH后不穩(wěn)定膀胱組的平均表達(dá)水平較穩(wěn)定膀胱組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。結(jié)論：BPH后膀胱逼尿肌不穩(wěn)定性可能與SG改變有關(guān)。

良性前列腺增生；不穩(wěn)定膀胱；肌聚糖

前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）后膀胱也發(fā)生相應(yīng)改變，出現(xiàn)逼尿肌結(jié)構(gòu)、功能及神經(jīng)支配的變化，引起膀胱不穩(wěn)定收縮，表現(xiàn)為尿頻、尿急、急迫性尿失禁等一系列癥狀[1]。肌聚糖（sarcoglycan，SG）是肌肉收縮相關(guān)的功能蛋白，既往研究[2-4]發(fā)現(xiàn)其與心肌、骨骼肌、血管平滑肌等功能變化相關(guān)。本課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)當(dāng)膀胱逼尿肌收縮力下降時(shí)，逼尿肌內(nèi)SG表達(dá)將出現(xiàn)顯著下降。本研究通過(guò)檢測(cè)膀胱逼尿肌SG表達(dá)，探討其在BPH所致不穩(wěn)定膀胱逼尿肌中發(fā)生的變化。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2014年6月至2015年4月因BPH住院手術(shù)的患者。根據(jù)尿動(dòng)力檢查中膀胱充盈時(shí)是否出現(xiàn)膀胱壓力≥1.47 kPa，且不能被主動(dòng)抑制的逼尿肌不自主收縮，將患者分為穩(wěn)定膀胱組（穩(wěn)定組）34例，年齡59～88歲，平均（71.23±5.24）歲；不穩(wěn)定膀胱組（不穩(wěn)定組）26例，年齡61～90歲，平均（73.17±6.31）歲。2組年齡無(wú)明顯差異且均無(wú)影響膀胱功能的疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 兔抗人α-SG單克隆抗體、鼠抗人β-SG單克隆抗體、兔抗人γ-SG多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；TrizolTM試劑盒購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；SYBR Green熒光染料購(gòu)自美國(guó)Roche公司；Prime-Script RT reagent Kit購(gòu)自日本Takara公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的收集與處理：2組患者均采取恥骨上前列腺摘除術(shù)，術(shù)中取膀胱前壁全層。剔除黏膜及其他組織后一份置入液氮保存，一份常規(guī)脫水透明后，石蠟包埋切片。

1.3.2 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)SG 3種亞型（α、β、γ）表達(dá)：按照試劑盒說(shuō)明書操作，切片常規(guī)脫蠟，枸櫞酸鹽修復(fù)，經(jīng)3% H2O2阻斷過(guò)氧化物酶活性及山羊血清封閉后，滴加按比例稀釋后的一抗，4 ℃過(guò)夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，鏡檢觀察。在光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野采集圖像，應(yīng)用Image Pro Plus軟件分析陽(yáng)性區(qū)域，計(jì)算積分密度值（IOD）來(lái)反映陽(yáng)性蛋白的強(qiáng)度或濃度。

1.3.3 Western blot法檢測(cè)SG 3種亞型表達(dá)：用含PMSF的蛋白裂解液提取組織中蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白煮沸變性后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗，4 ℃冰箱搖床過(guò)夜，加入相應(yīng)二抗，ECL化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。Bio-Rad Quantity軟件分析測(cè)定其區(qū)帶的吸光度，GAPDH為內(nèi)參，目的片段與GAPDH的吸光度比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.3.4 RT-PCR法檢測(cè)SG 3種亞型mRNA表達(dá)：組織塊解凍后置于1 mL Trizol抽提試劑中充分裂解，在抽提時(shí)加入200 μL氯仿，并采用預(yù)冷處理后75%乙醇洗滌RNA沉淀，溶于DEPC水中，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。根?jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min；42 ℃ 60 min；52 ℃15 min；70 ℃ 15 min；終止反應(yīng)，所得cDNA溶液置冰中5 min后-20 ℃保存。由上海基康公司設(shè)計(jì)合成引物，使用SYBR GreenI RT PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min后，95 ℃ 10 s；60 ℃ 10 s；72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。數(shù)據(jù)采用表示，2組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SG 3種亞型免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 SG蛋白免疫陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，主要位于細(xì)胞漿，光鏡下可見與膀胱逼尿肌細(xì)胞走向一致。與穩(wěn)定組相比，不穩(wěn)定組中棕黃色陽(yáng)性染色比例均升高，表明該組膀胱壁中的SG 3種亞型（α、β、γ）蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1和表1。2.2 SG 3種亞型Western blot檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)Western blot半定量檢測(cè)SG表達(dá)量，與穩(wěn)定組相比，不穩(wěn)定組中SG 3種亞型（α、β、γ）表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 SG 3種亞型（α、β、γ）在膀胱組織中的表達(dá)情況（×400）

表1 SG蛋白在不同組中的IOD（）

表1 SG蛋白在不同組中的IOD（）

與穩(wěn)定組比：aP＜0.05

組別 例數(shù) α-SG β-SG γ-SG穩(wěn)定組 34 192.37±34.92 261.48±48.78 104.05±30.66不穩(wěn)定組 26 525.16±58.37a593.28±49.98a442.31±39.82a

圖2 SG 3種亞型表達(dá)情況

2.3 SG 3種亞型mRNA表達(dá)情況 經(jīng)RT-PCR儀擴(kuò)增，不穩(wěn)定組SG 3種亞型的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.32±0.45、2.02±0.39、2.57±0.74；穩(wěn)定組分別為0.79±0.26、0.52±0.12、1.21±0.53，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

BPH是引起中老年男性排尿功能障礙最為常見的良性疾病之一，其中不穩(wěn)定膀胱是其重要的病理生理改變[1]。1987年國(guó)際尿控學(xué)會(huì)（International Continence Society，ICS）將不穩(wěn)定膀胱定義為在膀胱充盈時(shí)出現(xiàn)自發(fā)或被誘發(fā)的膀胱壓力大于或等于1.47 kPa且不能被主動(dòng)抑制的膀胱逼尿肌不自主收縮[6]。有52%～80% BPH患者出現(xiàn)不穩(wěn)定膀胱表現(xiàn)。但目前對(duì)不穩(wěn)定膀胱的病因機(jī)制尚無(wú)定論，治療效果并不理想。膀胱是一種順應(yīng)性良好的空腔器官，在充盈和排空時(shí)膀胱壁能夠自我調(diào)節(jié)伸展、重構(gòu)以適應(yīng)膀胱容量的改變，而不引起明顯的膀胱內(nèi)壓改變。當(dāng)BPH后引起膀胱不穩(wěn)定收縮時(shí)，膀胱的一系列生物力學(xué)特征就發(fā)生了改變，這一過(guò)程包括了很多中間環(huán)節(jié)，如膽堿能神經(jīng)超敏化、腎上腺受體改變等，其中逼尿肌本身是一重要的改變因素[7]。

在骨骼肌及心肌的肌膜上存在著抗肌萎縮相關(guān)蛋白復(fù)合體，稱為DGC復(fù)合體，該復(fù)合體為一種跨膜復(fù)合體，能將單個(gè)肌細(xì)胞通過(guò)“肌絲相互滑動(dòng)”產(chǎn)生的力傳遞到細(xì)胞外基質(zhì)，整合后形成肌肉收縮[8-9]。而SG是DGC復(fù)合體的主要成分之一，是一種黏附分子，能維持肌膜組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及Ca2+平衡[10]。ANASTASI等[11]在胃腸道等組織器官中發(fā)現(xiàn)了SG，泌尿系器官均屬于平滑肌器官，理論上也應(yīng)該存在該蛋白。ARENA等[12]研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性膀胱輸尿管反流可能與SG過(guò)表達(dá)后平滑肌功能亢進(jìn)相關(guān)，但具體機(jī)制尚待明確。我們前期通過(guò)建立雄兔膀胱出口梗阻模型，當(dāng)梗阻達(dá)到一定時(shí)間后，逼尿肌中β、γ-SG蛋白表達(dá)下降[13]，而人BPH后造成膀胱收縮力的下降同樣與該蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)SG上調(diào)可能與逼尿肌不穩(wěn)定相關(guān)。膀胱逼尿肌組織與胃腸道等平滑肌一樣，其收縮主要依賴于細(xì)胞漿中Ca2+與粗肌絲中肌球蛋白結(jié)合而觸發(fā)[14]，而SG具有維持Ca2+平衡的作用。因此我們推測(cè)這種改變?nèi)菀讓?dǎo)致不穩(wěn)定膀胱的發(fā)生，其可能的機(jī)制是：隨著SG表達(dá)上調(diào)，膜外的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)增多，引起細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)中Ca2+進(jìn)一步釋放，從而導(dǎo)致膀胱逼尿肌細(xì)胞具有更高的興奮性，從而引起不穩(wěn)定收縮，導(dǎo)致患者尿頻、尿急以及急迫性尿失禁等臨床癥狀。但具體通過(guò)何種方式相聯(lián)系，尚需更深一步研究加以明確。

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（本文編輯：趙翠翠）

The expression change of sarcoglycan in the detrusor muscle of unstable bladder caused by benign prostatic hyperplasia

MU Haiqi1, ZHU Shijian2, WANG Shuaibin1, NAN Cunjin1, BAO Yunfan1, CHEN Yinghe1.

1.Department of Urology, the Second Af fi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Urology, Cangnan Hospital Af fi liated to Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325800

Objective: To study the expression change of sarcoglycan (SG) in the detrusor muscle of the unstable bladder caused by benign prostatic hyperplasia (BPH). Methods: 34 cases of stable bladder and 26 cases of unstable bladder were included in this study. The expressions of α-SG, β-SG, γ-SG in detrusor muscle of bladder were detected by immunohistochemical technique Western-blot and RT-PCR. Results: Compared to the group of stable bladder, the expression of SG in detrusor muscle of unstable bladder caused by BPH was increased (P＜0.05). Conclusion: The changes of SG in the detrusor muscle of bladder may closely related to the production of unstable bladder caused by BPH.

benign prostatic hyperplasia; unstable bladde; sarcoglycan

R69

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.011

2016-06-13

溫州市公益性科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20150219）。

木海琦（1982-），男，浙江溫州人，主治醫(yī)師，碩士。

陳映鶴，主任醫(yī)師，Email：chenyh@wzhealth.com。